山東省女子競走運動員冬訓前、后腸道菌群特征與運動表現分析

李婷婷,趙如珍,徐玉婷

(1.山東體育學院 研究生教育學院,山東 濟南 250102;2．哈爾濱工業大學(威海) 體育教學部,山東 威海 264200)

競走是我國田徑項目中的一個傳統優勢項目,特別是女子20 km競走。近年來中國女子競走運動員曾相繼獲得奧運會冠軍、世錦賽冠軍和亞運會冠軍[1-2]。因此,對女子競走項目的科技助力要求也相應提高[3]。競走是一項有很高專項技術要求的周期性體能類項目,在訓練、比賽過程中運動員能量消耗很大。因此,一方面要注意強化運動員的專項力量素質練習,另一方面需要及時追蹤監控運動員在訓練、比賽過程中身體機能狀態的變化規律及特點。

近年來,運動訓練與腸道菌群的相互作用和影響得到了廣泛的研究。研究者發現運動項目[4]、運動強度[5]以及運動時間[6]等要素對運動員腸道菌群的改變均具有深刻的影響。已有學者綜合相關研究的結果與進展,嘗試提出了“運動員微生物組”的概念。

由此可見,專業運動員所承受的長時間專項運動負荷很可能會使其腸道菌群產生一系列的適應性改變,而此類適應性改變的發生,同樣可能影響到運動員的運動能力與運動表現。例如,從一名女子舉重奧運冠軍腸道菌群樣本中分離得到的一株長雙歧桿菌OLP-01,在移植給無菌小鼠后,其肌肉力量與抗疲勞能力有顯著提升[7]。而從優秀馬拉松運動員糞便中分離得到的非典型韋榮氏球菌(Veillonella atypica),在移植給無菌小鼠后,則可以將其運動期間產生的乳酸鹽轉化為丙酸鹽,使其奔跑至力竭的時間明顯延長[8]。以上研究提示,運動員運動能力的改善,與其腸道菌群發生的適應性改變很可能存在直接聯系。

然而,運動員腸道菌群的改變往往伴隨著代謝功能的變化,腸道菌群的代謝產物及其分泌物可能在提高運動員運動表現中發揮重要作用。耐力運動訓練已被證明可以通過修改丁酸調節基因BCoAT和丙酸調節基因mmDA來增加腸道微生物組短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFAs)的生產能力,微生物衍生的SCFAs水平升高對宿主免疫和炎癥有保護作用。由于運動員最容易因疾病或炎癥相關狀況而導致運動和訓練能力下降,因此全身SCFAs的增加和運動表現之間可能存在直接聯系[9]。

本研究擬通過觀察、比較研究山東省競走女子運動員冬訓前、后專項比賽成績、專項力量素質、身體機能指標的變化趨勢,探究其運動表現改變與腸道菌群變化特征之間所存在的可能聯系。既往研究主要集中在運動員與普通人群之間的對比分析中,對于冬訓這類周期備賽訓練的研究相對較少。因此,本研究假設運動員通過冬訓期間的合理訓練,運動表現顯著提高,并與腸道菌群及其代謝物的改變存在聯系。研究希望對進一步探索提升競走運動員運動成績的可能手段提供參考。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗對象

招募參加2020—2021年冬訓的山東省女子競走隊運動員14名,實驗前告知她們全部實驗安排與采樣要求,并征得教練組與全體運動員的同意。參加本次測試的運動員基本情況見表1。

表1 參加本次冬訓的山東省女子競走運動員基本情況

1.1.2 篩選標準

排除冬訓期間因傷病無法系統訓練及由于個人原因無法完成全程測試的受試者,運動等級均為國家二級運動員及以上,專業訓練年限均在3年以上。受試者均無嚴重胃腸道疾病史,3個月內均未服用過抗生素及非甾體類抗炎藥等藥物,在受試冬訓期間運動員的日常生活規律,飲食結構及種類均保持穩定。

1.2 研究方法

1.2.1 在中國田徑官方網站(http://www.athletics.org.cn/)收集、整理冬訓前2020年山東泰安全國競走錦標賽以及冬訓后2021年全國競走錦標賽暨奧運會選拔賽山東隊14名女子競走運動員的專項運動比賽成績。

1.2.2 分別測定受試者冬訓前、后的專項力量素質指標,測試標準采用第十四屆全國運動會競走項目體能測試項目及要求。共測試平板支撐(s)、60 s俯臥撐(次)、 60 s負重蹲起(次)等3項。

1.2.3 在冬訓前、后預定的時間節點,于空腹8小時后的次日清晨,按操作規范采集女子競走運動員5 ml肘靜脈血,將其分別置于抗凝采血管中。然后,采用CIS F-820血細胞計數儀測定其血紅蛋白(Hb)含量。同時,將其余全血3 000 g離心5 min后,收集血漿,分別采用MD-100 型半自動生化分析儀測試血尿素(BUN)濃度,采用WIZARD1470y計數儀測定血漿睪酮(T)濃度。

1.2.4 在冬訓前、后預定的時間節點,按操作規范采集女子競走運動員的糞便樣本,將采集到的樣本迅速置于-80℃超低溫冰箱內凍存,送檢時添加足量干冰以保證低溫。

1.2.5 血液及糞便樣本的采集與部分指標測試

時間:2020年12月2日(冬訓前)、2021年3月11日(冬訓后),地點:山東省體育訓練中心,操作者:趙如珍、李婷婷。

1.2.6 腸道菌群樣本DNA的提取及16S rDNA測序

(1)腸道菌群樣本DNA提取

使用糞便基因組DNA提取試劑盒(離心柱型 DP328)進行提取,使用紫外分光光度計測定所提取DNA的OD260/OD280比值,將質量檢測合格的DNA置于-80℃冰箱凍存待測。

(2)16S rDNA的擴增

對腸道菌群16S rDNA的V4區進行PCR擴增,上游引物序列:5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3';下游引物序列:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3';PCR擴增結束后,從每個樣品中吸取100 ng(體積約5～10 μl)的PCR擴增產物,充分混勻后濃縮其體積至30 μl,2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行純化。

(3)建庫、上機測序及質控

利用美國Illumina公司的TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒完成建庫。使用熒光分光光度計對文庫定量并通過Agilent高敏度核酸定量儀對PCR富集片段行質量監控并驗證DNA文庫;在Illumina MiSeq高通量測序平臺上采用雙末端測序法上機測序。

使用QIIME軟件(V1.6.0,http://qiime.org/index.html)對下機數據進行預處理,包括:①數據拆分;②Tags拼接;③Tags截取;④Tags長度過濾;⑤Tags去嵌合體序列。最終得到高質量的有效數據。所測得的每個OTUs的最長16S rDNA序列片段根據已有Greenbank數據庫進行相似性比對(網址:http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)。

1.2.7 測序結果數據處理與統計分析

(1)Reads數篩選及質控

對測序產生的序列采用FLASH軟件數據包行paired-end reads拼接,依據引物條形碼序列barcode定位于相應樣本,對于測序質量較低的數據予以去除。采用QIIME軟件數據包行reads質控來挑選符合要求的高質量reads,并去除低質量reads。

(2)OTUs分析

采用QIIME質控器的操作命令將相似度大于97%的序列挑選出來并聚類為一個操作分類單位(operational taxonomic unit,OTU),同時生成OTUs矩陣。

(3)物種注釋

采用Ribosomal Database Project(RDP)軟件數據包對OTUs的最長16S rDNA序列片行相似同源性比對和種屬分類學鑒定,數據庫參照Greenbank(網址:http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)。統計各個樣品在細菌科(family)、屬(genus)、種(species)分類水平上的組成。

1.3 數據處理與分析

使用SPSS軟件26.0以及GraphPad Prism 9軟件對數據進行統計分析、繪圖。實驗數據以均數±標準差(M土SD)表示,冬訓前、后女子競走運動員專項成績的變化與專項力量素質指標的變化等實驗數據滿足正態分布,用配對樣本t檢驗進行實驗前后自身比較;冬訓前、后女子競走運動員菌屬分類水平上腸道菌群組成豐度的變化與菌種分類水平上腸道菌群組成豐度的變化以及腸道菌群α多樣性的變化等實驗數據不滿足正態分布,則使用配對樣本Wilcoxon符號秩和檢驗進行統計分析,顯著性水平設為P<0.05。

2 實驗結果

2.1 冬訓前、后女子競走運動員專項成績的變化

受試者在2021年全國競走錦標賽暨奧運會選拔賽中的20 km耗時,比冬訓前的2020年山東泰安全國競走錦標賽成年專項比賽20 km耗時有明顯降低,且存在顯著性差異(t=3.156,P=0.012,P<0.05);結果提示參加本次測試的女子競走運動員的專項運動能力在冬訓過程中獲得不同程度的提升(如圖1)。

圖1 冬訓前、后成年專項20 km比賽耗時趨勢圖

2.2 冬訓前、后女子競走運動員專項力量素質指標的變化

如表2所示,冬訓后受試者平板支撐(t=-3.144,P=0.008)、60 s俯臥撐(t=-8.542,P=0.000)和60 s負重蹲起(t=-10.481,P=0.000)的測試結果均顯著高于冬訓前(P<0.01)。說明通過冬訓期間對上、下肢力量以及腰腹肌力量的專項練習及強化,運動員的專項力量素質獲得顯著提升。這也是其運動表現獲得提升的重要因素之一。

表2 冬訓前、后女子競走運動員專項力量素質的變化

2.3 冬訓前、后女子競走運動員身體機能指標的變化

如表3所示,與冬訓前相比,冬訓后受試者Hb含量與冬訓前相比有顯著升高(t=-4.297,P=0.001,P<0.05),提示經過冬訓,其機體運輸氧氣能力可能獲得較為明顯的提升。與冬訓前相比,受試者冬訓后的血漿BUN濃度有顯著降低(t=3.491,P=0.004,P<0.05),提示其機體對冬訓期間上量、上強度的訓練負荷產生了較為良好的適應。與冬訓前相比,受試者冬訓后的血漿睪酮水平在冬訓后有顯著升高(t=-5.599,P=0.000,P<0.05),同樣表明其機體可適應增大的運動負荷,其體能可能有明顯增強。

表3 冬訓前、后女子競走運動員Hb、BUN和T濃度變化

2.4 冬訓前、后女子競走運動員腸道菌群的變化

2.4.1 冬訓前、后女子競走運動員腸道菌群組成結構的變化

本研究將分別從腸道菌群的屬、種分類水平上探討冬訓前、后競走運動員腸道菌群結構組成的差異性變化。

2.4.1.1 冬訓前、后女子競走運動員菌屬分類水平上腸道菌群組成豐度的變化

與冬訓前相比,冬訓后女子競走運動員腸道菌群樣本中的糞桿菌屬(Faecalibacterium)(z=-6.022,P=0.000)、巨單胞菌屬(Megamonas)(z=-3.296,P=0.001)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)(z=-2.621,P=0.009)、擬桿菌屬(Bacteroides)(z=-2.354,P=0.019)豐度均有顯著增加(P<0.05);而柯林斯菌屬(Collinsella)(z=3.045,P=0.002)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)(z=2.229,P=0.026)、Holdemanella(z=2.103,P=0.035)的豐度則均呈顯著減少(P<0.05)(如圖2)。

圖2 冬訓前、后菌屬水平上相對豐度變化趨勢圖注:*表示冬訓后與冬訓前相比顯著性增多,P<0.05;#表示顯著性減少,P<0.05。下同。

2.4.1.2 冬訓前、后女子競走運動員菌種分類水平上腸道菌群組成豐度的變化

與冬訓前相比,冬訓后女子競走運動員腸道菌群樣本中的普氏棲糞桿菌(Faecalibacterium_prausnitzii)(z=-4.138,P=0.001)、Collinsella_aerofaciens(z=-3.045,P=0.002)豐度有顯著增加(P<0.05);而大腸埃希氏桿菌(Escherichia_coil)(z=3.170,P=0.002)、嗜糞擬桿菌(Bacteroides_coprophilus)(z=3.170,P=0.002)、副流感嗜血桿菌(Haemophilus_parainfluenzae)(z=2.229,P=0.026)、瘤胃球菌屬sp_N15.MGS-57種(Ruminococcus_sp_N15.MGS-57)(z=2.856,P=0.004)豐度則有顯著減少(P<0.05)。如圖3所示。

圖3 冬訓前、后菌種水平上相對豐度變化趨勢圖注:*表示冬訓后與冬訓前相比顯著性增多,P<0.05;#表示顯著性減少,P<0.05。下同。

2.4.2 冬訓前、后女子競走運動員腸道菌群α多樣性的變化

如表4所示,與冬訓前相比,表征腸道菌群豐富度的Chao指數(z=-3.233,P=0.001)和Ace指數(z=-3.296,P=0.001)在冬訓后有顯著上升(P<0.01);表征腸道菌群多樣性的Shannon指數(z=-0.847,P=0.397)與表征物種分布的多樣性和均勻度的Simpson指數(z=-0.408,P=0.683)在冬訓前、后有上升,但未見有顯著差異(P>0.05)。

表4 冬訓前、后競走運動員腸道菌群α多樣性分析結果

3 分析討論

3.1 山東省女子競走運動員冬訓前、后專項力量素質、身體機能、專項成績的結果變化分析

經過冬訓期間備戰與積累,參訓的女子競走運動員的身體機能與專項素質均獲得有效的提高。

競走作為以體能為主導的運動項目,對運動員的肌肉力量以及運動員自身耐力都有著很大的挑戰,力量素質是發展其他身體素質的基礎。競走的專項力量素質練習主要包括上、下肢力量以及腰腹肌力量(俯臥兩頭起、杠桿推舉、持鐵球擺臂、仰臥起坐、球上臀橋、杠桿左右轉體等)訓練。專項力量的發展對競走運動員的競走速度和專項水平的提高起到明顯的促進作用。實驗結果表明,冬訓后的平板支撐時間、60 s俯臥撐和60 s負重蹲起個數均顯著高于冬訓前。這提示通過冬訓期間通過對上、下肢力量以及腰腹肌力量的專項練習與強化,運動員的專項力量素質得到大幅度提升。對王娜備戰第十四屆全運會的賽前訓練分析結果提示,爆發力與力量耐力的提升為其在20 km競走比賽中專項能力的發揮提供了有效保證[10]。任子毅則觀察到有針對性地安排專項力量訓練,有助于增強競走運動員的協調性和穩定性,對于避免動作犯規具有積極意義,在一定程度上增大了競走運動員的步長,有效實現在訓練、比賽過程中的機能節省化[11]。上述研究結果與本研究所觀察記錄的結果趨勢一致,均可證實競走運動員專項力量素質的提升是優化專項技術、減少能量消耗、預防運動損傷的關鍵所在。

運動員身體機能的監測評估是運動訓練科學化的重要內容和實現途徑[12]。競走屬于典型的耐力型項目,耐力項目中血液中Hb的含量與攜氧能力有關,Hb的含量直接影響著運動員的機能狀態。Hb的含量既是有氧耐力的基礎,也是促進運動能力提高的關鍵因素[13]。本實驗觀察到:盡管在整個冬訓期間訓練負荷的強度和量均有明顯提升,但隨著運動員對訓練負荷的適應,運動員的Hb值有較為明顯升高,表明運動員機體攜氧能力以及對訓練的適應能力均獲得了明顯提升。睪酮是人體內最強力的促合成代謝激素,對運動后消除疲勞有利,并且可以幫助機體恢復和提高運動能力,在運動訓練實踐中可以根據睪酮濃度來判斷運動員機體的狀態[14]。一般情況下認為,在正常生理范圍內,睪酮水平升高,是機體產生良性適應的表現[15]。本研究觀察到冬訓后運動員血漿睪酮濃度上升,同時其體能增強。另一方面,表征機體疲勞程度的BUN血尿素氮水平[15],在冬訓后則呈顯著下降趨勢,提示參與本次冬訓的女子競走運動員可以較好的適應冬訓期間的負荷強度。本研究所觀察到的實驗結果與霍磊等人的測試結果與變化趨勢基本一致[16]。提示通過整個冬訓期間科學合理的訓練安排,運動員的身體機能得到提升,從而使其保持了良好的競技狀態。

邊通達等的研究觀察到冬訓能夠提高運動員有氧能力、力量素質以及專項耐力,培養運動員的最佳競技狀態[17]。董思羽等則證實競走運動員運動成績的提升與冬訓期間體能的增強與技術動作的完善有關[18]。綜合本研究的測試結果,參與本次冬訓的女子競走運動員,在冬訓后參加20 km比賽的成績得到有效提升,一方面與其與冬訓期間身體機能改善有關,另一方面與其專項力量素質增強,技術動作得以優化有關。

3.2 山東省女子競走運動員冬訓前、后腸道菌群變化特征結果分析

3.2.1 女子競走運動員冬訓前、后腸道菌群結構組成豐度變化分析

大量的研究已證實,運動訓練可以改變腸道菌群的組成,增加有益菌的數量,豐富菌群多樣性[19-20]。本研究結果同樣表明,冬訓后女子競走運動員的腸道菌群在菌屬以及菌種分類水平上均發生顯著改變。

本研究觀察到與冬訓前相比,冬訓后女子競走運動員腸道菌群樣本中糞桿菌屬(Faecalibacterium)、巨單胞菌屬(Megamonas)、普氏棲糞桿菌(Faecalibacterium_prausnitzii)、Collinsella_aerofaciens等丁酸鹽產生菌豐度均有上調。Okamoto等人研究表明,SCFAs是耐力運動中骨骼肌的重要能量來源[21]。丁酸鹽已被證明在整體腸道穩態和健康中具有十分關鍵的作用,丁酸鹽可以通過抑制促炎因子,在不同的免疫細胞中起著調節炎癥狀態的作用[22]。除此之外,丁酸鹽對上皮屏障具有保護作用,影響粘液的產生及其質量,起到促進腸黏膜屏障功能的作用[23]。普氏棲糞桿菌(Faecalibacterium_prausnitzii),可以利用乳酸鹽和乙酸鹽來合成丁酸鹽,從而可以防止乳酸鹽的積累,穩定腸道環境[24]。潘鳳偉等人研究表明,運動員參加運動訓練后腸道中的丁酸鹽產生菌豐度增加,與本研究結果相似[5]。在動物研究中,也有多項研究表明了運動與丁酸鹽產生菌的增加有關[25-26]。

Estaki等人發現,在年輕成人中,產丁酸鹽細菌類群的微生物多樣性和豐度與心肺健康呈正相關[27]。競走是一項體能主導類的長時間持續性耐力運動項目,心肺功能的好壞直接關系到專項耐力素質[28]。峰值攝氧量(VO2peak)是心肺健康(CRF)的黃金標準。有研究表明,獨立于飲食的VO2max與健康參與者糞便丁酸鹽產量的呈正相關,關鍵丁酸鹽產生菌的豐度被發現與VO2max呈顯著正相關[27,29]。本實驗結果中所觀察到的丁酸鹽產生菌豐度的增加,同樣提示競走這一耐力性運動項目運動員心肺功能的改善,也可能與丁酸鹽產生菌豐度增加之間存在密切聯系。有氧耐力項目運動員腸道內有較高豐度產丁酸鹽的菌,一方面可能使運動員有氧代謝能力獲得有效提升,另一方面可能會促進其腸道屏障完整性的保持,以減少因高強度訓練所致胃腸道黏膜缺血所可能引發的炎癥發生與發展[30]。

3.2.2 女子競走運動員冬訓前、后腸道菌群α多樣性變化結果分析

本實驗結果顯示,冬訓后表征物種豐富度的Ace指數、Chao指數顯著增加,但表征群落多樣性和物種分布均勻度的Shannon指數以及表征物種個體屬于不同種概率的Simpson指數在冬訓前、后未見有顯著差異。Carter等人研究表明,腸道菌群對運動訓練的反應性質以及與心肺健康存在密切聯系,腸道菌群多樣性與心肺健康呈正相關[31]。而運動員的腸道菌群具有更高的多樣性,菌群的多樣性和組成與各種健康參數相關,包括炎癥細胞因子的水平[32]。因此,腸道菌群多樣性可以被視為一種新的生物標志物或健康指標[33]。腸道菌群豐富度較低的個體具有更顯著的總體肥胖、胰島素抵抗和血脂異常以及更顯著的炎癥表型[34]。上述研究表明,腸道菌群豐富度及多樣性的提高,可以通過減少炎癥、提高心肺功能和能量水平、改變身體成分以及增強營養吸收,從而間接提升運動員的運動表現。

本研究觀察到參與此次冬訓的女子競走運動員腸道菌群組成發生了較為顯著的改變,其中丁酸鹽產生菌的豐度顯著增加與其心肺功能提升、能量代謝改善均存在較為密切的聯系,很可能進一步影響到了運動員的競技能力和運動表現。提示經過冬訓期間運動員對于運動負荷所達成的良性適應,使運動員的腸道菌群微生態體系趨向于構建新的動態平衡,從而對運動員的身體機能與專項運動能力產生了積極影響。

4 結 論

經過冬訓期間科學的訓練,女子競走運動員腸道菌群中產生丁酸鹽的結構成分豐度有顯著增加,腸道菌群微生態體系的豐富度有顯著提升;同時,其專項力量素質提高、身體機能指標獲得不同程度改善及比賽成績的提升。腸道菌群的此類改變既可為機體代謝補充能量,又可有效抑制因運動負荷增加而可能誘發的腸道炎癥反應,在冬訓后競走女子運動員運動表現的提高中發揮了有效的促進作用。上述結果提示,冬訓后競走運動員腸道菌群結構特征,可能是其潛在的較高水平競技表現的一種重要的結構要素,可以為腸道菌群作為潛在干預靶點對提高競走運動員運動表現提供參考價值。