鳳岡鋅硒茶茶多酚提取工藝優化及其體外活性研究

王緒英，朱淼，李欣燃

（六盤水師范學院生物科學與技術學院，貴州 六盤水 553004）

茶多酚是茶葉中具有豐富生物活性的化合物之一，不僅對人體健康具有重要的保護作用，而且能夠提升動物的免疫力和抗病能力［1］。研究發現，低中濃度的硒存在時，增加鋅濃度有利于茶葉中茶多酚、氨基酸、可溶性糖、黃酮和咖啡堿等主要化學品成分含量的提高［2］。李（Li）等［3］發現補硒能夠促進茶葉的次級代謝，從而增加茶多酚的含量。森特科斯卡（Sentkowska）和皮辛斯卡（Pyrzynska）［4］發現硒和茶多酚具有協同抗氧化作用。以上研究表明，鋅、硒元素能夠有效促進茶多酚的富集，同時提升生物活性。茶多酚作為茶葉主要的活性物質，不僅具有良好的抗氧化［5］、抗菌和抗病毒作用［6］，并且還具有調節動物腸道菌群［7］，促進飼料利用率的作用［8］，已有報道說明鋅和硒是飼料中重要的微量元素添加劑，能夠改善飼喂動物的產肉性能［9,10］。因其能夠提升動物的免疫力和抗病能力，已被廣泛應用于動物生產過程。因此，茶多酚的提取方法和得率成為研究的熱點之一。

在過去的研究中，已有許多關于茶葉中茶多酚提取的文章，其中涵蓋了不同品種茶葉以及不同提取方法的實驗結果。在張媛婷等［11］的研究中，他們通過超聲輔助正交實驗，在綠茶中提取茶多酚，得到的提取率為19.68%。馬小雨等［12］利用響應面優化微波輔助技術，在綠茶中提取茶多酚的得率達到了25.65%。都昌樂等［13］通過超聲波輔助正交實驗，在桐城小花茶中提取茶多酚，得率為15.62%。陳仕學等［14］則采用浸提輔助正交實驗，在石阡黑茶中提取茶多酚，得率為10.06%。從以上實驗結果可以看出，不同茶葉品種之間存在顯著差異，這就導致了茶多酚的提取方法和得率也有所不同。

貴州省鳳岡縣所出產的鳳岡鋅硒茶，因其富含鋅、硒兩種元素而得名，其中鋅、硒的含量分別能達到40~100 mg/kg 和0.25~3.50 mg/kg［15］，是當地的國家地理標志產品。須要指出的是，目前尚無對鳳岡鋅硒茶茶多酚提取優化的相關研究，又鑒于鳳岡鋅硒茶中富含鋅、硒元素，有必要對其主要的天然化學成分及其生物活性進行深入分析。本研究采用超聲輔助的方式，通過響應面法，對鳳岡鋅硒茶中茶多酚提取工藝條件進行優化，并通過體外實驗，考察茶多酚的抗氧化活性以及降血糖和血脂的功效，為鳳岡鋅硒茶茶多酚的進一步開發利用提供技術參考及科學依據。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與儀器

材料：鳳岡鋅硒茶，購自貴州黔福茗茶茶葉有限責任公司；硫酸亞鐵（≥99.5%）、甘氨膽酸鈉水合物（≥98.0%）、酒石酸鉀鈉（≥99%）、磷酸二氫鉀（≥99%）、?；悄懰徕c（≥97.0%）、沒食子酸標準品（≥99%）、氫氧化鈉（≥98.5%），均購置于生工生物工程（上海）股份有限公司；透析袋MD34 7000 Da、胃蛋白酶1∶3000、胰蛋白酶1∶250，均購置于北京索萊寶股份有限公司。

儀器：超聲波儀（SB-800DT，寧波新芝），電子分析天平（AUW120D，島津），中藥粉碎機（DFT-200，海新諾）、烘箱（HH-2A，上海博迅），紫外分光光度計（UV-2100，北京東西分析），離心機（TD5，湖南赫西），搖床（WHA-S，鉑溫儀器）。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建標準曲線

試驗通過酒石酸亞鐵顯色法測定茶多酚含量［16］。其標準曲線制作方法如下：首先，配置濃度為0.5 mg/mL 的對照品溶液。用電子分析天平稱取0.125 0 g 沒食子酸對照品，添加蒸餾水定容至250 mL，獲得對照品溶液。然后，取對照品溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL 依次加入2 mL 酒石酸亞鐵溶液，再依次加入磷酸鹽緩沖液補齊至10 mL，混勻放置10 min，然后在紫外分光光度計波長為540 nm處進行檢測。最后，擬合出標準曲線y=14.514 x-0.024 4（R2=0.997 8）。

1.2.2 單因素試驗

取鳳岡鋅硒茶茶葉于烘箱中，40℃時烘至恒重，粉碎后過40目篩備用。依次考察超聲提取時間（min）、料液比（g/mL）及乙醇體積分數（%）三個單因素試驗條件對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響。首先，維持料液比1∶90（g/mL）、乙醇體積分數60%不變，將超聲波儀超聲時間（min）依次設置為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，以考察超聲時間對茶多酚得率的影響；其次，維持超聲時間50 min、料液比1∶90（g/mL）不變，檢測乙醇體積分數依次為30%、40%、50%、60%、70%、80%時，鳳岡鋅硒茶茶多酚得率；再次，設定超聲提取時間為50 min，乙醇體積分數為60%時，依次考察料液比（g/mL）為1∶60 g/mL、1∶70 g/mL、1∶80 g/mL、1∶90 g/mL、1∶100 g/mL、1∶110 g/mL 時，對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響。茶多酚得率計算方法如下：

式中：D 表示茶多酚得率（%）；表示提取液中茶多酚的質量（g）；表示鋅硒茶干粉質量（g）。

1.2.3 響應面法優化設計

選取鳳岡鋅硒茶茶多酚得率為響應值，根據單因素試驗結果，選取A-乙醇體積分數、B-提取時間和C-料液比為三個自變量，構建三因素三水平響應面分析試驗。試驗條件設計如表1所示。

表1 響應面各因素試驗條件設計

1.2.4 抗氧化活性檢測

根據響應面實驗結果，得到鳳岡鋅硒茶茶多酚提取最優工藝。將提取液梯度稀釋為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL 和1.6 mg/mL，以抗壞血酸為對照，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除試驗［17］和羥自由基的清除試驗［18,19］進行抗氧化活性檢測。

1.2.5 鳳岡鋅硒茶茶多酚葡萄糖透析延遲指數分析

取10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL和80 μg/mL各1 mL葡萄糖標準品，置于冰上，依次加入10 mL 蒽酮硫酸試劑，制成樣液。然后放入沸水中煮沸7 min后取出，立即置于冰水中，冷卻后于紫外分光光度計波長為620 nm 處，測定各管吸光度值并構建標準曲線［20］。

在1 支干凈的試管中加入1 mL 樣液，再向試管中加入10 mL100 mmol/L 葡萄糖，置于搖床，37℃時震蕩1 h，然后倒入透析袋中，將透析袋放入裝有去離子水的杯中繼續振蕩，模擬腸道吸收情況，每20 min 取杯中液體進行葡萄糖含量檢測。同時取另一只透析袋，添加等量的100 mmol/L葡萄糖作為對照。葡萄糖含量檢測公式如下：

式中：GDRI為鳳岡鋅硒茶茶多酚的透析延遲指數（%）；為樣品組杯中液體含有的葡萄糖濃度（g/L）；為對照組杯中液體含有的葡萄糖濃度（g/L）。

1.2.6 鳳岡鋅硒茶茶多酚對兩種膽酸鹽的結合能力

分別在6 支試管中依次添加0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L、0.3 mmol/L 各1mL 的?；悄懰徕c標準溶液，再分別加入10 mL60%，制成樣液。在70 ℃水浴鍋中反應40 min，取出冷卻后，于紫外分光光度計波長為387 nm處，測量各管吸光度值，制作標準曲線［21］。

?；悄懰徕c結合力檢測：取1 mL 樣液與3 mL10 g/L 胃蛋白酶于1 支干凈試管中混合成樣品，添加1 mL0.01 mol/L HCl 調節pH，置于搖床，37 ℃時震蕩1 h，再次添加0.01 mol/L HCl 將樣液pH 調整為6.3。向樣品中添加4 mL10 g/L 胰蛋白酶，繼續置于搖床，37 ℃時震蕩1 h。取出后，向其中加入4 mL 0.5 mmol/L?；悄懰徕c，再次放置搖床，37 ℃時震蕩1 h，使之充分結合。將樣品取出后置于4 000 最高轉速（rpm）離心機上離心10 min，并按上述標準曲線測定方法進行測定。

甘氨膽酸鈉結合力檢測方法同上。

兩種膽酸鹽結合力檢測公式如下：

式中：R 為鳳岡鋅硒茶茶多酚對膽酸鹽結合能力（%）；為膽酸鹽的加入量（mmol）；為膽酸鹽的剩余量（mmol）。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響

考察超聲提取時間對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響。結果如圖1所示。

圖1 提取時間對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響

由圖1 可知，提取液中的鳳岡鋅硒茶茶多酚含量，先隨著提取時間的延長而逐漸增加，當提取時間達到50 min 時，鳳岡鋅硒茶茶多酚得率達到最大。但提取時間進一步增加時，鳳岡鋅硒茶茶多酚含量不增反降?？赡苁怯捎跁r間過長，導致鳳岡鋅硒茶所含有的其他物質溶出，降低了茶多酚的比率?？梢娫?0 min 時，茶多酚全部溶出，所以選擇提取時間為50 min 時進行優化試驗。

2.1.2 料液比對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響

考察料液比對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響。結果如圖2所示。

圖2 料液比對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響

由圖2 可知，提取液中的茶多酚含量隨著料液比增加而逐漸增加，當達到1∶90（g/mL）時，茶多酚得率趨勢基本不變，說明在料液比為1∶90（g/mL）時，鳳岡鋅硒茶茶多酚已全部析出，其得率達到最大。綜合考慮回收成本，因此選擇料液比為1∶90（g/mL）時進行優化試驗。

2.1.3 乙醇體積分數對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響

考察乙醇體積分數對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響。結果如圖3所示。

圖3 乙醇體積分數對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響

由圖3可知，當乙醇濃度逐漸增加時，鳳岡鋅硒茶茶多酚含量也逐漸增加，其體積分數為60%時，鳳岡鋅硒茶茶多酚得率最大；當濃度進一步升高時，茶多酚得率又逐步降低。這可能是由于此濃度（60%）下的有機溶劑和鋅硒茶茶多酚的極性相近，隨著乙醇濃度的不斷增加，雜質增多，干擾因素也隨之增多，導致酚類化合物析出量減少。因此選擇在乙醇濃度為60%左右進行優化試驗。

2.2 響應面法結果

2.1.1 回歸模型的建立與分析

博克斯-本肯（Box-Behnken）實驗設計方案是一種優化的響應面法，在考察相同數量的條件因子時，這種實驗方案能夠顯著降低所要分析的因子組合數量，減少實驗次數。本研究以鳳岡鋅硒茶茶多酚得率為響應值，采用Design-Expert 8.06軟件設計Box-Behnken 實驗方案，分析三因素三水平響應面試驗。具體結果如表2所示。

表2 博克斯-本肯（Box-Behnken）試驗設計與結果

乙醇體積分數、提取時間以及料液比三個因素對鋅硒茶茶多酚得率影響大小分別為：B>C>A，即：時間>料液比>乙醇體積分數。得到各因素對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率擬合回歸方程如下：

Y=-61.796 25+0.304 13A+0.737 63B+1.057 75C+6.250 00×AB+8.000 00×AC-2.350 00×BC-3.512 50×-5.262 50×-5.387 50×

對上述結果作方差分析，結果如表3所示。

表3 方差分析

由表3 可以看出，試驗模型<0.000 1，失擬誤差=0.494 3，說明該模型具有較好擬合程度。

2.2.2 回歸模型響應面分析

依據響應面試驗所得數據，進行回歸擬合后，得到如圖4 所示的鳳岡鋅硒茶茶多酚得率響應面圖。

圖4 各交互因素對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率的影響

圖4a和圖4b響應面坡度變化均較平和緩慢，表明這些因素的交互作用對鳳岡鋅硒茶茶多酚提取影響較弱。而圖4c響應面坡度較為陡峭，說明時間和料液比的交互作用對鳳岡鋅硒茶茶多酚得率影響較大。

2.2.3 工藝驗證

根據以上結果，得到鳳岡鋅硒茶茶多酚提取最佳方案為乙醇體積分數58.65%、提取時間53.53 min、料液比1∶91.17（g/mL），茶多酚得率為14.79%。為方便操作，將鳳岡鋅硒茶茶多酚提取工藝進行優化，即：乙醇體積分數調整為59%、超聲提取時間調整為54min、料液比調整為1∶91（g/mL）。并進行3次生物學平行試驗，最終茶多酚平均得率為14.88%，與預測值的相對標準偏差為0.61%。

2.2.4 抗氧化活性檢測結果

考察鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物和抗壞血酸對DPPH清除率，結果如圖5所示。

圖5 鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物和抗壞血酸對DPPH清除率

由圖5 可知，鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物與抗壞血酸對DPPH 清除率隨濃度增加而增大，且略高于抗壞血酸，茶多酚提取物的I為0.87 mg/mL。

考察鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物和抗壞血酸對羥自由基清除率，結果如圖6所示。

圖6 鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物和抗壞血酸對羥自由基清除率

由圖6 可知，鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物對羥自由基清除率略高于抗壞血酸，且隨濃度增加而增大，茶多酚提取物的I為0.45 mg/mL。

可見，鋅硒茶茶多酚具有較好的抗氧化活性。

2.2.5 葡萄糖透析延遲指數

該指標可用于間接反映腸道吸收過程的延遲情況。鳳岡鋅硒茶茶多酚對葡萄糖延遲吸收的能力如圖7所示。

圖7 鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物對葡萄糖的透析延遲能力

由圖7可知，葡萄糖透析20 min時，鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物對葡萄糖延遲吸收能力（46.50±6.18）%顯著高于葡萄糖透析40 min（23.48±5.86）%和60 min（14.39±3.17）%。延遲指數的降低可能與透析時間有關。鳳岡鋅硒茶茶多酚對葡萄糖的吸收能力隨著時間延長而產生飽和狀態，從而達到動態平衡。

2.2.6 膽酸鹽結合能力

膽汁酸由肝臟分泌，通常以甘氨酸和?；撬幔w積比3∶1）的形式存在，可促進脂溶性物質的水解，降低膽酸鹽含量，可作為降血脂的參考指標。鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物對膽酸鹽的結合能力如圖8所示。

圖8 鳳岡鋅硒茶茶多酚提取物對膽酸鹽的結合能力

如圖8 所示的試驗結果表明，鳳岡鋅硒茶茶多酚對?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉均具有一定的結合能力，分別為16.38±3.53%和27.69±6.38%，可初步證實茶多酚具有一定的體外降脂活性。

3 結論

通過對鳳岡鋅硒茶茶多酚提取工藝優化及體外活性的初步研究，表明其具有較好的抗氧化活性、延遲葡萄糖吸收能力以及膽酸鹽結合能力。通過響應面輔助優化法來探索鳳岡鋅硒茶中茶多酚的提取條件，最終得到其最佳提取率為14.88%。這項研究將為鳳岡鋅硒茶中茶多酚的優化提供新的思路和方法，并為進一步開展茶葉中茶多酚的研究，以及開發利用茶葉中的生物活性物質提供重要的依據。

研究結果可作為一種更為經濟和環保的方法，全面促進鳳岡鋅硒茶茶多酚資源化利用，同時為其在動物生產過程中的深入開發與應用提供參考。后續可將提取的茶多酚作為飼料添加劑，進一步進行動物實驗研究，以便該研究結果可以在動物生產實際應用中發揮更大作用。