不同培養溫度的魚源海豚鏈球菌轉錄組分析

賈新蕾，黃增朝，楊林狄，呂 靜，李妍萍，簡紀常，黃郁蔥

（1. 廣東海洋大學 水產學院/廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室，廣東 湛江 524088;2. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524006）

海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）是一種重要的水生動物致病菌，1976 年Pier 等[1]從亞馬遜江豚（Inia geoffrensis）中首次分離獲得，之后陸續發現它可感染除南極洲以外的所有魚類[2]。我國也有海豚鏈球菌感染卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）[3 - 4]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[5-6]、鱘魚（Acipenser sinensis）[7 - 8]、銀鼓魚（Selenotocamultifasciata）[9]、小黃魚（Larimichthys polyactis）[10]、黃鰭鯛（Acanthopagrus latus）[11]等發病的相關報道。海豚鏈球菌具有感染宿主范圍廣、傳染性強、導致死亡率高等特點，給養殖業造成巨大的經濟損失，并受到了國內外水產行業工作者的高度關注。

海豚鏈球菌病的暴發除了與病原菌本身的毒力有關，一些環境因子在疾病發生發展過程中亦發揮重要作用，如溫度、pH 值等[12]，尤其是養殖的環境溫度與該病的發生呈現比較明顯的相關性，發病時水溫通常在27 ℃以上[13]。祝璟琳等[14]開展的流行病學研究表明，在32 ℃以上的溫度下羅非魚更容易爆發鏈球菌病，羅非魚免疫力在高溫條件下受到明顯的抑制[15]，鏈球菌對宿主的粘附、定植、入侵和抵抗免疫清除能力明顯增強[16 - 17]。同時，較高溫度時海豚鏈球菌產生的胞外產物中可能含有較多致病因子，從而影響細菌毒力[18]，尼羅羅非魚在感染海豚鏈球菌后其肝臟、腎臟在高溫時病理損傷更嚴重[19]。以上研究均表明在較高的溫度下病原鏈球菌的毒力顯著增強，從而引起鏈球菌病的爆發。

轉錄組測序（RNA-Seq）技術是一項能夠檢測有機體整體轉錄水平的新興技術手段，目前已有學者利用轉錄組技術研究細菌的毒力調控。如：Li 等[20]利用RNA-seq 技術分析了提高溫度和營養成分對副溶血性弧菌毒力的影響，結果發現溫度和營養成分的提高可顯著提高副溶血性弧菌的毒力；王松艷[21]對不同溫度下培養的無乳鏈球菌進行轉錄組測序，篩選出7 個毒力相關基因；師若萍[22]運用高通量RNA 測序和非靶向代謝組學的研究方法，探究大腸桿菌在不同溫度下的生長及其在轉錄和代謝水平的變化，了解其對于不同溫度的生理調節機制，以上研究結果表明溫度可廣泛影響細菌毒力和基因的表達。但目前尚未見溫度對海豚鏈球菌致病性的影響以及其基因轉錄表達的研究報道。卵形鯧鲹是我國海水養殖魚類中產量位居第二的優良品種，高溫期易暴發海豚鏈球菌病[3-4]。本研究以卵形鯧鲹源海豚鏈球菌Tozj-1為研究對象，選用RNA-Seq 技術對不同溫度（25 ℃和35 ℃）培養的海豚鏈球菌進行高通量測序分析，篩選差異表達基因，對差異表達基因進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，探究溫度對海豚鏈球菌基因轉錄表達的影響及富集的功能和信號通路，以期為揭示溫度與海豚鏈球菌致病性積累基礎數據，為后續進一步研究海豚鏈球菌的致病機理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料本研究測序和試驗用菌株Tozj-1來源于廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室。Tozj-1為實驗室于2020 年8 月從廣東省湛江市某深海網箱養殖的患病卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）分離獲得。分離的菌株經16S rRNA 測序、生理生化鑒定為海豚鏈球菌（S.iniae），通過人工感染卵形鯧鲹確認其為病原菌，并保存于廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室。

1.2 方法

1.2.1 生長曲線測定將Tozj-1菌株劃線接種于BHI 固體培養皿上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養24 h。用無菌接種環挑取單個菌落接種于新鮮的無菌BHI 液體培養基，于28 ℃，120 r·min-1下振蕩過夜擴大培養。將上述菌液以1∶50（V/V）的比例接種到無菌的BHI 培養基，分別置于25 ℃和35 ℃恒溫搖床，150 r·min-1振蕩培養，每個溫度下設置3 個重復。每隔1 h 取樣，測定菌液的吸光值（OD600），并繪制不同溫度下的海豚鏈球菌生長曲線。

1.2.2 人工回歸感染試驗為了探究不同溫度對卵形鯧鲹源海豚鏈球菌毒力的影響，本研究使用卵形鯧鲹進行體內攻毒試驗。實驗前，將28 ℃擴大培養的海豚鏈球菌以1∶50（V/V）的比例接種到新鮮BHI 培養基中，分別置于25、35 ℃恒溫搖床中培養至對數生長期（OD600=0.9～1.1），收集菌體，用無菌PBS 緩沖液將菌液稀釋至1.0×107CFU·mL-1備用。

將360 尾健康的卵形鯧鲹[體質量（50±6）g·尾]隨機分為4 組（2 個實驗組和2 個對照組），每組設3 個重復，每個重復30 尾魚。25 ℃實驗組于水溫25 ℃飼養，每尾腹腔注射25 ℃體外培養的Tozj-1菌懸液，對照組注射無菌PBS；35 ℃實驗組于水溫35 ℃飼養，每尾腹腔注射35 ℃體外培養的Tozj-1菌懸液，對照組注射等量無菌PBS。觀察攻毒后14 d 內試驗魚的發病情況，記錄并統計死亡魚數量，通過解剖瀕臨死亡魚并進行病原分離鑒定，以確定感染病原，鑒定方法同1.1。

1.2.3 總RNA 提取、cDNA 文庫構建和高通量測序將28 ℃下培養的菌株Tozj-1以1∶50（V/V）的比例稀釋于新鮮BHI 肉湯中，分別于35 ℃和25 ℃條件下培養至對數生長期（OD600=0.9～1.1）。每個溫度設置3 個生物學重復。其中，以25 ℃培養的海豚鏈球菌作為對照組，標記為CK-1、CK-2、CK-3；以35 ℃培養的海豚鏈球菌作為實驗組，標記為Test-1、Test-2、Test-3。每個樣品取1 mL 菌液，12 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入100 μL 溶菌酶，混勻，置于37 ℃裂解15 min，按照Trizol 試劑盒操作說明進行菌體的總RNA 抽提，使用Agilent 2100 生物分析儀評估RNA 質量并通過RNase free 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，經質量檢測合格后純化總RNA，cDNA 文庫構建和轉錄組測序工作委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.2.4 原始數據質控與差異表達基因分析原始數據的存儲采用FASTQ 格式，通過fastp[23]（https://github.com/OpenGene/fastp）對下機數據進行質量檢測和數據過濾，去除原始數據中質量低、接頭污染、全部都是A 堿基以及未知堿基N 含量過高的Reads 后最終獲得Clean reads。利用工具Bowtie 2[24]建立參考基因組索引，將質控分析后的高質量測序數據比對到海豚鏈球菌參考基因組SF1（GenBank 登錄號CP005941.1）上。采用FPKM 法計算每個注釋基因的表達水平，使用FDR 與log2FC 來篩選差異基因，篩選條件為FDR＜0.05 且|log2FC|＞1。

1.2.5 聚類分析根據每組篩選的差異表達基因，使用R 語言Pheatmap 軟件包對差異基因進行雙向聚類分析。首先，得到的差異表達基因在GO（The Gene Ontology）數據庫中的各個項目進行映射，然后通過GO 功能顯著性富集分析[25]，在宏觀上了解該物種的基因功能分布特征。然后，基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫，對每個KEGG pathway 不同層次上存在的差異表達基因數量進行統計，確定這些差異表達基因的主要代謝路徑和信號通路[26]，進一步了解基因的生物功能。最后，利用超幾何學方法，以Qvalue≤0.1 的Pathway 作為在差異表達基因中顯著富集的Pathway。

1.2.6 差異表達目標基因的qRT-PCR 驗證為了驗證海豚鏈球菌轉錄組數據的可靠性，將差異表達基因與毒力因子數據庫（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB）進行比對，篩選出22 個與毒力相關的差異表達基因，使用primer 5.0 軟件設計特異性定量引物（基因名稱和引物序列見表1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據cDNA 反轉錄試劑盒的使用說明書將質檢合格的總RNA 反轉錄為cDNA，應用實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR,qPCR）技術對其進行轉錄水平的驗證，qPCR 反應程序為95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共計40 個循環結束，60 ℃讀取熔解曲線。以16S rRNA 基因為內參基因，采用2-ΔΔCt方法分析計算各毒力基因的相對表達量。

表1 檢測海豚鏈球菌毒力基因的qRT-PCR 特異性引物

2 結果與分析

2.1 不同溫度下海豚鏈球菌的生長曲線海豚鏈球菌在本試驗的2 個培養溫度下，35 ℃生長速度明顯快于25 ℃，能夠快速進入生長對數期，35 ℃在3 h 左右即達到對數生長期，25 ℃在9 h 左右才達到對數生長期。到達生長平臺期后，35 ℃的吸光值略高于25 ℃的吸光值。當吸光值OD600在1.0 左右時，2 個培養溫度的海豚鏈球菌均處于對數生長期（圖1）。

然而目前職業學校，很多家長的文化程度本身較低，對孩子的教育重視程度不夠。而且很多家長忙于生計，工作時間較長，經常會說“我不會教育”，“我管不了孩子”，“我沒時間”。對于這樣的家長，我覺得必須幫助他們認識到一個問題，那就是任何事業的成功，都不能彌補孩子教育的失敗。忙，不是借口；不會，不是理由?！盎畹嚼?，學到老”，父母也應該學習在當今時代如何與孩子溝通，如何陪伴孩子的成長。

圖1 海豚鏈球菌在不同培養溫度下的生長曲線

2.2 人工感染試驗結果不同溫度人工感染結果顯示（圖2），35 ℃時，在感染后1～3 d 卵形鯧鲹即出現大量死亡，之后死亡量逐漸趨于穩定，第5 天停止死亡，患病卵形鯧鲹死亡前出現游泳異常、眼球突出、鰭條基部充血等癥狀，病原菌經分離培養，16S rRNA 鑒定為海豚鏈球菌。25 ℃時，卵形鯧鲹在感染后3 天內未出現死亡，第4 天開始出現少量死亡，死亡率較低，第7 天停止死亡。海豚鏈球菌在水溫35 ℃和25 ℃造成的卵形鯧鲹的累積死亡率分別為81.11%和12.23%，PBS 對照組均未出現死亡。

圖2 環境溫度對卵形鯧鲹海豚鏈球菌病死亡率的影響

2.3 總RNA 的提取提取培養至對數生長期（OD600=0.9～1.1）的海豚鏈球菌的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3 所示，28 S 和18 S 的條帶清晰無彌散，RNA 完整性好，無降解。核酸蛋白檢測儀測定結果顯示樣品的A260/A280比值在2.0 左右，濃度為400～700 ng·μL-1，RNA質量符合轉錄組測序的要求。

圖3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測海豚鏈球菌Tozj-1 株總RNA

2.4 樣品相關性分析本試驗中每個溫度設有3 個生物學重復，其中CK-1、CK-2、CK-3 分別表示25 ℃的3 個平行樣品，Test-1、Test-2、Test-3 分別表示35 ℃的3 個平行樣品。如圖4 所示，同一溫度的3 個平行樣品相關性系數在0.998 0以上，表明來自3 個重復性試驗的轉錄組數據具有高度可重復性，可用于后續分析。

圖4 樣品相關性分析熱圖

2.5 數據過濾與質量評估Illumina 測序得到的數據經過質量檢測和數據過濾，最終獲得Clean reads，各樣本的Clean reads 與Raw reads 的Q20和Q30 分別達到了97%和93%以上，GC 含量在各樣本中較為一致，為40.19%～41.22%（表2）。以上數據均表明轉錄組測序的數據良好，可以用于后續進一步分析。

表2 過濾前后堿基信息統計

2.6 差異表達基因的分析使用Bowtie 2 軟件將6 個轉錄組數據映射到海豚鏈球菌SF1 基因組，結果顯示，所有樣品數據皆可映射到基因組上，并且這些樣本的映射率均在98%以上（表3）。說明該轉錄組數據可靠，可以用于后續的試驗分析。差異表達基因結果如圖5 所示，共篩選到927 個顯著差異表達基因，其中820 個上調表達，107 個下調表達。

圖5 差異基因統計火山圖

表3 原始數據比對到基因組

2.7 差異表達基因的GO 功能富集分析對獲得的差異表達基因進行GO 注釋分析，共得到1 611 個GO 功能注釋，其中生物學過程（biological process）959 個、細胞組分（cellular component）446 個和分子功能（molecular function）570 個。如圖6 所示，差異基因注釋在生物學過程有關的GO terms 數量最多，共計12 個，主要有代謝過程（metabolic process）、細胞過程（cellular process）和單一有機過程（single-organism process）等；其次是與分子功能有關的terms，共計8 個，主要有催化活性（catalytic activity）、結合（binding）等；與細胞組分有關的terms 最少，為7 個，主要有細胞（cell）、細胞成分（cell part）和膜（membrane）等。海豚鏈球菌代謝過程、細胞過程、單一有機過程、結合過程和催化活性這幾個亞類包含的差異基因比較多，它們均受溫度調控。

圖6 CK 與Test 差異基因GO 分類

2.8 差異表達基因的KEGG 富集分析將2 個樣本的差異基因進行KEGG 富集分析，結果顯示，820 個上調表達基因中有289 個基因可以富集到KEGG 的98 條pathways，其中顯著富集的pathways有5 個。這些顯著上調的基因主要與信號轉導、跨膜轉運和毒力因子表達有關，包括ABC 轉運、核糖體通路、群體感應、脂肪酸代謝和合成通路（圖7-a）。除此之外，還包括少量與葉酸和淀粉蔗糖代謝的相關基因。值得注意的是，這些顯著上調的pathways 中有許多重復出現的基因（表4），特別是srtF基因（K710_0263）在ABC 轉運、群體感應系統和雙組份調控通路中均上調表達。

圖7 差異表達基因的KEGG 富集分析（35 ℃相對于25 ℃）

表4 同時參與多條通路的上調表達基因

2.9 轉錄組數據的qRT-PCR 驗證為了評估轉錄組數據的可靠性，隨機篩選22 個差異表達的重要毒力基因，采用實時熒光定量PCR 的方法檢測毒力基因的轉錄水平，每個基因設置3 次生物學重復，以保證數據的準確性，結果如圖8 所示。2 種檢測方法經SPSS 軟件的相關性分析，相關系數達到了0.824，相關極顯著（P＜0.001），說明qRTPCR 驗證結果與RNA-Seq 數據具有較好的一致性，并且基因表達變化的趨勢基本相同，進一步驗證了轉錄組數據的可靠性。

圖8 海豚鏈球菌在25 ℃和35 ℃條件下毒力相關基因的相對表達量

2.10 溫度與毒力因子基因表達的相關性根據文獻[27- 28]以及VFDB 數據庫的篩選，發現約58 個當前已知或預測的海豚鏈球菌毒力因子。由表5 可知，上調表達的毒力因子有46 個，特別是溶血素（SagI）、黏附素（fap1）、轉錄調節因子（cysB、galR）和C5α 肽酶（scpB）等重要的毒力因子，在35 ℃培養條件下毒力因子基因的表達量與25 ℃培養條件下相比明顯升高（log2FC＞1.6）；下調表達的毒力因子基因相對較少，僅有12 個（表6），其中包含海豚鏈球菌毒力標志基因simA。

表5 上調表達的細菌毒力因子

表6 下調表達的細菌毒力因子

3 討 論

溫度是影響細菌毒力的重要環境因子。由病原菌引發的魚類疾病的暴發往往與水溫有著極為緊密的關聯性。郭富強等[29]的研究結果表明，隨著水溫的不斷升高羅非魚感染無乳鏈球菌的累積死亡率也隨之升高，在33 ℃死亡率最高；劉志剛等[17]發現無乳鏈球菌感染羅非魚在37 ℃死亡率最高；Zamri-Saad 等[30]認為鏈球菌水溫在32～37 ℃時易出現高發病率和高死亡率，而水溫26 ℃以下時較少發病。在本研究中，人工回歸感染試驗結果表明，卵形鯧鲹感染海豚鏈球菌后在35 ℃下的死亡率高達81.11%，而在25 ℃下的死亡率僅為12.23%，2 個溫度的PBS 對照組均未出現死亡，說明海豚鏈球菌在35 ℃時毒力更強，導致宿主死亡率更高，發病癥狀更為明顯。同時，本課題組在卵形鯧鲹鏈球菌病的流行病學調查研究中發現，卵形鯧鲹在25 ℃以下幾乎不感染發病，在30～35 ℃時死亡率較高。因此，本研究設置25 ℃培養的海豚鏈球菌作為對照組，35 ℃培養的海豚鏈球菌為實驗組，探究其在不同溫度下基因轉錄水平上的差異表達，揭示溫度對海豚鏈球菌毒力基因的影響。

在本研究中，當設置FDR＜0.05 且|log2FC|＞1時，與25 ℃培養的海豚鏈球菌相比，35 ℃培養的海豚鏈球菌顯著上調的基因有820 個，而顯著下調的基因只有107 個。從整體來看，在較高的培養溫度下（35 ℃）菌株大多數基因處于上調狀態，菌株表現為更加“活躍”的狀態，而在較低的溫度下（25 ℃）菌株大多數基因則顯著下調，菌株顯得相對不那么“活躍”，具體表現為與糖類、碳類的代謝相關的基因顯著下調，而與細菌毒力相關的基因則顯著上調。Mereghetti[31]等在研究無乳鏈球菌全基因轉錄組測序時也有類似的發現，編碼毒力的相關基因在40 ℃時上調表達，而處于生長穩定期的大量的新陳代謝相關基因在30 ℃時上調表達。

ABC 轉運蛋白是已知的最大蛋白家族之一，并在細菌中廣泛存在，其將ATP 水解與各種底物（例如蛋白質、脂質、肽、固醇、糖、離子及藥物）的主動運輸結合在一起[32-33]，這將導致細胞質膜兩側的物質頻繁交換。在本研究中，海豚鏈球菌在35 ℃時ABC 轉運通路相關的基因顯著上調，說明35 ℃海豚鏈球菌可能涉及各種物質參與的能量交換，以及物質的合成與代謝。群體感應是一種協同調節系統，它以一種被稱為AIP（autoinduc ing peptide）的自誘導肽作為信號分子，通過感知菌群密度和環境因子的變化，并把周圍的環境信息傳遞到雙組份系統當中，再由雙組份系統對相關基因進行表達調控[34]。一些AIP 的前體肽在核糖體中合成，但是AIP 無法自由地穿透細胞壁，因此必須通過ABC 運輸系統或其他的膜通道蛋白進入胞外發揮作用。因此部分上調表達的基因同時參與了ABC 轉運通路、雙組份信號系統通路、群體感應通路、脂肪酸代謝和合成通路當中的2～3 個通路，特別是顯著上調的srtF（K710_0263）基因同時參與了3 個通路的表達調控，具有重要的研究意義。研究發現，srtF屬于C 類sortase 家族，主要作用是在細菌表面形成菌毛并將其固定在細胞壁上，與細胞黏附、定植、生物膜形成等環境過程相互作用[35]。

在下調表達基因中比較典型的是雙組份系統中編碼檸檬酸合酶（Citrate lyase）相關的基因（K710_0369、K710_0374、K710_0375、K710_0379和K710_1345），由此表明，在35 ℃時，Tozj-1菌株的三羧酸循環被抑制，對葡萄糖的代謝能力明顯降低，而在25 ℃相對較低的環境溫度中，其對葡萄糖的代謝能力表現良好。這與胡文婷[16]研究的無乳鏈球菌和劉韜[36]研究的魯氏耶爾森菌結論一致，低溫更有利于病原菌葡萄糖的代謝。并且在35 ℃時，與磷酸轉移酶系統、果糖和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝相關的基因顯著下調，這證明糖類、碳類的代謝更適合在較低溫度下進行。

病原菌的致病過程與毒力因子的共同介導作用密切相關。海豚鏈球菌幾種重要的毒力因子包括M 蛋白、磷酸葡萄糖苷酶（pgmA）、溶血素S、C5α 肽酶、脫乙?；?、CAMP 因子。M 蛋白[37]是一種可以通過莢膜延伸到菌體表面形成菌毛的蛋白，它在細菌粘附、感染、抵御吞噬等方面起關鍵作用；磷酸葡萄糖苷酶（pgmA）[38]促進細胞壁和莢膜的生物合成，并能抵抗正電性抗菌肽；溶血素S[39- 40]能破壞宿主紅細胞、單核細胞和粒細胞，有可能對腦血管造成損傷；C5α 肽酶能水解中性粒細胞化學誘導物補體因子C5α，從而破壞宿主細胞的抗侵襲能力；脫乙?；竅41]能夠提高病原菌對溶菌酶的耐受性，逃避宿主免疫，黏附并入侵宿主的上皮細胞；CAMP 因子[42]通過與FC 區域的免疫球蛋白結合，從而有助于攔截抗體向補體呈遞抗原。這些毒力因子相互作用協助S.iniae侵入宿主，逃避宿主的免疫防御。在本研究中，不同溫度下培養的海豚鏈球菌，其毒力因子呈差異表達，在35 ℃時，除了溶血素、黏附素、轉錄調節因子等毒力因子轉錄上調之外，抗逆因子和一些酶類基因的轉錄表達量也大幅上升，只有少量的毒力因子下調表達。劉志剛等[17]、王松艷[21]和郭富強[29]對無乳鏈球菌的研究亦發現類似的結果。以上相關研究結果均表明，高溫有助于海豚鏈球菌毒力相關基因表達，導致其毒力增強，有助于其黏附、定植、入侵、胞內存活和擴散等致病過程，引起宿主發病。

本研究結果初步證實溫度能夠廣泛影響海豚鏈球菌基因的轉錄水平，進而調控海豚鏈球菌的致病性，為進一步研究海豚鏈球菌的致病機理提供理論依據，但其調控機制仍需要進一步研究加以闡明。