芬頓反應在化學動力學治療中的應用

陳 艷，鄭芷葉，歐陽溢凡，魏鼎泰，艾克拜爾·熱合曼*

（1.寧德師范學院 醫學院，福建 寧德 352100；2.福州大學 化學學院，福建 福州 350108；3.寧德師范學院附屬寧德市醫院 放射科，福建 寧德 352100；4.福建省毒物與藥物毒理學重點實驗室，福建 寧德 352100）

癌癥是全球主要的公共衛生問題，人們投入了大量的物力和財力來開發新的腫瘤治療方法，但癌癥的復雜性、多樣性和異質性導致臨床效果有限.因此，為了提高患者的治療效果，需要更多的癌癥治療方式來補充現有的治療方法.癌細胞是從人體正常細胞發展而來，用常規的化療藥物對其進行選擇性治療是很困難的.據報道，腫瘤微環境（tumor microenvironment,TME）具有偏酸性、過氧化氫酶活性過高、谷胱甘肽濃度過高和缺氧等特性[1]11.TME這種特殊性不僅為腫瘤轉移提供了良好的環境，而且對高效選擇性治療癌癥提供了可能性.在過去的幾十年間，人們構建了大量基于TME 的響應型納米藥物遞送體系，但低負載效率和高泄漏風險在一定程度上限制了臨床治療效果.2016 年，Bu 和Zhang 課題組[2]首次提出化學動力學療法（chemodynamic therapy，CDT），與傳統的腫瘤治療方法不同，CDT 是利用腫瘤特殊的微環境，如弱酸性、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和H2O2過表達等，以過渡金屬納米材料為催化劑，發生芬頓或類芬頓反應產生羥基自由基，用于腫瘤特異性治療.

在傳統的芬頓反應中，Fe2+與H2O2可生成高活性的羥基自由基(Fe2++H2O2→Fe3++?OH).羥基自由基相比于其他種類的活性氧自由基[E(1O2/H2O)=2.17 V，E(H2O2/H2O)=1.78 V]，具有最高的氧化還原電勢E(?OH/H2O)=2.8 V[3-4].除了鐵，其他一些金屬（如Cu、Mn、Co 等）也可以作為芬頓反應試劑，發生類芬頓反應產生羥基自由基[1]11.芬頓及類芬頓反應的效率低是限制CDT 在活體治療應用的最大阻礙.在復雜的活體實驗中，導致芬頓反應效率低的原因有：1）H2O2的量不足.盡管腫瘤部位的H2O2含量高于正常組織，但H2O2的量仍不足以產生足夠多的羥基自由基殺死癌細胞.2）腫瘤微環境的弱酸性.腫瘤微環境的pH 可能不是芬頓及類芬頓反應的最佳反應pH 值.3）還原性物質含量過高（如GSH、H2S 等）.還原性物質會中和羥基自由基，降低治療效果.4）反應催化劑效率低.金屬的催化活性、靶向位點游離金屬的含量，及高催化活性金屬離子的循環利用率都會制約CDT的效果[5-6].針對這些問題，可以通過優化芬頓及類芬頓反應催化劑體系、調節腫瘤微環境、增強催化劑效率和協同治療的方法提高CDT的治療效率.

1.芬頓及類芬頓反應催化劑

1.1 鐵基芬頓反應催化劑

目前，研究最廣泛的芬頓反應催化劑仍然是鐵基材料.Fe3O4納米粒子具有很好的生物活性和pH 響應性，是芬頓反應中最常用的鐵基催化劑.然而，傳統的Fe3O4納米催化劑在酸性腫瘤微環境中的響應性能較低，會制約?OH 的產生效率.針對這一問題，Zhang 等[7]開發了一種非晶態鐵納米顆粒（AFeNPs），與傳統的Fe3O4納米顆粒相比，AFeNPs 對腫瘤酸性環境的反應更加靈敏和快速.在pH=5.4 和pH=6.5 條件下，6 h內亞鐵離子的釋放量分別達到100%和57%，而在中性pH條件下幾乎沒有釋放.由于亞鐵離子的快速酸響應釋放，AFeNPs表現出良好的?OH生成能力.

除了無機材料外，金屬有機骨架材料由于其多孔結構和優異的催化性能，被廣泛應用于CDT[8-9].Zheng 等[10]利用p53（一種腫瘤抑制蛋白和轉錄因子）的氧化應激調節能力和MOFs 的芬頓反應誘導能力，將鐵-聚苯酚聚合物（mental-organic network,MON）包裹在p53質粒表面（MON-p53），通過鐵死亡/凋亡混合途徑徹底清除癌細胞.p53 蛋白具有誘導細胞凋亡的功能，可抑制細胞內活性氧自由基的消除；鐵-聚苯酚聚合物在癌細胞內會誘導發生芬頓反應產生活性氧自由基，二者協同作用導致生物膜的脂質過氧化而引發氧化應激觸發鐵死亡.長期活體實驗證明，MON-p53治療不僅可以抑制腫瘤的生長，還可以延長荷瘤小鼠的壽命.MON-p53 用于癌癥腫瘤治療的原理如圖1 所示.圖1 中，I 表示MON-p53 被細胞內吞；II 為MON 引發芬頓反應（Fenton Reaction）；III 表示p53 蛋白的轉染和表達；IV 指跨膜蛋白被抑制；V 為芬頓反應導致脂質過氧化物（lipid peroxidation，LPO）含量升高，同時跨膜蛋白抑制導致GSH含量降低，最終導致細胞鐵死亡.

1.2 銅基類芬頓反應催化劑

傳統的鐵基芬頓反應通常發生在較窄且較低的pH范圍內（pH=2.5～4.5），而腫瘤微環境一般為弱酸性條件（pH=6.0～6.7），腫瘤的酸性條件無法滿足高效芬頓反應的要求，因而治療效果有限.據報道，基于銅基催化劑的類芬頓反應可以在弱酸性和中性介質中高效發生，其最高反應速率（1×104mol·L-1·s-1）比Fe2+提高了約160倍[11-12].Hu等[13]制備了一種超小聚乙二醇修飾的Cu2-xS納米點，可在較寬的pH范圍內實現H2O2向?OH 的轉化.Cu2-xS 納米點相比于其他鐵基催化劑表現出了更好的催化性能.Chen 等[14]合成了一種牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）修飾的黃銅礦納米顆粒（BSA-CuFeS2NPs），其發生的類芬頓反應不依賴于pH值，可在腫瘤微環境中高效生成羥基自由基.

除此之外，利用耐藥癌細胞中高水平、相對脆弱，但動態平衡的細胞氧化還原穩態，Liu 等[15]設計合成了一種納米銅-兒茶酚金屬有機框架材料（copper/catechol-based metal-organic framework,CuHPT），能夠有效打亂這種平衡，使平衡向氧化應激傾斜，最終殺死癌細胞.在耐藥癌細胞中GSH 的作用下，CuHPT會發生分解，同時釋放出兒茶酚配體和還原性亞銅離子（Cu+）.經過二者的協同作用，通過自氧化和類芬頓反應來放大耐藥癌細胞內活性氧自由基的產生.活體實驗證明，CuHPT 可有效抑制體內耐藥性腫瘤的生長，并使荷瘤小鼠的存活時間加倍.CuHPT用于耐藥性腫瘤細胞治療的原理如圖2所示.圖2中，a 為不同類型細胞的氧化還原穩態；b 為破壞細胞氧化還原穩態的策略；c 為CuHPT 的制備及其對耐藥癌細胞的抗腫瘤機制.c 圖中，①為CuHPT 將細胞GSH 氧化為GSSG，同時釋放HPT 和Cu+;②為HPT產生H2O2提高細胞ROS水平;③為Cu+將H2O2分解為產生致命的?OH.

圖2 CuHPT用于耐藥性腫瘤細胞的治療的原理[15]

在人體中，銅是許多天然酶氧化還原反應的輔助因子.通常來說，大多數生物活性銅都連接在蛋白質和其他配體上，過量的游離銅可能引起嚴重的全身毒性[16-17].因此，要實現銅基類芬頓反應的CDT 應用，重要的是將銅離子限制在腫瘤細胞內，避免在體內循環中出現游離銅離子[18-19].

1.3 其他金屬類芬頓反應催化劑

在類芬頓反應中，錳基、鈷基、銀基和過渡金屬基納米催化劑也被用于CDT[20-23].Wang 等[24]報道了一種基于Mn2+的多功能納米平臺H-MnCO3/Ce6-PEG（HMCP NCs），通過CDT 和光動力學治療（photodynamic therapy,PDT）的協同作用，實現癌癥腫瘤的治療.在腫瘤微酸條件下，MnCO3分解釋放出Mn2+，通過類芬頓反應催化內源性H2O2生成?OH.同時，光敏劑Ce6在光照射下產生高濃度的1O2.最終，CDT 和PDT的協同作用導致細胞內氧化壓力增加，殺死癌細胞.錳基催化劑HMCP NCs的制備過程和CDT、PDT的協同治療原理如圖3所示.圖3中，I表示在外部激光照射下，Ce6可以通過多步光化學過程產生單線態氧(1O2)，應用于PDT；II 表明，MnCO3可以在酸性TME 中特異性降解為Mn2+，觸發類芬頓反應，將內源性H2O2轉化為羥基自由基(?OH).可見，雖然這些類芬頓反應催化劑在體內和體外治療中都顯示出很好的效果，但仍存在一些挑戰，如毒性和生物安全性等.

圖3 錳基催化劑HMCP NCs的制備過程（a）和CDT、PDT協同治療的原理（b）[24]

2 增強CDT的治療效果

CDT 已被廣泛應用于腫瘤治療，但由于芬頓反應條件惡劣、反應效率有限、生理環境復雜等因素，其在體內的進一步應用仍受到限制[25].目前已報道了多種改進策略以提高芬頓反應在CDT 中的治療效率.

2.1 調節腫瘤微環境

由于芬頓反應發生在腫瘤部位，腫瘤微環境直接影響羥基自由基的生成效率，因此可以通過調節腫瘤微環境來提高CDT療效.

傳統鐵基芬頓反應的反應速率與環境中H+的濃度密切相關，在較低的pH（pH=2.5～4.5）條件下，鐵基芬頓反應更有效[26].然而，腫瘤微環境pH值在6.5左右，不利于鐵基芬頓反應的高效發生[27].據報道，葡萄糖氧化酶GOx可以消耗葡萄糖和氧氣生成葡萄糖酸和H2O2，利用這個反應可以同時提高腫瘤微環境中的H2O2水平和酸度[28].此外，Chen等[29]報道了一種納米復合材料會對癌細胞產生劇烈的氧化損傷同時抑制腫瘤轉移.在非晶態鐵納米粒子（AFeNPs）中負載碳酸酐酶IX（carbon anhydrase IX,CAI）抑制劑，構建了納米復合材料（AFeNPs@CAI）.抑制腫瘤細胞中的CAI 會增加H+濃度，進而通過芬頓反應加速?OH的生成，從而誘導腫瘤細胞死亡.同時，細胞外H+的生成減少會阻礙腫瘤細胞外基質的降解，進而抑制腫瘤的轉移.同樣，Shi 等[30]設計了一種納米催化劑（FePt@FeOx@TAM-PEG），通過控制調節腫瘤部位的酸性來增強CDT的效率.借助他莫西芬（tamoxifen,TAM）藥物的pH 響應特性，FePt@FeOx 的催化活性在酸性微環境中“開啟”.藥物TAM 一旦進入癌細胞，會抑制線粒體復合體，導致腫瘤中H+的積累，進而提高芬頓反應的催化效率，具體如圖4所示.

圖4 酸響應納米催化劑(FePt@FeOx@TAM-PEG)提高芬頓反應催化效率的示意圖[30]

由圖4 可見，藥物TAM 的pH 值響應性使FePt@FeOx 的催化活性在酸性腫瘤環境中激活，在中性條件下被抑制.釋放的TAM 能夠抑制線粒體復合體活性，導致乳酸含量升高，從而使細胞內H+積累，進而克服腫瘤本身酸度不足的問題.通過正反饋回路，大量的活性FePt@FeOx 納米催化劑被釋放出來，接觸到內源性H2O2，在酸性條件下發生類芬頓反應產生羥基自由基（·OH）.

腫瘤組織中H2O2含量不足也是限制芬頓反應效率的一個重要因素[31].因此,，可以通過增加腫瘤部位H2O2含量來提高芬頓反應效率[32].雖然，在納米材料中直接負載H2O2是提高CDT 效率的有效方法，但在遞送過程中，H2O2的泄漏可能會造成嚴重的組織損傷[33-34].因此，解決這個問題的合理選擇是開發一種方法，即通過腫瘤的特異性觸發H2O2的生成.Fan 等[35]在過表達呼吸鏈酶II（NDH-2）重組大腸桿菌（E.coli）MG1655 表面連接Fe3O4納米顆粒，形成一體化生物反應器（Ec-pE@MNP）.在大腸桿菌MG1655 呼吸過程中，NDH-2可以將NADH中的電子轉移到O2中，產生H2O2.此外，Ec-pE@MNP 定植在腫瘤中可以保證Fe3O4納米顆粒在腫瘤中有充足的積累.因此，Ec-pE@MNP 可以釋放大量?OH 殺死腫瘤細胞，而無需在腫瘤區域引入額外的H2O2.外源性金屬基芬頓納米催化劑不可避免地對人體造成慢性和急性損傷.2020 年8 月，Lin 等[36]使用ROOH 作為芬頓反應的高效劑，利用細胞內活性鐵池（labile iron pool，LIP）作為內生催化劑產生自由基.在Fe2+存在條件下，R'OOH表現出與H2O2相當的自由基生成能力.此外，與H2O2相比，GSH/谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）更難清除R'OOH.在這個研究中，一種pH 響應聚合物被用于同時遞送亞油酸甲酯過氧化氫（methyl linoleate hydroperoxide，MLH，一種R'OOH模型分子）和愛拉斯?。╡rastin，Era，一種鐵死亡誘導劑），為實現高效CDT 和緩解外源性金屬基納米催化劑造成的不利影響提供了一種新策略.內源性鐵池介導的芬頓反應在癌癥化學動力學治療中的具體應用情況如圖5 所示.圖5（a）中，R'OOH 在Fe2+存在條件下發生芬頓反應生成自由基，同時在硫醇生物大分子或酶作用下被還原.相比于H2O2、R'OOR'和內過氧化物，R'OOH 的CDT效率最高.圖5（b）為攜帶MLH和Era的納米治療試劑增強CDT效率的示意圖.

圖5 內源性鐵池介導的芬頓反應在癌癥化學動力學治療中的應用[36]

GSH 表達水平高是腫瘤微環境的另一個特征，GSH 表達水平通常與腫瘤部位高氧化環境相平衡.CDT會產生大量的?OH來打破這種平衡，但同時高水平的GSH會抑制?OH的氧化[37].Ma等[19]利用銅離子和半胱氨酸（cysteine，Cys）自組裝形成的納米平臺（Cu-Cys NPs），實現了增強的CDT并用于治療耐藥乳腺癌.Cu-Cys NPs 合成工藝示意圖和含銅納米制劑介導CDT 療法的原理如圖6 所示.由圖6 可見，Cu-Cys NPs被腫瘤細胞內吞后，首先將過表達的GSH氧化為GSSH，同時將Cu2+還原為具有較高的催化活性Cu+；隨后，Cu+催化H2O2通過類芬頓反應產生具有強氧化性的?OH，導致腫瘤細胞死亡.此外，由于腫瘤部位GSH和H2O2含量較高，Cu-Cys NPs可在腫瘤細胞中引發閉環氧化還原反應.

圖6 Cu-Cys NPs合成工藝示意圖和含銅納米制劑介導CDT療法的原理[19]

2.2 增強催化效率

金屬基納米催化劑催化效率低也是影響CDT 效率的重要因素.由于金屬離子在催化過程中容易通過氧化還原過程改變價態，不同價態的金屬離子催化效率不同.通常情況下，較穩定價態的催化活性低于亞穩價態.因此，將金屬離子保持在亞穩態（Fe2+、Cu+等）有利于提高芬頓反應的催化效率，達到更好的CDT 治療效果.Zhang 等[38]通過將葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）封裝在沸石型骨架（ZIF-8）中，然后被單寧酸（tannic acid，TA）和Fe3+構成的金屬多酚網絡（etal polyphenol network，MPN）包裹，設計合成了ATP 響應的芬頓納米平臺（GOx@ZIF@MPN）（圖7）.圖7 中，A 是GOx@ZIF@MPN 的制備過程；B 為GOx@ZIF@MPN 進入腫瘤細胞后，消耗葡萄糖、自供H2O2和加速Fe(III)/Fe(II)轉化的詳細過程.從圖7 可見，在ATP 過表達的腫瘤組織中，GOx@ZIF@MPN 降解釋放Fe3+、TA 和內部的GOx.GOx可與葡萄糖原位生成H2O2，同時TA 可將催化效率低的Fe3+轉化為催化效率高的Fe2+，通過持續生成H2O2和Fe2+，放大芬頓反應效率.體內實驗結果表明，自催化芬頓納米系統具有良好的抗腫瘤效果，為實現高效CDT 治療腫瘤提供了新的策略.另外一種增強催化效率的改進策略是增加催化劑含量.2023年，Liu等[39]合成了一種含鐵的類蛋白超分子鐵遞送系統用于鐵死亡腫瘤治療，這種超分子中鐵的質量分數高達42%，遠遠高于鐵蛋白.在GSH過表達的腫瘤微環境中，這種超分子會分解，同時消耗GSH并釋放Fe2+，實現增強的CDT治療效果.

圖7 自催化芬頓納米體系GOx@ZIF@MPN用于腫瘤治療的原理[38]

2.3 協同治療

CDT在癌癥治療中還可以結合其他治療方式來提高整體治療效果，其他治療方式包括化療（chemotherapty，CT）、光熱治療（photothermal therapy，PTT）、PDT、饑餓治療（starvation therapy，ST）和免疫治療等[40-43].研究表明，局部提高腫瘤組織的溫度可加速芬頓反應生成?OH的能力[44]，通過光熱效應增加的局部溫度可以同時實現PTT 和增強的CDT.Wang 等[45]構建了反鐵磁性黃鐵礦聚乙二醇（FeS2-PEG）納米立方體，利用腫瘤中過量的過氧化物實現CDT.在近紅外光照射下，FeS2-PEG 會局部產生熱量，這不僅實現了PTT，而且增強了CDT 的治療效果.在酸性條件下，FeS2-PEG 催化分解H2O2產生有毒的?OH.當溫度升高到318 K時，可以檢測到更強的?OH信號，這表明溫度升高確實提高了?OH的生成效率.

3 結論與展望

在傳統的癌癥治療中，化療是臨床最常用的方法.然而，副作用大和耐藥性的產生最終可能會導致治療失敗.近10年來，基于CDT的癌癥治療研究受到越來越多的關注.本文總結了芬頓及類芬頓反應催化劑體系及各種提高CDT 效率的策略，包括調節腫瘤微環境、增強催化劑效率及協同治療等.盡管CDT在動物實驗中的基礎研究顯示出良好的腫瘤生長抑制作用，但對CDT的相關研究仍處于早期階段.CDT試劑的開發需要充分考慮特異性、選擇性、效率、可降解性、響應性、遞送性、靶向性和生物安全性等.下一代CDT 試劑研究除了考慮治療效果以外，還應當側重安全性、對人體的毒理和病理學研究，這將大大提高CDT 的臨床轉化潛力.CDT 納米制劑的不斷創新和發展，以及對后續測試條件的優化和改進，將為未來癌癥的全面治療提供新的方向和希望.