丹參多酚酸鹽調控NF-κB信號通路對冠心病大鼠心肌細胞凋亡的影響 *

彭興華 李章紅 羅 列

（贛州市人民醫院心臟外科，江西 贛州 341000）

冠心病是臨床常見的心血管疾病，由冠狀動脈粥樣硬化引起的血管狹窄和阻塞所致。最常見的特征是心肌供血不足從而致使心臟缺血缺氧，甚至會導致一些心肌細胞的死亡［1］。該病嚴重威脅著患者的生命健康安全，更有甚者會導致猝死。近年來，中醫技術發展迅速，在治療冠心病方面，其效果在一定程度上較西醫更好［2］。目前，一些學者［3］發現，丹參中可以提取出一種名為丹酚酸鹽的成分，它可抵抗氧化自由基、抵抗血栓形成，對心血管系統有著較好的保護作用。此外，NF-κB通路是一種炎癥信號，是一種既能穩定心臟內環境，又能介導致病特異性反應的轉導途徑［4］。但并未有研究指出丹參多酚酸鹽可以調控NF-κB 通路對冠心病心肌細胞凋亡有影響。因此，本研究就丹參多酚酸鹽對冠心病大鼠心肌細胞凋亡的影響及機制進行探討，以期為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組選取60 只健康雄性SD 大鼠，體質量260 g 左右，飼養于無菌環境中（溫度：27 ℃左右；濕度：55%左右），自由進食，適應性喂養1 周后進行實驗。將其隨機分為對照組、模型組、陽性對照組、丹參多酚酸鹽低劑量組、丹參多酚酸鹽中劑量組、丹參多酚酸鹽高劑量組，每組10只。

1.2 實驗藥品高脂飼料（江蘇協同生物工程有限責任公司，20210712），垂體后葉素（南京新百藥業有限公司，150902），注射用丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，國藥準字Z20050247），瑞舒伐他汀鈣片（浙江海正藥業股份有限公司，H20143339）。

1.3 實驗試劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（武漢塞維爾生物科技有限公司，G1017），蘇木精染色液（北京雷根生物科技有限公司，DH0041），ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，20200516），生理鹽水（石家莊四藥有限公司，1901023203），超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（上海邦奕生物科技有限公司，20201023），丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，20200504），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，P0012），脫脂奶（美國BD 公司，232100），鼠抗NF-κB p65、NF-κB 抗體、β-actin 抗體（北京博奧森生物技術公司，bs-23216R、bs-3543R、bs-0061R），PCR檢測試劑盒（艾科瑞生物工程有限公司，AG11708-S）。

1.4 實驗方法通過喂食高脂肪飲食并腹腔注射垂體后葉素建立模型。在連續6 周每天喂食高脂飼料后，每隔24 h 腹腔注射30 μg/kg 垂體后葉素，連續3 次。丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組分別給予50、150 和450 mg/L注射用丹參多酚酸鹽，陽性對照組給予10 mg/kg 瑞舒伐他汀鈣片，對照組采用常規飲食。

1.5 檢測指標

1.5.1 心肌梗死面積測定處死大鼠取出心臟并切片，未染色的組織為危險區（AAR），分離后稱重并在TTC溶液中孵育。染色后，正常心肌組織變為磚紅色，而梗死心肌組織（IS）為灰白色。分離、稱重IS，并計算IS/AAR以反映心肌梗死的大小。

1.5.2 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡情況收集的組織用石蠟包埋、切片并用蘇木精染色。然后在磷酸鹽緩沖液（PBS）中浸泡和洗滌2 次，向切片中加入50 μL TUNEL 反應混合物，后用PBS 洗滌3 次，并在倒置顯微鏡下觀察組織細胞的凋亡情況，并計算凋亡率。

1.5.3 ELISA檢測心肌組織中炎性因子含量取心肌組織制備成勻漿，在4 ℃下以3000 r/min 離心10 min（離心半徑8.5 cm）。收集上清液，用ELISA 試劑盒檢測上清液中白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。

1.5.4 檢測心肌組織SOD、MDA含量在預冷的生理鹽水中沖洗心肌組織，去除血液，用手術剪刀切斷心肌組織塊，并轉移至勻漿管，制成組織漿。3000 r/min 離心10 min（離心半徑8.5 cm）后，取上清液，根據每個試劑盒的說明檢測心肌組織的SOD活性和MDA含量。

1.5.5 WB檢測心肌組織相關蛋白含量取心肌組織加入組織蛋白提取物，4 ℃充分研磨，10 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），取上清。用BCA 蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量。定量的蛋白樣品在凝膠電泳前煮沸變性，脫脂奶粉密封閉1 h，加入一抗孵育過夜，漂洗后標記二抗反應，發光顯色，凝膠成像儀曝光攝影。檢測NF-κB p65、NF-κB蛋白表達。

1.5.6 PCR檢測心肌組織NF-κB p65、NF-κB mRNA表達收集組織，然后加入RNAiso plus以提取總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明配置反轉錄體系以制備cDNA。通過20 μL 定量聚合酶鏈式反應體系，通過定量PCR 儀擴增目的基因。以β-actin為內參，計算目的基因的相對表達量。

1.6 統計學方法采用SPSS 26.0統計分析軟件，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 6組大鼠IS/AAR情況比較與對照組比較，模型組IS/AAR 較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組IS/AAR 較低（P＜0.05），且隨著劑量的升高而降低；丹參多酚酸鹽高劑量組與陽性對照組比較差異無統計學意義（F=98.604，P＞0.05）。見表1。

表1 6組冠心病模型大鼠IS/AAR情況比較（± s）

表1 6組冠心病模型大鼠IS/AAR情況比較（± s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別對照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽性對照組IS/AAR 0 0.79±0.101）0.52±0.092）0.40±0.082）0.20±0.062）0.20±0.052）鼠數10 10 10 10 10 10

2.2 6 組大鼠心肌組織細胞凋亡情況比較與對照組比較，模型組凋亡率較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組凋亡率較低（P＜0.05），且隨著劑量的升高而降低；高劑量組與陽性對照組比較差異無統計學意義（F=209.506，P＞0.05）。見圖1、表2。

圖1 6組冠心病模型大鼠心肌組織細胞凋亡情況比較（×400）

表2 6組冠心病模型大鼠心肌組織細胞凋亡情況比較（± s，%）

表2 6組冠心病模型大鼠心肌組織細胞凋亡情況比較（± s，%）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

凋亡率2.35±0.20 42.69±5.411）36.84±4.392）28.69±2.572）20.06±51.632）20.00±1.052）組別對照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽性對照組鼠數10 10 10 10 10 10

2.3 6 組大鼠炎性因子水平比較與對照組比較，模型組炎癥因子水平較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組炎癥因子水平較低（P＜0.05），且隨著劑量的升高而降低；高劑量組與陽性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 6組冠心病模型大鼠炎癥因子水平比較 （± s，ng/L）

表3 6組冠心病模型大鼠炎癥因子水平比較 （± s，ng/L）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

TNF-α 4.48±1.06 80.47±3.151）62.50±2.542）50.05±3.052）24.41±3.152）24.00±3.602）組別對照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽性對照組鼠數10 10 10 10 10 10 IL-1β 0.85±0.18 8.15±0.221）6.28±0.412）4.84±0.262）3.02±0.202）3.00±0.162）IL-6 14.15±1.51 68.12±5.691）52.09±4.712）40.96±4.082）31.77±3.082）31.05±3.692）

2.4 6 組大鼠SOD活性及MDA含量比較與對照組比較，模型組SOD較低，MDA 較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組SOD 較高，MDA 較低（P＜0.05）；高劑量組與陽性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 6組冠心病模型大鼠SOD活性及MDA含量比較（± s）

表4 6組冠心病模型大鼠SOD活性及MDA含量比較（± s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別對照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽性對照組MDA/（nmol/mg）8.02±1.25 16.41±3.521）14.36±3.402）12.47±3.072）10.42±1.512）10.40±1.062）鼠數10 10 10 10 10 10 SOD/（U/mg）120.42±5.42 60.54±4.081）78.62±4.922）86.97±6.572）92.51±8.022）92.50±8.562）

2.5 6 組大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表達比較與對照組比較，模型組NF-κB p65、NF-κB 蛋白表達較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組NF-κB p65、NF-κB 蛋白表達較低（P＜0.05）；高劑量組與陽性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5、圖2。

圖2 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表達比較

表5 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表達比較（± s）

表5 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表達比較（± s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別對照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽性對照組NF-κB 0.41±0.10 1.52±0.121）1.21±0.112）0.92±0.082）0.71±0.052）0.70±0.072）鼠數10 10 10 10 10 10 NF-κB p65 0.30±0.09 1.23±0.101）1.06±0.082）0.82±0.062）0.62±0.042）0.60±0.062）

2.6 6 組大鼠NF-κB p65、NF-κB mRNA表達比較與對照組比較，模型組NF-κB p65、NF-κB mRNA 表達較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組NF-κB p65、NF-κB mRNA 表達較低（P＜0.05）；高劑量組與陽性對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6。

表6 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB mRNA表達比較（± s)

表6 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB mRNA表達比較（± s)

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別對照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽性對照組NF-κB mRNA 1.00±0.05 5.05±1.021）4.05±0.852）3.16±0.502）2.74±0.322）2.70±0.352）鼠數10 10 10 10 10 10 NF-κB p65 mRNA 1.00±0.06 3.22±0.501）2.85±0.412）2.03±0.322）1.85±0.262）1.82±0.272）

3 討論

冠心病是全球死亡率最高的疾病，丹參多酚酸鹽是中藥丹參最重要的有效成分，具有活血化瘀的作用，現廣泛用于冠心病、心絞痛等心血管疾?。?］。此外，還有研究［3］認為，該藥物聯合瑞舒伐他汀可抑制機體血小板聚集；而該藥在一定程度上還能促進血管的舒張、增加其通透性，避免心肌細胞異?，F象的發生，從而保證心肌供血供氧。因此文章進行了以下探討。

在本研究中，對各組大鼠IS/AAR 進行了觀察，結果顯示模型組IS/AAR 最高，丹參多酚酸鹽可改善IS/AAR，同樣在對心肌細胞的凋亡中也發現丹參多酚酸鹽可以改善心肌細胞凋亡，表明丹參多酚酸鹽對冠心病的保護作用與改善凋亡有關，通過減少心肌細胞凋亡從而改善急性心肌梗死后遠期心功能［6］。除此之外，有研究［7］表明冠心病最主要的病理基礎就是炎癥反應，它在該病出現血管損傷時扮演著重要的角色。而在本研究的炎癥因子水平觀察中也驗證了模型組炎癥因子水平最高，丹參多酚酸鹽可降低炎癥因子水平這一結論。因此，抑制炎癥反應中炎性因子釋放非常關鍵，而NF-κB 信號通路是抑制炎癥相關通路，早就有研究［8，9］發現，丹參多酚酸鹽注射液可以有效抑制炎癥因子的釋放和NF-κB 信號通路的活化，抵抗機體氧化應激反應。SOD 一般在機體中存在范圍較廣，也是清除心肌組織氧化自由基的重要指標。MDA則是氧自由基與多聚不飽和脂肪酸反應的最終產物，還可以間接地反映出細胞的損傷程度［10，11］。在本研究中，也發現丹參多酚酸鹽可以提高大鼠SOD 水平，降低MDA含量，與其結論一致。而在NF-κB信號通路相關蛋白及基因表達的檢測中，結果也顯示模型組NF-κB p65、NF-κB 蛋白及mRNA 表達最高，丹參多酚酸鹽可降低NF-κB p65、NF-κB蛋白及mRNA表達，提示丹參多酚酸鹽可通過抑制NF-κB 通路傳導途徑，降低炎癥因子釋放以及氧化應激損傷來達到保護心肌細胞的目的。

綜上所述，丹參多酚酸鹽可有效抑制冠心病大鼠心肌細胞凋亡，降低心肌梗死面積，改善氧化應激損傷，這可能是通過調控NF-κB 通路實現的，為冠心病的臨床治療提供了新的思路與理論研究支撐。