腫瘤微環境在食管癌中的研究進展

張家豪,何珂瑤,李超偉,張哲源,代寧濤,楊海軍,李軍擴,劉怡文,孫 蔚,郭藝博,孔金玉,周福有,4

食管癌(esophageal cancer,EC)是常見高發病率且預后較差的消化道腫瘤,病理學分為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)、食管腺癌、神經內分泌癌等多種類型,其中ESCC約占我國EC的90%以上[1]。EC的發生發展是多因素共同作用的過程,涉及腫瘤細胞自身特質及腫瘤微環境(tumor microenvironment,TME)調控影響。TME由基質細胞、免疫細胞、細胞外基質及信號分子等成分組成,在介導腫瘤細胞增殖轉移及免疫逃逸中發揮重要作用。TME可通過調控細胞因子的分泌和信號通路的傳導,為促進EC的發生發展提供必要條件;TME重塑可增強腫瘤細胞惡性生物學能力并影響抗腫瘤治療效果,這可能也是EC患者常規治療耐藥的重要原因[2]。因此,深入了解TME的組成,以及靶向TME治療EC的相關策略,有望為EC精準治療提供新靶標。

1 TME的組成

1.1 腫瘤相關成纖維細胞

腫瘤相關成纖維細胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)是TME中最豐富的間質細胞,由成纖維細胞、上皮細胞和平滑肌細胞等多種細胞轉化而來,在腫瘤的發生發展過程中發揮著關鍵作用。腫瘤細胞分泌轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)誘導CAFs活化,使其產生多種細胞因子,促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[3]。α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)是肌成纖維細胞的激活標志物,特征性表達α-SMA的CAFs具有更高的細胞增殖活性和遷移能力。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)產生細胞內活性氧,介導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉分化。據報道,抑制NOX4的活性并下調α-SMA的表達,可阻礙CAFs生成,在體內外模型中達到抗腫瘤作用[4]。研究發現,CAFs生成與EC患者更差的腫瘤分期和更高的淋巴結轉移率呈正相關,且CAFs+α-SMA陽性患者預后更差[5],提示具有肌成纖維細胞表型的CAFs可能作為評估EC患者預后的指標。此外,CAFs可促使腫瘤細胞分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),誘導EC的血管形成;CAFs還可介導Wnt相關蛋白高表達并激活其信號通路,調控EC的惡性增殖[6]。體外研究發現,EC細胞系與CAFs共培養后腫瘤細胞增殖能力增強,而清除CAFs后癌細胞凋亡增加[7]。以上研究表明CAFs參與EC的進展,阻斷CAFs形成可能是EC患者的新型治療策略。

1.2 腫瘤相關免疫細胞

TME中存在大量免疫細胞,其中腫瘤相關免疫細胞主要有腫瘤相關巨噬細胞(tumor-as-sociated macrophage,TAM)、調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)和髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)。TAM是最典型的腫瘤浸潤性免疫細胞,參與腫瘤發生發展的每個階段。TME誘導TAM分化為經典活化的M1型和替代活化的M2型。M1型分泌各種炎性細胞因子促進機體炎癥反應,M2型分泌促血管生成因子誘導腫瘤血管生成,并激活免疫抑制途徑促進腫瘤進展。在大多數實體腫瘤中TAM的豐度與患者預后呈負相關。一項關于TAM與ESCC的Meta分析發現,M2型TAM浸潤患者對新輔助治療反應性差,TNM分期增加且總體生存率降低[8]。單一手術治療的食管腺癌患者中,M2型TAM高度浸潤患者預后差[9]。由此可見,TAM的浸潤程度與EC進程和總生存期(overall survival,OS)縮短密切相關。此外,TAM可通過分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和多種促血管生成因子促進EC增殖、轉移及脈管生成[10],因此靶向TAM可能是有潛力的EC治療突破口。

Treg構成大多數腫瘤免疫浸潤細胞的重要部分,腫瘤或基質細胞釋放趨化因子在EC中募集Treg,抑制自身反應性T細胞增殖和細胞因子生成,介導腫瘤細胞發生免疫逃逸[11]。叉頭蛋白分子3(forkhead box p3,Foxp3)是Treg特異性標志因子,其表達調控Treg的發育和功能。研究發現,EC組織中Foxp3+Treg富集患者較CD8+Treg富集患者預后差,并且Foxp3+Treg富集是影響患者預后的獨立危險因素[12]。Treg細胞可分泌白細胞介素(interleukin,IL)-10和TGF-β,抑制T細胞免疫應答;IL-32則通過促進Foxp3+Treg細胞發育,削弱抗EC治療效應[13]。EC患者中CD4+CD25+Treg表達顯著高于健康對照組,并與淋巴結轉移及TNM分期密切相關[14]。以上研究支持Treg廣泛參與EC的發生發展。因此,充分認識Treg及其亞群與EC的關系,靶向Treg可能使患者重新獲得有效的T細胞介導抗瘤活性。

MDSC來源于骨髓,是具有免疫抑制功能的異質性細胞群。MDSC在TME中調控免疫應答,可阻礙細胞周期完成,抑制免疫殺傷細胞活性并促進腫瘤增殖。ESCC患者中MDSC水平增加伴有程序性死亡蛋白受體配體1(programmed death ligand 1,PD-L1)高表達,同時,MDSC衍生的TGF-β可誘導CD8+T細胞高表達程序性死亡蛋白受體1(programmed death,PD-1)[15]?？梢?MDSC通過PD-1/PD-L1途徑對T細胞發揮免疫抑制作用,并與腫瘤負荷、淋巴結轉移和腫瘤分期相關。MDSC還可抑制IL-2和IL-10生成,介導T細胞失活,縮短EC患者OS[15],提示全面考慮MDSC在EC進展中的作用將有效提高患者預后評估價值。醛脫氫酶1相關信號通路和IL-6可誘導MDSC活化,招募MDSC在EC中浸潤,削弱機體抗腫瘤免疫反應[16]。MDSC核轉錄因子NF-κB信號通路的激活可上調IL-4RA的表達和一氧化氮的生成,抑制CD8+T細胞的細胞毒性,從而促進腫瘤細胞生長[17]。因此,MDSC在EC逃避免疫監視中發揮重要作用,干預MDSC可能是EC免疫治療的新途徑。

1.3 細胞外基質

TME的組成除細胞成分外,非細胞成分主要有細胞外基質及各種細胞因子和蛋白酶等。細胞外基質(extracellular matrix,ECM)在腫瘤發展過程中呈動態變化,以促進瘤細胞增殖轉移。ECM的重要成分I型膠原和糖蛋白共同參與細胞間黏附,影響治療藥物的滲透和運輸,其改變已被證明與腫瘤細胞侵襲性增強相關。整合素作為細胞黏附分子家族的重要成員之一,介導腫瘤細胞與ECM的信號通路傳導,并調控腫瘤細胞的增殖、分化。體外研究發現,通過敲除整合素α6可抑制EC細胞的增殖、侵襲[18],證明整合素α6可能是EC潛在的治療靶點。此外,ECM重塑依賴于基質可降解的蛋白水解酶,包括MMPs、纖溶酶原激活劑和糖酵解酶。研究已鑒定出30多種MMPs,其中MMP-2和MMP-9過表達與EC患者TNM分期、腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移相關。MMPs還受其內源性天然抑制物(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)所調節,TIMPs低表達且MMPs高表達的EC患者預后更差[19]。外源性MMPs抑制劑目前已有效治療牙周病、多發性硬化癥和胃癌,未來將有望運用于EC。賴氨酰氧化酶是ECM的重要酶,研究發現沉默賴氨酰氧化酶可抑制ESCC細胞的增殖,降低其侵襲和遷移能力[20]。ECM作為TME的組成成分之一,對EC的進展及預后評估有著重要影響。探明ECM在EC中的作用機制,有望為抗EC治療提供新方向。

2 靶向TME治療EC的相關策略

2.1 抗血管生成

腫瘤血管通過輸送氧氣和營養物質,促進腫瘤細胞擴散和轉移。腫瘤血管生成受多種血管生長因子調節,其中VEGF是血管生成的高特異性調控因子,結合其受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)觸發ERK1/2和PI3K/Akt下游信號通路傳導,促進腫瘤細胞增殖及分化,表明調控VEGF/VEGFR通路是抗血管生成藥物治療EC的有效機制。目前已研發多種VEGF/VEGFR抑制劑如阿帕替尼、安羅替尼、舒尼替尼和雷莫蘆單抗等,其中阿帕替尼和安羅替尼被納入中國臨床腫瘤學會《食管癌診療指南》[21],作為EC的重點治療藥物。研究發現,阿帕替尼治療晚期EC,可不同程度地緩解患者臨床癥狀,提高患者生活質量,并耐受大多藥物相關不良反應[22]。一項隨機、雙盲、多中心Ⅱ期試驗(NCT02649361)納入165例復發或轉移性ESCC患者,按2∶1隨機分配到安羅替尼組(n=110)和安慰劑組(n=55),結果顯示,安羅替尼組患者中位無進展生存期(progression-free survival,PFS)顯著高于安慰劑組(3.0個月 VS 1.4個月,HR=0.46,95%CI=0.32～0.66);安全性評估中,安羅替尼組患者常見Ⅲ/Ⅳ級治療相關不良事件為高血壓(16%)、食欲下降(6%)和低鈉血癥(4%),其中有3例(3%)患者死亡考慮與藥物相關;安慰劑組患者常見不良事件為食欲下降(4%),無治療相關性死亡發生[23]。但目前臨床評估表明,單藥治療效果有限,抗血管生成聯合放/化療或免疫療法可能取得更好的抗腫瘤療效。一項單臂、開放標簽Ⅱ期試驗(NCT03736863)評估阿帕替尼聯合PD-1抑制劑卡瑞利珠單抗治療晚期ESCC療效,結果顯示,患者客觀緩解率為34.62%,藥物相關不良事件發生率為44.23%[24]。另一試驗(ChiCTR-TRC-1800017662)納入126例患者,評估阿帕替尼聯合新輔助化療(紫杉醇+順鉑)治療晚期ESCC的療效及安全性,研究發現,與新輔助化療組相比,阿帕替尼+新輔助化療可顯著提高ESCC患者總緩解率(80.00%VS54.10%)及病理完全反應率(15.38% VS 4.92%),且兩組患者無嚴重不良事件發生[25]。一項研究納入65例晚期ESCC患者,對照組(n=34)給予同步放化療,觀察組(n=31)在此基礎上給予阿帕替尼聯合治療,發現觀察組患者中位PFS(12.0個月 VS7.0個月)及完全緩解率(22.58% VS 2.94%)均明顯高于對照組[26]。同時,也有研究探討阿帕替尼聯合化療對晚期EC患者臨床療效及安全性的影響,將33例患者隨機分為紫杉醇治療組和阿帕替尼+紫杉醇治療組,該研究中阿帕替尼+紫杉醇可顯著提高晚期EC患者臨床療效,表現為中位PFS(175 d VS 85 d)、客觀反應率(88.89%VS11.11%)和疾病控制率(93.33% VS 33.33%)均升高;安全性評估中,紫杉醇組常見Ⅲ/Ⅳ級不良事件為貧血(11.11%)和中性粒細胞減少癥(5.56%),阿帕替尼+紫杉醇組常見貧血(13.33%)、高血壓(6.67%)和蛋白尿(6.67%)[27]?；仡櫺苑治霭擦_替尼聯合同步放療治療晚期ESCC患者,研究發現,與同步放療組相比,安羅替尼+同步放療組患者中位OS升高(9.0個月 VS 5.0個月,HR=0.58,95%CI=0.34～0.92),總體不良事件發生率減輕[28]。陳輝等[29]發現,安羅替尼聯合紫杉醇+順鉑治療EC患者的總緩解率(85.00% VS 45.00%)、病灶局部控制率(70.00% VS 47.50%)、中位OS(10.85±2.30 VS 9.23±1.61)及PFS(6.81±1.43 VS 5.00±1.23)均高于常規化療組,而兩組患者不良事件發生率無顯著差異。研究者納入98例晚期ESCC患者,將安羅替尼聯合PD-1抑制劑治療分為A組,安羅替尼單藥治療分為B組,研究發現,隊列A組患者中位PFS延長(5.4個月 VS 3.0個月),疾病控制率增高(71.74% VS 47.92%);兩組患者不良反應事件以Ⅰ/Ⅱ級為主[30]。因此,抗血管生成藥物(或聯合常規治療方案)具有良好的抗EC活性及可控的毒性,并顯著提高患者臨床療效及安全性。探索更多聯合治療方案,將對改善EC患者預后具有重要意義,可能是晚期EC患者潛在的二線治療用藥。

抗血管生成療法也有一定的局限性。除了一些可控制的副作用如高血壓、腎功能障礙和血栓形成等,抗血管生成藥物還可能影響其他化療藥物在體內的擴散。以往認為,抗血管生成治療可誘導腫瘤血管的結構和功能正?；?使得血流增加并促進細胞毒性藥物進入腫瘤組織。而 Van der veldt等[31]使用PET觀察到抗血管生成藥物可抑制細胞毒性藥物向腫瘤部位的運輸,這一理論尚需要進一步驗證?？偟膩碚f,抗腫瘤血管生成能達到更好的治療療效,積極研發新的血管生成抑制劑并探索與其他藥物聯合作用是EC治療的重點研究工作。

2.2 免疫療法

EC的免疫微環境復雜多樣,腫瘤細胞通過招募多種免疫細胞群或表達抑制性因子以逃避T細胞的殺傷。免疫療法通過抑制相關通路的表達或提供免疫特異性腫瘤抗原,以恢復免疫系統功能并清除腫瘤細胞。常見的免疫療法有免疫檢查點抑制、DC免疫治療、嵌合抗原受體T細胞療法和腫瘤疫苗接種。

PD-1是T細胞常見的免疫檢查點,與其配體PD-L1結合抑制T細胞活化和增殖?；谶@一原理,阻斷PD-1/PD-L1通路的免疫療法被用于治療多種惡性腫瘤。目前,關于PD-1/PD-L1抑制劑治療EC的臨床試驗正在持續開展中。KEYNOTE-590(NCT03189719)試驗評估帕博利珠單抗與安慰劑聯合化療(5-氟尿嘧啶+順鉑)治療PD-L1≥10晚期EC患者療效,結果顯示,與安慰劑+化療組相比,帕博利珠單抗+化療組患者的中位OS(13.9個月VS 8.8個月,HR=0.57,95%CI=0.43～0.75)及PFS(7.5個月 VS 5.5個月,HR=0.51,95%CI=0.41～0.65)延長、治療相關不良事件發生率增加(71.89% VS 67.57%)[32]。KEYNOTE-975(NCT04210115)研究得出相似結論,提出帕博利珠單抗聯合放化療可有效改善PD-1/PD-L1陽性晚期ESCC患者OS及PFS[33]。一項Ⅲ期試驗(NCT03691090)隨機將晚期或轉移性ESCC患者給予安慰劑或卡瑞利株單抗聯合化療(紫杉醇+順鉑)治療,結果顯示,安慰劑+化療組患者中位OS及PFS分別為12.0個月和5.6個月,低于卡瑞利株單抗+化療組患者的15.3個月(HR=0.70,95%CI=0.56～0.88)和6.9個月(HR=0.56,95%CI=0.46～0.68);且卡瑞利株單抗+化療組患者治療相關不良事件發生率低于安慰劑組(63.42% VS 67.68%)[34]。JUPITER-06(NCT03829969)試驗評估了特瑞普利單抗與安慰劑聯合化療(紫杉醇+順鉑)在晚期ESCC的臨床療效,該研究納入514例患者,結果顯示,與安慰劑+化療組相比,特瑞普利單抗+化療可改善ESCC患者中位OS(17.0個月 VS 11.0個月,HR=0.58,95%CI=0.43～0.78)及PFS(5.7個月 VS 5.5個月,HR=0.58,95%CI=0.46～0.74),且兩組患者治療后不良事件發生率相似[35]。ORIENT-15(NCT03748134)研究探討信迪利單抗聯合化療對PD-L1≥10的晚期或轉移性ESCC患者抗腫瘤活性,患者接受信迪利單抗或安慰劑治療,并分別聯合順鉑+紫杉醇或順鉑+5-氟尿嘧啶化療,結果顯示,與安慰劑+化療組相比,信迪利單抗+化療組患者的中位OS更高(17.2個月 VS 13.6個月,HR=0.64,95%CI=0.48～0.85),PFS呈現良好趨勢(8.3個月 VS 6.4個月,HR=0.58,95%CI=0.45～0.75);安慰劑+化療組和信迪利單抗+化療組患者均發生了≥Ⅲ級的嚴重不良反應事件(59.94% VS 54.52%)[36]。同時,RATIONALE 311(NCT03957590)試驗給予替雷利珠單抗聯合同步放化療[37],NCT03958890試驗給予斯魯利單抗聯合化療,為改善晚期或轉移性ESCC患者OS和PFS帶來了臨床獲益,且具有可接受的安全性[38]?？梢?PD-1/PD-L1抑制劑聯合常規治療作為晚期EC的一線療法取得了初步成功,并在未來顯示了良好的前景。由于PD-L1陽性與EC患者預后不良顯著相關,提示PD-L1可作為患者預后生物指標。然而并非所有患者均對PD-1/PD-L1抑制劑敏感,需要尋找其他生物標志物來協助評估患者預后。分析260例ESCC患者發現,粘連蛋白γ2上調可降低抗PD-1治療效果[39],提示粘連蛋白γ2可能作為EC患者抗PD-1治療預后差的預測因子。此外,包括錯配修復缺陷、腫瘤突變負荷和微衛星不穩定性在內的腫瘤特異性新抗原已被確定為非小細胞肺癌對PD-1/PD-L1抑制效率的預測[40],但尚未在EC中得到驗證。研究表明,綜合分析CD8+T細胞豐度、腫瘤突變負荷和PD-1基因表達可能提高EC患者預后評估準確性[41]。因此,聯合運用各項指標可能更有效地篩選出EC免疫治療敏感人群。

樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是重要的抗原提呈細胞,其成熟狀態可激活免疫系統,未成熟狀態則誘導機體免疫耐受。腫瘤細胞可釋放免疫抑制因子,誘導DC未成熟化,促使腫瘤細胞免疫逃逸?；贒C的免疫治療,在啟動有效T細胞抗腫瘤反應中發揮重要作用。Ogasawara等[42]評估WT1肽脈沖DC疫苗聯合OK-432用于晚期或復發性EC患者的安全性和可行性,研究發現,患者客觀緩解率為20%,疾病控制率為40%,中位OS及PFS分別為7.0個月及4.1個月,且未觀察到與疫苗接種相關嚴重不良事件發生。Wang等[43]團隊納入40例接受放療的EC患者,其中28例患者在此基礎上接種DC疫苗,研究發現,疫苗組患者血清IL-2、IL-12、IFN-γ水平及IFN-γ CD8+T比例升高,患者1 a(82.14% VS 50.00%)及2 a OS(67.86% VS 33.33%)增加,且僅有2例患者出現輕度發熱。另一項Meta分析納入11項研究,包括994例EC患者,探討細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cells,CIK)或DC-CIK免疫治療在EC中的臨床療效,發現與常規治療組相比,CIK/DC-CIK免疫治療組患者IL-12(OR=56.30,95%CI=51.32～61.28)、INF-α(OR=15.10,95%CI=12.31～17.89)、IFN-γ(OR=36.30,95%CI=31.54～41.06)水平及CD3+(OR=9.48,95%CI=6.19～12.77)和CD3-CD56+(OR=6.57,95%CI=2.00～11.14)亞群百分比升高;總緩解率(OR=2.18,95%CI=1.57～3.02)、疾病控制率(OR=3.83,95%CI=2.47～5.92)及1 a OS(OR=2.59,95%CI=1.52～4.40)增加,生活質量提高(OR=1.94,95%CI=1.13～3.22)[44]。以上研究表明,以DC為基礎的免疫療法用于治療晚期EC患者,可引起特異性免疫反應,提高患者免疫功能及生存結局,且具有安全可行性。研究發現,DC表面可表達共刺激基因PD-L1,通過與T細胞表面PD-1相互作用,減弱效應T細胞抗腫瘤效應[45]。表明沉默或下調DC的PD-L1或T細胞的PD-1,可能增強DC并啟動T細胞免疫反應。因此,DC和PD-1/PD-L1信號通路在腫瘤免疫應答中具有關聯作用,基于DC的免疫療法與阻斷PD-1/PD-L1信號通路的聯合治療策略,可能成為未來抗EC治療的新領域。

嵌合抗原受體T細胞療法通過基因工程將T細胞改造成嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptors-T,CAR-T),特異性識別并攻擊腫瘤細胞。CAR-T細胞療法常用于白血病和淋巴瘤等血液系統惡性腫瘤的治療。近年來,CAR-T細胞也被探索用于治療實體腫瘤,包括EC。肝細胞受體A2和人表皮生長因子受體2在EC中高表達,是CAR-T細胞治療的常見靶點[46]。這種CAR-T細胞療法能釋放高水平的促炎細胞因子,并有效識別、結合和破壞EC細胞系,在臨床前研究中顯示出了抗腫瘤作用。然而CAR-T細胞療法在EC患者中的臨床試驗尚無報道。通過修改CAR-T細胞的結構域,獲得了更強特異性、持久性的新一代CAR-T細胞,其在EC小鼠模型體內存活時間更長[47],意味著可能具有持續的抗腫瘤能力。關于CAR-T細胞療法在EC中的作用需要進一步研究。

腫瘤-睪丸抗原(cancer-testis antigens,CTA)是EC中高表達的腫瘤相關抗原,包括紐約食管鱗狀細胞癌1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1,NY-ESO-1)、酪氨酸和蘇氨酸蛋白激酶(tyrosine and threonine protein kinase,TTK)、黑色素瘤相關抗原-A和CTA-2[48]。腫瘤疫苗通過這些特定的抗原誘導免疫反應,刺激細胞毒性T淋巴細胞識別并攻擊腫瘤細胞。NY-ESO-1在晚期ESCC患者的Ⅰ期臨床試驗中顯示出了可靠的安全性和免疫原性,為多肽疫苗治療EC的臨床研究提供了基礎保障[49]。一項晚期EC的II期臨床試驗中,針對包含TTK、淋巴細胞抗原6復合體位點K和胰島素樣生長因子-IImRNA結合蛋白3的多肽組合疫苗進行檢測,發現腫瘤疫苗誘導人類白細胞抗原基因(HLA-A+2402)依賴的免疫應答與更好的預后相關[50]。腫瘤疫苗療法可能為EC患者提供益處,然而目前尚未正式應用于臨床,其強大而特異的抗腫瘤療效還有待繼續探索。

3 總結

近年來,隨著人們對TME和靶向TME治療的深入了解,抗血管生成藥物、PD-1/PDL1抑制劑和DC免疫治療已投入臨床使用,并顯示出良好的抗EC療效。新的免疫療法,如CAR-T細胞療法和腫瘤疫苗接種在臨床前試驗中也顯示出初步的治療價值。然而,現有的治療方案仍存在許多局限性,不足以完全治愈惡性腫瘤。增強現有藥物的有效性,如使用生物標志物來識別藥物敏感的EC患者或聯合用藥以增強治療療效,是延長患者OS的最直接方法。未來仍需不斷探索TME在EC中的作用,為有效抗EC治療提供指導方案。