hsa_circRNA6448-14對食管鱗癌細胞惡性增殖能力的影響

李夢輝,王 平,張耀文

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)病因不明、機制不清、死亡率極高[1-2]。全球每年新發的ESCC患者中,中國占一半以上,其中河南占中國的一半以上[3-4]。因此,尋找ESCC早診早治的特異性分子標志物,對降低其發病率及改善患者預后至關重要。

資料顯示,新發現的內源性非編碼RNA-circRNA(circular RNA,circRNA)具有結構穩定、種類豐富、特異性強、序列保守等特點,可調控天然小RNA(microRNAs,miRNAs)活性,參與結合轉錄調控元件及轉錄蛋白互作基因等[5-7]。circRNA已被證實為肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤的生物標志物[8-10]。本團隊前期研究發現hsa_circRNA6448-14在ESCC中的表達量顯著高于正常組織,表明hsa_circRNA6448-14與ESCC發生發展相關,但其具體致病機制尚不明確[11-12]。

本研究建立hsa_circRNA6448-14敲低的ESCC細胞系,采用CCK8及平板克隆實驗檢測親本與敲低細胞系的體外增殖能力,分析hsa_circRNA6448-14在ESCC細胞惡性增殖過程中的作用,為ESCC治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

KYSE30及KYSE150細胞系(人ESCC細胞系,中國BNCC公司)。Lipofectamine2000轉染試劑(美國 Invitrogen公司);hsa_circRNA6448-14-siRNA及siNC(上海吉瑪基因公司);hsa_circRNA6448-14上游引物為5’-CCAATGGGGACTGTC ATGGA-3’,下游引物為5’-TCATGCCGTGTTTCAGCTCA-3’,GAPDH 上游引物為5’-GTGGAGTCCACTGGCGTCT-3’,下游引物為5’-GTGCAGGAGGCATTGCTGAT-3’(中國Sangon Biotech公司);Trizol試劑盒(美國Thermo公司);反轉錄試劑盒及qPCR試劑盒(中國Vazyme公司);CCK8試劑盒、PBS緩沖液、4%細胞固定液及1%結晶紫染液(中國Solarbio公司)。PCR儀(美國Bio-Rad公司);倒置顯微鏡(日本Nikon公司);成像系統(美國Thermo公司);酶標儀(美國PerkinElmer公司)。

1.2 hsa_circRNA6448-14敲低

常規培養KYSE30及KYSE150細胞,將兩株細胞各分為兩組:對照組及觀察組。待細胞密度為70%時,根據說明書將siNC及hsa_circRNA6448-14-siRNA與Lipofectamine2000轉染試劑混合,分別轉染對照組及觀察組細胞。48 h后,采用qRT-PCR檢測hsa_circRNA6448-14的敲低效率,并進行后續實驗。

1.3 qRT-PCR

待各組細胞密度至80%,棄去培養基,PBS清洗后,加入Trizol冰上裂解,根據說明書步驟提取各組細胞總RNA。各組細胞均取1 μg總RNA,采用試劑盒配制反轉錄體系,反應條件為:25 ℃ 5 min,42 ℃ 60 min,70 ℃ 15 min。采用試劑盒配制qRT-PCR反應體系,反應條件為:95 ℃預變性20 s,95 ℃變性3 s,60 ℃退火 30 s,共40個循環。采用2-△△Ct法計算circRNA的相對表達量。具體步驟參考說明書及文獻[12]。實驗重復3次。

1.4 CCK8

將各組細胞密度調整為每mL 1 × 104。每組均于96孔板中鋪入100 μL細胞懸液,常規培養。采用CCK8試劑盒,每隔24 h于酶標儀測定一次OD450 nm。對比不同組間的體外增殖能力,具體步驟參考說明書及文獻[13]。實驗重復3次。

1.5 平板克隆

將各組細胞密度調整為每mL 5 × 102個。每組均于6孔板中鋪入2 mL細胞懸液,常規培養。1周后可見克隆形成。棄去培養基,于PBS緩沖液清洗、4%細胞固定液固定、1%結晶紫染液染色后,對單克隆進行拍照并計數[13]。實驗重復3次。

1.6 統計學方法

本研究采用的統計學軟件為GraphPad 8.0。采用t檢驗比較兩組細胞間hsa_circRNA6448-14表達量差異及體外增殖能力差異。檢驗水準α=0.05,以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞hsa_circRNA6448-14的表達量

建立hsa_circRNA6448-14敲低的KYSE30及KYSE150細胞系。實驗分為對照組及觀察組,通過qRT-PCR檢測各組細胞系中hsa_circRNA6448-14的相對表達量。結果顯示,與對照組相比,觀察組細胞中hsa_circRNA6448-14的相對表達量顯著降低(P<0.05)。表明成功建立hsa_circRNA6448-14敲低的ESCC細胞系。見圖1。

A、B:qRT-PCR檢測各組KYSE30/KYSE150細胞。圖1 各組細胞中hsa_circRNA6448-14相對表達量的檢測結果

2.2 各組細胞體外增殖能力的CCK8檢測

實驗分為對照組及觀察組。圖2結果顯示,與對照組相比,觀察組細胞的體外增殖能力顯著減弱(P<0.05)。表明hsa_circRNA6448-14可維持ESCC的惡性增殖。

A、C:CCK8法檢測各組KYSE30/KYSE150細胞的體外增殖能力;B、D:各組KYSE30/KYSE150細胞的體外增殖能力差異。圖2 各組細胞體外增殖能力的CCK8檢測

2.3 各組細胞體外增殖能力的平板克隆檢測

實驗分為對照組及觀察組。圖3結果顯示,與對照組相比,觀察組細胞的體外增殖能力顯著減弱(P<0.05)。表明hsa_circRNA6448-14在ESCC惡性增殖過程中發揮重要作用。

A、C:平板克隆法檢測各組KYSE30/KYSE150細胞的體外增殖能力;B、D:各組KYSE30/KYSE150細胞的體外增殖能力差異。圖3 各組細胞體外增殖能力的平板克隆檢測結果

3 討論

河南ESCC發病率居全國首位,由于ESCC起病隱匿,多數患者確診時已發展至中晚期,5 a生存率極低。因此,尋找ESCC的診斷標記物和治療靶點至關重要。

研究表明,circRNA已被證實與多種惡性腫瘤發生發展密切相關。甲狀腺癌中,has_circRNA0058124可通過miR-218-5p/NUMB調控NOTCH3/GATAD2A軸促進癌細胞侵襲及轉移,且顯著縮短患者生存期[14];前列腺癌中,circCSNK1G3可通過調控miR-181促進癌細胞惡性增殖,降低其治療敏感性[15];肝癌中,circASAP1可通過調控miR-326/miR-532-5P-MAPK1信號通路促進癌細胞遠處轉移,引起患者耐藥及復發[16];非小細胞肺癌中,circFGFR1可通過miR-381-3P誘導CXCR4高表達,引起癌細胞抵抗凋亡,導致其免疫逃逸[17];胃癌中,hsa_circ_0001725可通過miR-150-5P/c-Myc軸參與胃癌的發生發展,其高表達的患者淋巴結轉移率高,TNM分期差,術后生存期短[18];骨肉瘤中,circMYO10可通過miR-370-3P/RUVBL1軸引起染色質重塑,增強β-catenin/LEF1轉錄活性,促進癌細胞上皮間質轉化,導致其惡性轉移[19]。

資料顯示,CircRNA在ESCC發生發展中扮演著重要角色。Circ-7不僅可通過miR-7激活NFκB/p65通路促進ESCC細胞生長,還可通過miR-7激活KLF4促進ESCC細胞遷移[20-21]。circ_0000654可通過miR-149-5P激活IL-6/STAT3通路誘發炎癥反應,降低ESCC細胞的放療敏感性[22]。本團隊前期研究發現hsa_circRNA6448-14高表達的ESCC患者生存期縮短[11-12],表明hsa_circRNA6448-14參與了ESCC的發生發展?；诖?本研究建立hsa_circRNA6448-14敲低的ESCC細胞系,采用CCK8及平板克隆實驗檢測親本與敲低細胞系的體外增殖能力,發現與親本細胞系相比,hsa_circRNA6448-14敲低的ESCC細胞系的體外增殖能力顯著減弱,提示靶向hsa_circRNA6448-14可有效抑制ESCC細胞的惡性增殖,表明hsa_circRNA6448-14為ESCC細胞增殖過程中的關鍵調控因子。

綜上所述,hsa_circRNA6448-14在ESCC細胞惡性增殖過程中發揮重要作用。由于ESCC的發生發展是一個多因素相互作用的復雜過程,且本研究檢測方法較少,circRNA的具體致病機制后續仍需其他實驗進一步驗證,但靶向hsa_circRNA6448-14可抑制ESCC細胞生長。本研究為ESCC治療提供了新思路。