從品種特性到功能基因組:雙峰駝基因組學研究進展

明 亮,Tuyatsetseg Jambal,吉日木圖*

駱駝是荒漠、半荒漠地區特有的畜種,是當地農牧民極為重要的奶源、肉源及交通工具,素來有“沙漠之舟”美稱[1]。駱駝屬于駱駝科動物,起源可追溯到始新世時期(3500萬年前)的北美洲,包括駱駝屬、羊駝屬和小羊駝屬[2]。駱駝屬包括雙峰駝(Bactrian camel)和單峰駝(Dromedary),其中雙峰駝主要分布在亞洲中部和東部的沙漠或干旱、寒冷地區;早在4500年前在伊朗北部和土庫曼斯坦南部地區被馴化[3]。單峰駝主要分布在阿拉伯、印度及北非等較為炎熱的地帶;大約在5000年前在阿拉伯地區被馴化[4]。羊駝屬和小羊駝屬的原產地為南美洲,其特點是無駝峰,也稱為無峰駝或羊駝、駱馬[5]。駱駝科動物的生物學分類及其分布地區見圖1。世界上駱駝屬唯一幸存的野生物種-野生雙峰駝(Wild two-humped camel),目前僅存1000峰左右[6-7]。2002年,野生雙峰駝被國際動物保護同盟(IUCN)提升為極瀕危物種,同大熊貓一樣珍貴。

圖1 駱駝科動物的生物學分類

1 雙峰駝分布及品種分類

雙峰駝被列為蒙古民族的“草原五畜”之一,是最能適應沙漠極端氣候的大型哺乳動物之一。雙峰駝善于行走在茫茫無際的沙漠中,是古代絲綢之路上最適合、最主要的運輸工具,被譽為連接東西方文化的“橋梁”,也成為了古絲綢之路的不朽象征[8]。雙峰駝分布廣泛,廣闊的沙漠、半沙漠和荒漠草原都是雙峰駝適合的生存環境。由于地理分7布廣泛,再加之牧民長時間的馴養和精心選育,形成了雙峰駝各具特色而又品性優良的特點,為養駝業的發展及駱駝產品的開發與利用做出了巨大貢獻[9]。

1.1 家養雙峰駝品種分類

中國是世界上雙峰駝的主要分布區域之一。根據2020國家統計年鑒,全國現有駱駝40.5萬峰,主要分布在新疆、內蒙古、青海、甘肅、寧夏等地,其中內蒙古自治區17.3萬峰,新疆維吾爾自治區18.5萬峰,甘肅省3.0萬峰,青海省1.7萬峰。中國的雙峰駝屬于乳、肉、絨、役兼用型,毛色多以淺褐色、杏黃色為主。目前,根據地理位置的分布分別形成了阿拉善雙峰駝(Alxa Bactrian)、蘇尼特雙峰駝(Sonid Bactrian)、青海雙峰駝(Qinghai Bactrian)、塔里木雙峰駝(Tarim Bactrian)和準噶爾雙峰駝(Junggar Bactrian)五個品種[10-11](見表1)。

表1 雙峰駝分布及品種特性

蒙古國的家養雙峰駝屬毛、肉、皮、乳、役兼用型,毛色以棕紅色為主,現存約43.4萬峰,主要分布在戈壁地區,包括東部和南部戈壁以及戈壁阿勒泰地區,可占到全國駱駝總數的71.2%。此外,8.1%的駱駝群體分布于蒙古國的平原及戈壁草原地帶;剩余少部分主要集中在東方省、蘇和巴托爾省、庫蘇古爾省、后杭愛省等山脈地區。由于地理位置上廣度的分布,蒙古國境內形成了適應當地氣候環境的獨特的駱駝品種,為嘠利賓戈壁紅駝(Galbiin Gobiin Ulaan Bactrian),哈那赫徹棕駝(Heniin Hetsiin Huren Bactrian)和圖赫么通拉嘎駝(Tokhom-tungalag Bactrian)[12-13](表1)。

哈薩克斯坦地處歐亞大陸腹地,東接我國新疆地區,是世界第一大內陸國。哈薩克斯坦境內的荒漠與草地占國土總面積的80%以上,為駱駝提供了良好的生存環境,是世界上駱駝分布最集中的國家之一。與僅有雙峰駝品種的中國相比,哈薩克斯坦既有雙峰駝,又有單峰駝,駱駝資源豐富。其中,雙峰駝主要以哈薩克雙峰駝品種(Kazakh)為主,主要用于產奶、肉和皮[14](表1)。

1.2 野生雙峰駝群體特性

長期以來,根據文獻記載和考查資料,早期野生雙峰駝分布范圍相當廣泛,數量也較多;整個中亞至西亞東部的低海拔丘陵及平原地區都是野生雙峰駝的棲息地。但時至今日,由于人類活動的影響及生態環境的日益惡化,野生雙峰駝的分布區域極度縮小,種群數量也不斷下降。目前,野生雙峰駝孤立分布在我國新疆塔里木盆地的塔克拉瑪干沙漠、羅布泊北部、阿爾金山北麓、蒙古國以及中蒙邊境的阿爾泰戈壁地區[6-7]。野生雙峰駝毛色以淺褐色為主,四肢袖長,喜歡群居,嗅覺及其靈敏,可嗅出1 500 m遠的水源,這對于生存在荒野的野生雙峰駝來說是及為重要的。

2 雙峰駝全基因組特性

相比其他畜種,雙峰駝群體遺傳學及基因組測序研究相對滯后。2007年,Jirimutu等[15]測定并揭示了國家一級保護動物野生雙峰駝的全長線粒體序列,并說明現存野生雙峰駝和家養雙峰駝具有各自獨立的母系起源[16],首次打破了“野生雙峰駝是家養雙峰駝的直系祖先”的說法,揭開了雙峰駝遺傳學研究中最主要的奧秘之一。為了進一步探究雙峰駝基因組特性,研究人員進行了高深度的denovo測序,拼接了第一版雙峰駝參考基因組,并繪制了首份基因組草圖[17]。通過拼接共獲得了2.01Gb的基因組序列(contig N50 85.3Kb,scaffold N50 2.0Mb),共注釋出20 821個蛋白編碼基因;與野生雙峰駝相比,家養雙峰駝基因組外顯子區域內的雜合子率(6×10-4)要顯著低于野生雙峰駝的雜合子率(7×10-4),表明家養雙峰駝基因組中的一些基因受到了人工選擇;同時又揭示了雙峰駝獨特的紅細胞、脂類代謝和重鏈抗體相關聯的特異基因的進化歷程,為后續進一步深入研究雙峰駝的功能基因組奠定了基礎[17](表2)。

表2 雙峰駝基因組研究比較

隨后,Wu等[2]基于比較基因組學的方法對有峰駝(雙峰駝和單峰駝)和無峰駝(羊駝)基因組進行了測序組裝,進一步提升了雙峰駝基因組組裝水平(contig N50 139Kb,scaffold N50 8.8Mb);且群體歷史規模分析顯示三個物種的群體規模與地質年代變化密切相關,表明有峰駝和無峰駝祖先分歧時間大約發生在1700萬年前,單峰駝和雙峰駝分歧時間發生在440萬年前。進一步,從比較基因組層面剖析了駱駝科動物的沙漠適應性機制,并發現了一系列與雙峰駝沙漠適應性相關的新基因[2]。此外,基于線粒體序列的雙峰駝群體基因組學的研究發現,中國、蒙古國和俄羅斯地區的家養雙峰駝群體屬于單母系起源,且不同地理位置之間的雙峰駝群體之間存在基因滲入情況[18-20]。

為了進一步提升雙峰駝基因組組裝質量,Ming等[21]利用二代、三代及Hi-C(高通量染色體構象捕獲技術)輔助組裝相結合的測序策略,組裝獲得了連續性好、準確度高的染色體水平的野生雙峰駝基因組精細圖譜,其基因組大小為2.09 Gb,組裝的Contig N50和Scaffolds N50分別達到了5.37 Mb和76.03 Mb。為雙峰駝功能基因組的研究提供了較完整、全面的染色體水平的參考序列(表2)。

3 雙峰駝的起源與進化的基因組學研究

家養動物的起源與馴化一直是考古學家和動物遺傳學家共同關注的熱點問題之一,其研究的核心是野生祖先的來源,起源地及馴化時間等。根據古生物學家發現的地質化石資料,雙峰駝是由始新時期(距今約5 500萬年)的原柔蹄類動物進化而來;約在200萬年前,雙峰駝從北美發源地一路遷徙,渡過白令海峽進入歐亞大陸,并在此大量擴散[23]?？脊艑W家發現,在伊朗北部和土庫曼斯坦南部地區出土的雙峰駝化石,是現存最早的雙峰駝化石,表明此地是雙峰駝最早的馴化地,馴化時間可追溯到距今4 500年前[24]。然而,對出土的考古材料并未進行遺骸形態測量和種屬鑒定,不確定早期發現的駱駝化石是經過馴化的雙峰駝還是現存的野生雙峰駝。

隨著現代分子生物學技術與分子系統學理論的飛速發展,使人們可以直接在分子水平上追蹤家養動物起源與進化歷程,為人們探索動物的起源與馴化時間和地點提供了新途徑。研究人員通過線粒體基因組的研究揭示了家、野雙峰駝的分歧關系,其分化時間發生在70萬年前[15]。與此同時,基于全基因組學的研究表明,家、野雙峰駝分離時間發生在43萬年前,晚于線粒體基因組研究的結果[25]。此外,在不同地理位置的家養雙峰駝群體中,伊朗雙峰駝群體具有最高的遺傳多樣性,且群體TreeMix分析顯示伊朗雙峰駝最先從家養雙峰駝群體中分離出來,分歧時間大約在4 450年前,推測伊朗是家養雙峰駝可能的馴化地區;隨后,大約2 400年前,雙峰駝向東路線到達蒙古高原,形成了表型特征各異的不同品種或類型[25]。雙峰駝遷徙路線見圖2。

圖2 雙峰駝遷徙路線[21]

4 雙峰駝功能基因組研究進展

4.1 沙漠適應性基因的研究

經過長期的自然選擇和人工馴化,雙峰駝適應荒漠地區的嚴寒、酷熱、干旱、多鹽、缺草等惡劣自然條件,使其形成了獨特的體貌特征和沙漠環境適應能力,如耐寒(戈壁沙漠地區冬季最低溫度可達零下40 ℃以下)、耐熱(夏季中午時氣溫可達37～42 ℃,沙面溫度可達65～75 ℃)、耐脫水(脫水達到體重的30%,仍能維持自身的基礎代謝)、耐高鹽、體溫調節能力(體溫晝夜溫差可達7 ℃)、獨特的解毒能力等[26]。以上獨特的生物學特性具有基因組學基礎,使得雙峰駝更能適應極端的沙漠環境[17,27-28]。

4.1.1 能量代謝相關功能基因的研究 能量的代謝和儲存對于食物匱乏的沙漠地區的駱駝而言是至關重要的。Jirimutu等[17]在雙峰駝基因組中共檢測到了2 730個快速進化基因,主要富集在糖脂代謝、胰島素信號通路和脂肪細胞因子信號通路中,推斷以上快速進化基因與雙峰駝能量儲存和生產密切相關。通過功能注釋發現,雙峰駝基因組中與能量、葡萄糖和脂肪代謝類別(GO:0006200、GO:0016887、GO:0042626、GO:0006869)中的很多基因都進行了快速進化,進而增強了雙峰駝脂肪儲存和產生能力。與此同時,雙峰駝體內與DNA損傷和修復(GO:0006974、GO:0003684、GO:0006302)、細胞凋亡(GO:0006917、GO:0043066)和蛋白質穩定性(GO:0050821)相關類別中的基因完成了快速進化,為雙峰駝耐受嚴寒酷熱的沙漠環境給予了基因組學方面的證據[2]。

4.1.2 水代謝相關功能基因的研究 雙峰駝耐脫水能力與其適應干旱的沙漠環境是密不可分。水通道蛋白家族是選擇性的水通道,在水的重吸收和代謝中起著重要作用。黃祖賢[29]研究發現,水通道蛋白AQP1和AQP2在雙峰駝腎臟中均有高水平的表達,使得雙峰駝腎小管管壁細胞的水通透性極大增強,進而加強了腎臟組織的水代謝能力。Wu等[2]研究發現,雙峰駝腎皮質和腎髓質中水通道蛋白AQP1、AQP2和AQP3是表達差異最大的3個基因,這些基因可以使其在缺水的環境中更有效地吸收水分。王進寶[30]研究發現,雙峰駝腎臟抗利尿激素V2型受體(V2R)可介導產生一系列的信號級聯,最終導致雙峰駝腎皮質和腎髓質集合管上皮細胞AQP2和AQP3的mRNA和蛋白質水平出現上調,從而加強了對原尿中水分的重吸收。

研究發現,禁水脅迫條件下的雙峰駝腎臟組織通過下調ATP檸檬酸合酶和血紅蛋白亞基β的基因表達來降低細胞呼吸和新陳代謝,同時上調聚結合蛋白2的基因表達來增強細胞的抗氧化能力,進而起到抗干旱的作用[31-32]。此外,對禁水脅迫條件下的雙峰駝腎髓質組織中共檢測到了17個差異顯著的mRNA和26個microRNA(miRNA),并通過分析發現下調的ACLY和LOC105061856、上調的PCBP2和miR-195以及靶向的LOC105061856和PCBP2是雙峰駝在禁水條件下水調節作用的重要功能基因[33]。

4.1.3 獨特的細胞色素P450酶系 細胞色素P450酶(CYP)是一種氧化酶,其同工酶參與藥物、致癌物、類固醇激素和脂肪酸的氧化代謝,其中與外源化合物(包括藥物)相關的主要有CYP1A、2A、2B、2C、3A等[34],它們參與氧化、還原、水解等反應,對外源化合物有的起代謝解毒作用,有的則起代謝活化作用[35]。

戈壁荒漠中旱生鹽生植物較多,且很多植物苦澀干硬、含有一定的毒性。一般家畜如牛、羊等盡量避開這些植物,一旦采食,輕則大病一場,重則不治而亡。而駱駝喜食這些植物,且不會產生不適應癥狀,這表征了駱駝另外一種沙漠適應能力,即耐鹽、解毒能力。對雙峰駝細胞色素P450基因家族注釋分析發現,雙峰駝具有63個拷貝數的CYP基因,分別被注釋到了17個基因家族和38個亞基因家族中;參與到了18個代謝途徑中,并在脂質代謝和外源物質的代謝過程中起到重要作用[36]。在參與代謝的P450基因中,CYP2E(2個拷貝)和CYP2J(11個拷貝)的拷貝數明顯高于其它家畜,如牛和馬[17,36]。CYP2E和CYP2J有助于將花生四烯酸轉化為19(S)-羥基二十碳四烯酸,而此物質是腎臟腎小球血管的一種潛在血管擴張劑,可刺激水的再吸收,進而調節雙峰駝體內的水鹽平衡[37-38]。研究還發現,CYP2J2基因的表達受高鹽飲食的調節,使得雙峰駝攝入大量鹽而不患高血壓[39]。雙峰駝具有6個拷貝的CYP3基因,都屬于CYP3A亞科,其主要功能是中和有毒物質[40-41],并以尿液的方式從體內排出。因此,推測雙峰駝體內的解毒能力與其含有更多拷貝數的CYP3基因有關。

4.1.4 駱駝嗜鹽相關功能基因的研究 戈壁荒漠淡水資源缺乏,鹽堿湖相對較多的自然環境促使駱駝形成了嗜鹽的生理特性,且需鹽量是其他家畜的6～8倍。研究發現,高鹽誘導下雙峰駝皮質細胞通過調控AVPR1A、SOS、SGK1、TGFB1、TLR2等基因,并激活鈣離子、JAK-STAT和MARK信號通路,適應高鹽的內環境[42]。同時,在鹽脅迫條件下的雙峰駝回腸和肝臟組織中篩選到的顯著差異表達基因(MUC6、AQP5、PKP4、CDH11、TENM1、PLIN2、UPP2)可減少水分流失、抑制鈉的過量輸入、改善保護屏障和鈉離子穩態以及維持尿苷含量,進而使得駱駝耐受高鹽[43]。對鹽脅迫條件下的駱駝腎髓質轉錄組分析中共發現了22個差異表達的mRNA、2個長鏈非編碼RNA(lncRNA)和31個miRNA;進一步,使用熒光原位雜交和雙熒光素酶報告基因分析,發現lncRNA LNC003834可以結合miRNA-34a,從而減輕鹽吸收抑制SLC14A1基因的表達[44]。

4.2 駱駝高血糖調節基因研究

血糖水平高、胰島素不敏感是駱駝的一個重要生理特性。正常狀態下,駱駝的血糖水平(7.1±0.3 mmol/L)比其他反芻動物(2.5～3.5 mmol/L)高兩倍,比單胃動物(3.5～5.0 mmol/L)高1～1.5倍[45]。而其血液胰島素含量(5±1 μU/mL)相對于羊(12±2 μU/mL)和馬(7±1 μU/mL)較低,且駱駝血液中葡萄糖含量下降也較羊和馬慢[46]。然而,在高血糖低胰島素情況下,駱駝不會出現不適或病變反應,說明其體內存在特殊的糖轉運和代謝活力的功能基因。

駱駝全基因組的研究發現,一些明顯的快速進化基因富集到了胰島素信號通路和II型糖尿病代謝通路中,推測這些基因有助于維持駱駝體內高濃度的血糖水平[17]。在禁水條件下,駱駝腎髓質中參與糖酵解的基因、葡萄糖轉運相關的功能蛋白等顯著上調表達,說明駱駝體內通過以上蛋白/基因的表達來提高葡萄糖的轉運效率[2]。在高糖誘導下的雙峰駝腎皮質細胞中共發現了458個差異表達基因,其中上調的基因包括鈣調素依賴性蛋白激酶IIβ(CAMK2β),aA-晶體蛋白(CRYAA)和泛酰巰基乙胺酶(VNN1);同時,激活了一些參與控制糖尿病和腎病的重要通路,如PI3K-Akt、AGE-RAGE、TGF-β、NF-kB等信號通路[42],為進一步了解雙峰駝特殊的糖代謝途徑,解釋其在極端環境下極強生存能力的分子機制提供參考。

4.3 駱駝免疫基因的研究

駱駝科動物在進化過程中不僅形成了許多適應沙漠極端環境的生理特性,也形成了非常獨特的免疫系統。眾所周知,哺乳動物的常規IgG抗體都是由兩條重鏈和兩條輕鏈肽段組成的四聚體。但是在1993年,Hamers-Casterman等[47]在駱駝中發現了僅由兩條重鏈組成的二聚體IgG抗體,為重鏈抗體(heavy-chain antibody)。雖然缺失輕鏈的抗體在人類的遺傳病和小鼠的基因改造中也被獲得過,但它們都喪失了抗原結合能力[48]。迄今為止,駱駝科是唯一被發現的可以產生具有生物活性的重鏈抗體的哺乳動物[49],在美洲駝(如羊駝)血清中的比例僅為10%～25%,而在單峰駝和雙峰駝血清中的比例高達50%～80%[50],說明其在駱駝進化過程中受到了較強的自然選擇。

對雙峰駝抗體編碼基因的研究表明,其具有17個重鏈可變區(VH)、7個多變區(DH)、6個連接區(JH)和10個固定區(CH)。駱駝抗體基因與編碼常規抗體的基因有兩個明顯不同。首先,重鏈抗體的IGHV基因(稱為IGHVH)在FR2區的四個位置發生了標志性的氨基酸替換,大多數替換方式為Val42Phe/Tyr、Gly49Glu、Leu50Arg/Cys和Trp52Gly/Leu[51]。其次,在恒定區基因中,編碼重鏈抗體的IGHG2和IGHG3基因在CH1外顯子處發生了剪切位點突變(GT->AT),導致與輕鏈相連的CH1區域缺失[52]。初步的試驗研究表明,雙峰駝血清中的IgG主要以重鏈抗體的形式存在[53],但是雙峰駝分子數據的匱乏嚴重限制了其研究和開發。2012年,駱駝基因組草圖首次得到了雙峰駝IGHV-D-J-C的部分基因序列,但連續性較差[17]。隨后,在連續性較好的基因組中揭示了雙峰駝IGHV-D-J-C的完整結構[21]。與羊駝比較,雙峰駝IGHD-J-C基因序列都非常保守,但在IGHV區域存在比較大的序列分化。

5 小 結

縱觀人類歷發展史,駱駝在運輸、貿易、戰爭、農耕、文化交流等方面發揮了不可替代的作用,極大地促進了人類文明的交流與社會的進步。近年來,有關雙峰駝品種分類、基因組的研究不斷涌現,為保護瀕危的野生群體、揭示家養品種種質特性和遺傳資源保護具有重大意義。本文概括了世界主要的雙峰駝品種特性與分布,介紹了駱駝全基因組特性、起源馴化歷程,并從功能基因組層面挖掘雙峰駝獨特的生物學特性。下一步,深入探究雙峰駝生產性能相關的基因(如產奶、產肉),并對篩選到的基因進行功能研究將是今后工作的重點,最終為明晰雙峰駝的種群特性、提高生產性能奠定理論基礎。