耐高溫和耐低溫固體復合菌劑對牛糞堆肥的影響

岳世林,馬曉勇,姜國均

(河北農業大學 動物醫學院,河北 保定 071000)

堆肥處理是養殖場處置糞便最普遍方式,具有處理成本低、能殺滅病原菌、有效降解有機污染物等優點,在我國河北、內蒙古等省區應用廣泛[1]。但北方地區秋冬季節氣溫偏低,導致堆肥發酵慢、效率低,在低溫條件下將牛糞順利堆肥是一個亟待解決的關鍵問題[2]。牛糞中的纖維素、木質素等難降解物質主要在高溫期進行分解,但由于溫度過高,大部分微生物無法生存,因此解決高溫期微生物存活也具有重要意義。本試驗將篩選出耐高溫和耐低溫菌添加到牛糞中,研究低溫下兩者結合對牛糞堆肥發酵的影響。

1 材料與方法

1.1 牛糞

經過干濕分離含水率為60%的新鮮牛糞,由河北農業大學試驗牛場提供。

1.2 耐高溫和耐低溫菌

本試驗從牛糞堆肥過程的高溫和低溫期初選出耐高溫和耐低溫菌種,通過菌株鑒定、淀粉水解、纖維素降解、蛋白質水解和拮抗試驗,最終篩選出8株細菌。耐高溫菌為嗜熱鏈球菌和地衣芽孢桿菌P8-B2,耐低溫菌包括地衣芽孢桿菌DSM13、地衣芽孢桿菌MRPDSCV17203、巨大芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌AYYT-1、蠟狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。各種細菌生長到對數期80%時,置4 ℃保存備用。

1.3 復合菌劑制備

將干燥細麩皮和細鋸末高壓滅菌,取400 g加入100 g葡萄糖與耐高溫菌混合,記為X1;取細麩皮和細鋸末1 200 g,加入300 g葡萄糖與耐低溫菌混合,記為X2。將葡萄糖作為發酵引物,用適量蒸餾水與固體基質混合均勻,含水量為60%,分別在培養箱中培養24 h,耐高溫菌55 ℃培養,耐低溫菌25 ℃培養。將混合好的固體取出,在烘箱中以25 ℃和55 ℃進行烘干,將含水量為0%的X1和X2在常溫下混合均勻,固體復合菌劑制備完成。

1.4 堆肥及樣品采集

2020年12月進行堆肥處理,堆肥期22 d。堆肥當天記錄為第1天,定時取樣,理化指標采樣時間為第0、5、10、15、20天,試驗組設為T組,對照組設為C組。高通量測序采樣時間為堆肥初期(T1、C1)、升溫期(T2、C2)、高溫期(T3、C3)、降溫期(T4、C4)和腐熟期(T5、C5)5個時期,試驗組、對照組和每一個堆肥時期均做3個重復;從堆體四個角和中心部位(15、30、45 cm)處分別取樣,將同時期不同部位的樣品均勻混合,一部分-20 ℃保存用于理化指標檢測,另一部分-80 ℃保存,用于高通量測序分析物種組成和各階段優勢微生物。

T組:固體復合菌劑與牛糞混合均勻,取約170 kg牛糞進行堆肥,菌劑接種量約為0.94%;C組:添加等量細麩皮、細鋸末和葡萄糖與牛糞混合均勻。

1.5 理化指標測定

試驗期每天在9:00和17:00各測量1次,測量所有取樣點求平均值作為當天的堆溫并測量室溫;pH采用pH計測量;含水率采用105 ℃烘干法進行測定;總有機碳和全氮測定參考國家標準GB13193-91和農業行業標準NYT 297-1995;有機質測定為有機碳×1.724;全磷和全鉀測定參考農業行業標準NYT 298-1995、NYT 299-1995;種子發數指數(GI)參照王雪的方法測定[3]。每項指標分別重復3次測定。

1.6 數據預處理

采用T-test進行顯著性分析,顯著性分析采用SPSS軟件,柱狀圖和折線圖采用GraphPad軟件,稀釋曲線、物種組成及優勢微生物分析采用軟件QIIME2。

1.7 物種組成及優勢微生物

采用派森諾生物有限公司(上海)Illumina平臺Miseq進行16S rRNA測序。通過上機檢測得到各樣本有效數據分析物種組成和優勢菌群。

2 結果與分析

2.1 理化指標

2.1.1 溫度 由圖1可見,堆肥過程需要22 d,兩組堆肥溫度變化趨勢基本一致,先升高后降低。T組和C組第1天堆溫分別為28.3和21.0 ℃;T組溫度快速上升,比C組提前兩天到達高溫階段,第5天進入高溫期溫度為55.3 ℃,第8天達到堆肥最高溫59.7 ℃,高溫階段持續7 d;C組第7天溫度為55.3 ℃,第9天達到最高溫56.3 ℃,高溫階段持續5 d,基本符合我國《糞便無害化衛生標準(GB7959-87)》。表明添加復合菌劑可以迅速啟動堆肥初始溫度,提高堆肥最高溫并延長高溫時間。

圖1 堆肥過程中溫度的變化

2.1.2 pH 由圖2可見,本次堆肥中pH先升高再降低。初始pH在8.0左右,隨著堆肥過程的進行,第5天試驗組pH與對照組相比顯著升高(P<0.05),其他時間段試驗組與對照組均無顯著行差異。pH第10天達到最大值,隨后pH一直下降,在結束時降到最低值,維持在8.0～8.5之間。

圖2 堆肥過程中pH的變化

2.1.3 含水率 由圖3可見,堆肥初始含水率均約60.0%,2組堆肥含水率變化趨勢基本一致。堆肥結束時,C組含水率下降了18.4%,T組最終下降了24%,第5、10、15天2組差異顯著。表明在牛糞堆肥過程中,添加該復合菌劑可促進水分揮發。

圖3 堆肥過程中含水率的變化

2.1.4 碳氮比 由圖4可見,堆肥過程中C/N變化規律是一直下降,初始牛糞C/N無顯著性差異,第5、10、15天時,試驗組相比對照組顯著降低(P<0.01),第20天無顯著差異,本次試驗初始C/N值C組和T組分別為32.0和32.4,堆肥結束時C組和T組C/N值分別為16.4和15.1。表明添加菌劑后堆肥C/N下降更快。

圖4 堆肥過程中C/N的變化

2.1.5 有機質 由圖5可見,堆肥過程有機質含量呈緩慢減少趨勢。第0天、20天時,T組相比C組無顯著性差異,第5天、10天時T組相比C組極顯著降低(P<0.01),第15天T組相比C組顯著降低(P<0.05)。C和T初始含量分別為682.3、682.5 g/kg,最終含量分別為567.7、559 g/kg,分別下降了114.6、123.5 g/kg,早期堆肥牛糞中所含的大量易分解的有機物迅速分解下降快。

圖5 堆肥過程中有機質的變化

2.1.6 全磷 由圖6可見,堆肥過程中全磷含量呈上升趨勢。第0～5天T組相比C組無顯著性差異,第10天T組相比C組顯著升高(P<0.05),第15天、20天時T組相比C組無顯著性差異。C組和T組初始含量分別為54.4、55.3 g/kg,最終含量分別為63.1、66.1 g/kg。表明在堆肥過程中,添加菌劑可提高總磷含量。

圖6 堆肥過程中全磷的變化

2.1.7 全鉀 由圖7可見,堆肥過程中全鉀含量呈上升趨勢。所有時間段T組相比C組均無顯著性差異。C組和T組初始含量為7.4 g/kg,最終含量分別為11.0、11.6 g/kg。表明在堆肥過程中添加菌劑對總鉀含量影響不大。

圖7 堆肥過程中全鉀的變化

2.1.8 種子發芽指數(GI) 由圖8可見,堆肥過程中GI呈上升趨勢。第0天和20天時T組相比C組無顯著性差異,第5天和15天T組相比C組顯著升高(P<0.05),第10天時T組相比C組極顯著升高(P<0.01)。C組和T組初始GI分別26%和26.3%,最終GI分別為88.2%和92.7%,第0～10天兩組上升幅度最大,說明高溫期對GI起關鍵作用,堆肥結束時兩組的GI均已超過80%,可視為該牛糞已無植物毒性或者牛糞已經腐熟。

圖8 堆肥過程中GI的變化

2.2 高通量測序分析

2.2.1 稀釋曲線 由圖9可見,C1和T1曲線最低,依次逐漸升高,最高的是C5和T5。表明本次試驗的測序量達到符合反映本次試驗中牛糞菌群的多樣性組成水平。

圖9 Alpha指數稀疏曲線

2.2.2 物種組成及優勢微生物 由圖10可見,C組和T組門水平牛糞堆肥樣品中物種組成及優勢微生物。共檢出31個門,本圖僅顯示豐度最高前10個。物種組成主要包括:變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌(Actinobacteria)、綠灣菌門(Chloroflexi)、Thermi、柔膜菌門(Tenericutes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)。各種菌群多樣性在C組和T組的變化規律基本一致,但是豐度占比有很大差異。Proteobacteria是兩組各階段的優勢微生物,占比均為58.0%相差不大;Bacteroidetes存在各階段,但是高溫期的豐度占比最高,C3和T3豐度分別為32.5%和35.5%;Firmicutes在堆肥結束幾乎不存在,為堆肥初期(C1、T1)和升溫期(C2、T2)優勢微生物,C1、T1、C2、T2豐度分別為17.9%、24.4%、13.0%、14.4%;Actinobacteria是初期、降溫期(C4、T4)和腐熟期(C5、T5)優勢微生物,豐度占比均為8.0%左右相差很小;Chloroflexi是降溫期和腐熟期優勢微生物,C4、T4、C5、T5豐度分別為11.2%、12%、13.3%、20.3%。試驗表明加入復合菌劑會改變細菌生長繁殖情況,改變各菌種在不同堆肥階段豐度占比,增加優勢微生物數量。

圖10 門水平物種組成

由圖11可見,C組和T組屬水平牛糞堆肥樣品中物種組成及優勢微生物。共檢出41個屬,本圖僅顯示豐度最高前10個。物種組成主要包括:其他菌(Others)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、放線菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、魯氏絲狀桿菌(Ruminofilibacter)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、棲海面菌屬(Aequorivita)、藤黃色單胞菌屬(Luteimonas)、B-42和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)。除了Others占比最高外,Pseudomonas升溫期的優勢微生物,C2和T2豐度分別為22.0%和23.0%;Acinetobacter、Psychrobacter和Corynebacterium是初期的優勢微生物,C1和T1豐度分別為10.1%、23.4%、17.0%、15.0%、4.9%和5.2%;Cellvibrio是高溫期的優勢微生物豐度為T3 6.0%和C3 5.0%;Ruminofilibacter降溫期和腐熟期的優勢微生物,豐度由1.0%上升至C5中3.7%,由7.0%上升至T5中10.0%;藤黃色單胞菌屬(Luteimonas)和B-42在各組各階段占比很小,但依然可以看出是高溫期及降溫期的優勢微生物。試驗說明,在堆肥前加入復合菌劑會改變各種微生物在堆肥不同時期的豐度占比,優勢微生物數量增加。

圖11 屬水平物種組成

3 討 論

在冬季進行牛糞堆肥,添加復合菌劑的試驗組與對照組相比,堆溫迅速升高,高溫期持續時間延長,C/N、含水率、有機質含量下降快,GI上升,尤其是GI明顯提高,隨著堆肥反應的進行,牛糞堆肥堆體 TP、TK含量均呈上升趨勢,這主要由于牛糞進行堆肥過程中,有機C、有機N 和有機P均被微生物同化吸收及異化分解,但對K元素吸收利用率很低,微生物對有機C、N、P的需求高于對有機K的需求,K元素在堆肥過程中基本無損耗,添加微生物沒有顯著改變,而微生物對有機C的需求高于對有機N的需求,也高于對有機P的需求,一般需求比例為 C:N:P=100:5:1[4],在堆肥降解過程中有機C的降解速率高于有機N,高于有機P,導致堆肥過程中有機P的損耗率低于有機C和有機N,所以牛糞堆肥堆體TP含量均呈上升趨勢,添加復合菌劑后變化趨勢一致,可以顯著降低C/N,因此TP含量顯著升高[5];各菌群豐度變化明顯。大多數的研究都是將耐高溫菌或耐低溫菌其中一類菌添加在牛糞中驗證堆肥效果,很少有研究將二者放在一起制成復合菌劑,分析對堆肥發酵的影響。本試驗通過將耐高溫菌和耐低溫菌混合制備固體復合菌劑添加在牛糞中,在冬季進行堆肥發酵,即驗證制備的菌劑在冬季的堆肥效果。事實上微生物代謝是堆肥性質變化的根本原因[6],微生物通過代謝有機物來釋放能量和養分,從而促進堆肥的成熟,堆肥的成熟反過來促使微生物生長和繁殖[7],Jusoh等[8]研究結果表示接種菌劑有利于堆肥礦化作用,縮短堆肥腐熟時間5～8 d,劉陽等[9]研究表明,添加耐低溫復合細菌可以有效促進堆肥在低溫條件下的溫度升高,并加速高溫時期的開始,周伏忠等[10]通過添加自研的耐高溫微生物制劑來發酵雞糞生產有機肥料,獲得了良好的結果,與本試驗結果基本一致,說明添加耐低溫菌和耐高溫菌對堆肥發酵有促進作用。本試驗篩選的細菌只有一株是鏈球菌,其余幾株均為芽孢桿菌,與Jing等[11]研究結果基本一致,研究發現芽孢桿菌是原始堆肥高溫期的主要優勢菌,可能與芽孢桿菌耐高溫和耐低溫的生長特性有關,也可以在低溫環境良好生長,同時由高通量測序分析高溫期的優勢微生物是Bacteroidetes,與本試驗篩選的菌基本相符,芽孢桿菌屬,可以延長高溫堆肥時間,對指導微生物菌劑在堆肥中應用和進一步提高堆肥效率具有重要意義[12]。嗜熱鏈球菌是一株高產胞外多糖的發酵菌株[13],常做為酸奶的發酵劑之一,被廣泛的應用于發酵乳制品加工當中[14],而在工業發酵中研究較少,本試驗在牛糞堆肥發酵高溫期中篩選到該菌,并發現對糞便中纖維素有一定的降解作用,因此可以繼續研究該菌在堆肥發酵中的作用。本試驗中篩選到耐高溫菌2株,可繼續進行篩選,耐低溫菌可以從多個環境中篩選,如直接從凍土中篩選,但能否在堆肥過程中存在,與牛糞中固有菌是否互利共生,還需要更進一步的研究。

4 結 論

本研究表明,添加佐劑成功制備耐高溫和耐低溫堆肥發酵固體微生物復合菌劑,縮短了堆肥時間,提高了堆肥效率和有機肥品質。堆肥溫度和微生物數量是堆肥成功的關鍵。