橡膠樹蛋白激酶基因SnRK2.7 的克隆及表達

劉云飛，李 言，田維敏

（1. 海南大學 熱帶作物學院，?？?570228; 2. 中國熱帶農業科學院 橡膠研究所/農業農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，?？?571101）

脫落酸（abscisic acid, ABA）是一種經典植物激素，在植物應對干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫中起重要的調節作用。植物遭遇低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫時，內源ABA 迅速積累，應對環境脅迫的壓力[1-2]。ABA 誘導細胞中分子伴侶、LEA蛋白、防凍蛋白、糖、脯氨酸等保護劑的積累，或激活解毒機制，調節氧化還原平衡或改變離子轉運來重建穩態，從而增強植物非生物脅迫的耐受性[3]。此外，ABA 還調節植物種子成熟、種子休眠和萌發、營養發育、幼苗建立、根生長、開花、氣孔運動和衰老等各方面的生長發育[4]。

人們對ABA 信號傳導途徑已經有了較深入的了解。在高等植物逆境脅迫時，ABA 含量增加，結合于受體PYR/PYL/RCAR 蛋白內腔的配體結合位點，誘導受體蛋白的構象變化，ABA 被封閉在受體蛋白內，重塑了受體蛋白的表面，為磷酸酶PP2Cs 提供相互作用的結合位點，形成PYR/PYL/RCAR-ABA-PP2C 復合物，從而阻斷了底物進入PP2Cs 的活性位點[5-7]。PP2Cs 是ABA 信號通路的負調節因子，可阻止ABA 信號的傳遞，降低了植物對環境脅迫的耐受性[8-9]。PP2Cs 與ABA 受體的互作，增強了PYR/PYL/RCARs 與ABA 的結合力，其親和力增加了大約10 倍[10-11]，從而減弱PP2C 對下游蔗糖非發酵相關蛋白激酶2（Sucrose non-fermentating1-related protein kinase 2，SnRK2）的抑制作用[5-7]。一些沒有與ABA 結合的PYR/PYL/RCARs 也可以自由與PP2Cs 相互作用，但外源性ABA 顯著增強受體對PP2C 活性的抑制作用[12]。在ABA 信號轉導途徑中，SnRK2s 是一個重要環節，能夠磷酸化下游的轉錄因子和其他蛋白，從而調控植物的逆境反應。擬南芥有38 個SnRKs，分為SnRK1、SnRK2 和SnRK3 三個亞家族[13]，其中，SnRK2 家族有10 個成員。SnRK2s 通過磷酸化bZIP23，介導干旱脅迫反應[14]；通過磷酸化ABI5，介導ABA 調控種子萌發[15]；通過磷酸化ICE1，介導ABA 調控抗寒性的形成[16]。低溫脅迫下，擬南芥內源ABA 含量增加，SnRK2.6/OST1 被激活，從而磷酸化下游ICE1，增強它的轉錄活性和穩定性，提高了植株的抗寒性[16]。又因為JA 也調節ICE1 的轉錄[17]，所以SnRK2.6/OST1 在ABA和JA 信號途徑交互調控植物的ICE-CBF 途徑中起重要作用。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensisMuell. Arg.）（簡稱橡膠樹）原產南美洲亞馬遜河流域，是商業用天然橡膠的主要來源。我國的橡膠樹種植區位于世界熱帶北緣，經常性遭遇的寒流是我國發展橡膠樹種植業面臨的一種主要的非生物逆境。所以選育“高產抗寒”品種一直是我國橡膠樹育種的首要目標。通過60 余年的雜交育種，選育出一批抗寒性強的橡膠樹品種，為研究橡膠樹低溫脅迫抗性形成機制提供了優良材料。橡膠樹無性系‘93-114’是我國自主選育的次生代抗寒品種，尤其是抗平流型寒害的能力強。筆者從橡膠樹無性系‘93-114’的葉片中分離到一個SnRK2 基因家族的一個成員—HbSnRK2.7。為了探索蛋白激酶基因HbSnRK2.7在巴西橡膠樹應對低溫脅迫反應中的作用，采用q-PCR 技術，分析了該基因在外源ABA 處理和低溫脅迫下的表達模式，以及不同抗寒性種質間的表達差異，旨在為進一步鑒定HbSnRK2.7的功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料實驗材料為處于一蓬葉穩定期的橡膠樹抗寒種質‘桂研73-165’、‘GT1’、‘INA873’、‘湛試32-713’、‘93-114’和不抗寒種質‘PB235’、‘熱墾514’、‘熱墾515’、‘海墾1’、‘熱墾501’的芽接苗，該材料于2020 年芽接于中國熱帶農業科學院種苗培育基地。多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（離心柱型）和FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒（去基因組）（天根生化科技有限公司）；熒光定量所需酶（2×TB GreenTM Premix ExTaqTMⅡ）（大連寶生物公司）；其他生化試劑為進口或國產分析純試劑；基因擴增和熒光定量引物（生工生物工程上海股份有限公司）。

1.2 材料處理低溫處理恒溫培養箱（PGR15，COVVILN，加拿大）條件設置為：光照強度為125 μmol·m-2·s-1，光照周期16 h/8 h，溫度為28 ℃，相對濕度為80%。將生長一致且健康的30 株芽接苗置于培養箱，恢復培養2 d，平均分為處理組和對照組，然后將處理組幼苗置于4 ℃的恒溫培養箱中，其他設置條件不變，分別在0 、2 、4 、8、12、24 h 時間點收集葉片，每個時間點選擇15 株幼苗，每株幼苗采集1 片樹葉，等量5 片樹葉制成1 個混合樣，每個時間點制成3 個混合樣，對照同樣采集樣品。用0.1 mmol·L-1ABA 噴施整株幼苗，然后置于28 ℃的恒溫培養箱中繼續培養，分別在0、2、4、8、12 和24 h 時間點收集葉片，每個時間點選擇15 株幼苗，每株幼苗采集1 片樹葉，等量5 片樹葉制成1 個混合樣，每個時間點制成3 個混合樣[18]。ABA 處理和低溫處理共用對照。采集的樣品迅速置于液氮中，用于提取總RNA。分別采集一蓬葉穩定期的橡膠樹種質‘桂研73-165’、‘GT1’、‘INA873’、‘湛試32-713’、‘93-114’、‘PB235’、‘熱墾514’、‘熱墾515’、‘海墾1’、‘熱墾501’芽接苗的樹皮，每個種質采集5 株幼苗制成1 個混合樣品，3 個生物學重復，迅速置于液氮中，用于提取總RNA。

1.3 總RNA 的提取與cDNA 的合成按照多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒說明書提取樣品的總RNA。按照cDNA 合成試劑盒的說明書合成cDNA。然后置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.4 基因HbSnRK2.7的克隆從轉錄組[19]中，篩選1 個有差異表達的 Unigene，注釋為SnRK2家族成員，通過橡膠樹基因組數據庫[20]，獲得該基因cDNA 序列。借助NCBI 比對分析，確定該基因為HbSnRK2.7，并獲得完整的基因開放閱讀框序列。依據HbSnRK2.7的開放閱讀框序列，設計引物(表1)，擴增基因開放閱讀框全長。利用 RTPCR 技術，從橡膠樹‘93-114’葉片中擴增出基因HbSnRK2.7的開放閱讀框全長。RT-PCR 擴增體系為 50 μL，高保真酶 25 μL、引物HbSnRK2.7-FL-F 和HbSnRK2.7-FL-R 各1 μL、模板1 μL、ddH2O 添加至50 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環；72 ℃再延伸5 min。然后1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收，連接轉化，挑陽性菌落，送廣州艾基生物技術公司進行測序驗證。

表1 橡膠樹基因HbSnRK2.7 擴增引物和熒光定量引物

1.5 HbSnRK2.7生物信息學分析通過DNAMAN V9 軟件對HbSnRK2.7進行多重序列比對、基因序列翻譯、蛋白質分析等方面的分析。通過Expasy 軟件對HbSnRK2.7蛋白的分子量和等電點進行分析。通過MEGA5.10 軟件對HbSnRK2.7的氨基酸序列進行進化樹分析。通過NetPhos 3.1 軟件分析HbSnRK2.7的磷酸化位點。

1.6 q-PCR 分析利用CFX384 實時熒光定量PCR 系統（Bio-Rad，加利福尼亞，美國）進行q-PCR 實驗。依據基因豐度，將cDNA 稀釋10 倍作為q-PCR 模板。實驗反應體系和方法參照文獻 [18]。內參基因為HbActin7a和HbRH8?；騂bSnRK2.7熒光定量引物和內參引物見表1。HbSnRK2.7 相對表達量通過2-△△Cq法進行分析[21]。

1.7 數據處理采用t-test 方法對基因相對表達量進行差異顯著性分析(P＜0.05 為顯著性差異；P＜0.01 為極顯著差異)。

2 結果與分析

2.1 橡膠樹HbSnRK2.7基因的克隆與生物信息學分析在HbSnRK2.7閱讀框的兩端設計引物，通過RT-PCR 技術及核苷酸測序技術，以橡膠樹‘93-114’的cDNA 為模板，克隆了HbSnRK2.7基因的完整閱讀框（圖1）。HbSnRK2.7 包含364 個氨基酸，預測的分子量和等電點分別為41.39 kD 和4.70。HbSnRK2.7與擬南芥（Arabidopsis thalianaL Heynh.）AtSnRK2.2、AtSnRK2.3、黃瓜（Cucumis sativusL.）CsSnRK2.2、 葡萄（Vitis viniferaL）VvSnRK2.3的核苷酸序列的同源性分別為73.39%、74.98%、80.87%和77.99%。HbSnRK2.7氨基酸序列與黃瓜CsSnRK2.2、葡萄VvSnRK2.3、蓖麻（Ricinus communisL）RcSnRK2.2、玉米（Zea maysL）ZmSnRK2.2 的氨基酸序列同源性分別為90.96%， 84.07%， 65.11%和67.58%。雖然氨基酸序列同源性有一定差異，但是它們具有保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域（結構域Ⅰ），可催化磷酸基從ATP 轉移到蛋白質底物上的絲氨酸/蘇氨酸殘基上（圖2）。另外，它們都有結構域Ⅱ、結構域Ⅲ和結構域Ⅳ。結構域Ⅱ是HbSnRK2.7 響應非生物脅迫所需的結構域；結構域Ⅲ緊挨結構域Ⅱ，位于蛋白的C 端，是ABA 依賴的HbSnRK2.7激活所需結構域；結構域Ⅳ位于結構域Ⅰ內，HbSnRK2.7 蛋白的N 端，是與ATP 結合的保守結構域（圖2）。結構域的保守性表明它們可能具有相似的生物學功能。通過NetPhos 3.1 軟件分析HbSnRK2.7 的磷酸化位點，結果顯示HbSnRK2.7含有13 個絲氨酸、5 個蘇氨酸和4 個酪氨酸磷酸化位點，大部分磷酸化位點集中在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域（圖2）。聚類結果顯示，橡膠樹HbSnRK2.7 與擬南芥AtSnRK2.2、AtSnRK2.3、黃瓜CsSnRK2.2、葡萄VvSnRK2.3 等屬于SnRK2亞家族的第Ⅲ組（圖3）。

圖1 橡膠樹HbSnRK2.7 基因的閱讀框及其推導的氨基酸序列

圖2 橡膠樹HbSnRK2.7 蛋白與其他植物的SnRK2 蛋白結構及其磷酸化位點

圖3 橡膠樹HbSnRK2.7 蛋白與其他植物的SnRK2 蛋白的系統進化樹分析

2.2 外施ABA 和低溫脅迫對橡膠樹HbSnRK2.7基因表達的影響ABA 處理下，抗寒橡膠樹‘93-114’樹皮中的HbSnRK2.7基因呈下調表達趨勢。在ABA 處理2 h 時，HbSnRK2.7的表達量稍微變動，沒有顯著差異。處理4 h 時，HbSnRK2.7已極顯著下調表達，在處理8 h 時，表達量下調到最低點。在處理12 h 和24 h 時，HbSnRK2.7表達量稍微上調且趨于穩定，但是其表達量仍顯著低于ABA處理0 h 時的表達量。低溫脅迫下，HbSnRK2.7基因在橡膠樹‘93-114’中的表達呈下調趨勢。在低溫脅迫2 h 時，HbSnRK2.7的表達量極顯著降低。低溫脅迫4 h 和8 h 時，HbSnRK2.7繼續下調表達，在低溫脅迫12 h 時，表達量上調，但極顯著低于低溫脅迫0 h 的表達量。低溫脅迫24 h 時，HbSnRK2.7表達量下調到最低，是低溫脅迫0 h 的表達量的1/2（圖4）。

圖4 ABA 和低溫脅迫對橡膠樹HbSnRK2.7 基因表達的影響

2.3 橡膠樹HbSnRK2.7基因在抗寒種質和不抗寒種質中的表達分析橡膠樹HbSnRK2.7在不抗寒種質‘熱墾515’中的本底表達最高，在抗寒種質‘桂研73-165’中的本底表達最低。在不抗寒種質‘PB235’、‘熱墾514’、‘熱墾515’、‘海墾1’和‘熱墾501’中的整體表達量顯著高于抗寒種質‘桂研73-165’、‘GT1’、‘INA873’、‘湛試32-713’和‘93-114’中的表達量（圖5）。

圖5 橡膠樹HbSnRK2.7 在不同抗寒種質中的表達

3 討 論

本研究利用RT-PCR 技術從橡膠樹‘93-114’中分離鑒定了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶HbSnRK2.7基因，橡膠樹HbSnRK2.7基因與草本植物擬南芥AtSnRK2.2、AtSnRK2.3、黃瓜CsSnRK2.2、木本植物葡萄VvSnRK2.3的同源性較高，核苷酸序列的一致性在73%以上，氨基酸序列的一致性在65%以上。它們具有共同的保守絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域[22-24]，同源性比較高，該結構域是SnRK2 蛋白磷酸化功能的核心催化中心，其中包含ATP 結合結構域，可催化磷酸基從ATP 轉移到蛋白質底物上的絲氨酸/蘇氨酸殘基上，使底物磷酸化[25]。SnRK2s 參與了植物對非生物脅迫和脫落酸（ABA）依賴的植物發育的響應。SnRK2 亞家族分為3 個組：組Ⅰ中的蛋白激酶是不被ABA 激活的；組Ⅱ中的蛋白激酶不被ABA 激活或被ABA 微弱激活，取決于植物種類；組Ⅲ中的蛋白激酶強烈響應ABA 誘導[22]。HbSnRK2.7屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的SnRK2 亞家族的組Ⅲ成員，具有ABA 激活所需結構域，推測HbSnRK2.7能夠響應ABA 的刺激反應。另外，HbSnRK2.7還具有響應非生物脅迫所需的結構域，推測HbSnRK2.7能夠響應非生物脅迫反應。磷酸化位點主要集中在HbSnRK2.7的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域，磷酸化/去磷酸化調控了HbSnRK2.7對底物的磷酸化活性。

植物在遭受干旱、低溫、高鹽等環境脅迫時，其內源激素ABA 迅速合成和積累，在植物應對環境脅迫中起著重要作用[1-2]。SnRK2s 蛋白激酶是ABA 信號途徑的關鍵環節，介導依賴ABA 的非生物脅迫反應[26-27]。擬南芥AtSnRK2.2、AtSnRK2.3響應ABA 刺激反應，呈下調表達趨勢[28-30]。HbSnRK2.7與黃瓜CsSnRK2.2核苷酸序列的同源性為80.87%，CsSnRK2.2響應ABA 誘導下調表達[23]。HbSnRK2.7與葡萄VvSnRK2.1核苷酸序列的同源性為75.08%，VvSnRK2.1同樣響應ABA 誘導下調表達[31]。HbSnRK2.7與擬南芥AtSnRK2.2、AtSnRK2.3、黃瓜CsSnRK2.2、葡萄VvSnRK2.1的表達模式一致，受ABA 誘導下調表達。推測HbSnRK2.7 可能在ABA 信號轉導途徑中起著負調控的作用。然而與HbSnRK2.7同屬于亞家族Ⅲ的水稻SAPK8、SAPK9和SAPK10受ABA 誘導上調表達[32]，暗示即使同一亞家族的成員，在不同的物種對于ABA 刺激的響應也存在差異。

SnRK2s 是ABA 信號途徑的重要環節，參與植物低溫脅迫反應[33]。擬南芥AtSnRK2.6受低溫脅迫上調表達，激活的AtSnRK2.6 磷酸化ICEs，干擾了E3 連接酶HOS1 與ICEs 的互作，從而抑制了ICEs 經26S 蛋白酶體的降解，增強其穩定性和轉錄活性，提高植物的抗寒性[16]。橡膠樹HbSnRK2.6A/B/C 受ABA 和低溫誘導上調表達，且通過調控抗寒關鍵因子HbICE2 的轉錄活性，參與ABA 調控橡膠樹響應低溫脅迫[34]。本研究克隆的橡膠樹HbSnRK2.7對ABA 處理和低溫脅迫的響應與HbSnRK2.6s相反，該基因既在ABA 處理下顯著下調表達，又受低溫脅迫顯著下調表達，而且在不抗寒種質中的表達量顯著高于抗寒種質，表明橡膠樹HbSnRK2.7可能作為負調控因子，介導ABA 依賴的橡膠樹低溫脅迫抗性的形成。與HbSnRK2.7同源性比較高的玉米ZmSnRK2.2[35]、葡萄VvSnRK2.1、VvSnRK2.3[36]在低溫脅迫下呈下調表達模式。鵝掌楸（Liriodendron chinense）SnRK2 家族2 個成員（Lchi00543和Lchi01348）受ABA 和低溫誘導同樣下調表達[37]。HbSnRK2.7類似的基因都是對應物種SnRK2 家族的極少數成員，與其他受ABA 和低溫正向調控的多數成員不同[38]。因此，這些基因可能作為負調控因子在植物響應低溫脅迫中起著特殊的作用。