胰高血糖素樣肽2受體基因對肝癌的預后及免疫浸潤的影響

毛春虎,陳雨恒,陳 果,唐 浩,伍 剛

(1.成都中醫藥大學醫學與生命科學學院,四川 成都 610072;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院肝膽胰外科,四川 成都 610072;3.南京醫科大學 a.第一臨床醫學院,b.第一附屬醫院肝膽中心,江蘇 南京 210029;4.西南醫科大學臨床醫學部,四川 瀘州 646000)

據世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的《世界癌癥報告》2020 版數據顯示,原發性肝癌是2020年全球第六大最常見的癌癥,也是第三大癌癥死亡原因,肝癌的全球發病率排名第五,男性死亡率排名第二[1]。肝癌也是我國導致癌癥死亡的五大原因之一[2]。因此,原發性肝癌的早期發現、診斷及規范治療對于患者至關重要。肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要危險因素是慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染、黃曲霉毒素污染的食物、過量飲酒、超重、2型糖尿病和吸煙[1]。其病因和發病機制復雜,臨床對病因及發病機制的研究仍在不斷地探索和深入。肝癌的治療方式包括手術、放射治療、化學治療、靶向治療等,然而限于目前的醫療水平,肝癌的治療效果及預后不佳[3～6]。近年來,研究者通過免疫細胞浸潤尋找新的治療方法,發現免疫浸潤對惡性腫瘤的發展與預后有重要意義[7,8]。胰高血糖素樣肽 2 受體(glucagon like peptide 2 receptor,GLP2R)屬于G蛋白偶聯受體超家族,是胰高血糖素受體家族的成員[9]。人GLP2R定位于染色體17p13.3,編碼550個氨基酸的G蛋白偶聯受體,加工成486個氨基酸的受體[10]。研究發現,GLP2R在有限數量的腫瘤類型中的表達,包括回腸類癌[11]、胃腸道間質瘤[12]和宮頸癌癥[13]。然而,關于GLP2R在肝臟腫瘤中的表達的研究較少。本研究主要采用生物信息學的方法,探討了GLP2R對肝癌預后的影響,并更深一步研究了GLP2R對肝癌腫瘤微環境中免疫細胞浸潤的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料從UCSC XENA(https//xenabrowser.net/datapages/)網站下載TCGA數據庫所有肝細胞肝癌 mRNA 轉錄組數據,并對其進行研究分析。

1.2 方法

1.2.1泛癌中GLP2R的mRNA差異表達分析 利用Tumor Immune Estimation Resource (TIMER2.0)(http://timer.cistrome.org/)數據庫,探尋GLP2R在不同癌癥中腫瘤組織與正常組織間表達的差異性。

1.2.2GLP2R的差異表達分析與GLP2R的生存分析 從UCSC XENA(https//xenabrowser.net/datapages/)網站下載TCGA數據庫所有肝細胞肝癌 mRNA 轉錄組數據。探究GLP2R在肝癌組織與正常組織中的表達的差異性,以GLP2R的中位數表達水平將肝癌患者分為高低組,繪制Kaplan-Meier生存曲線分析GLP2R表達水平與HCC預后的關系。

1.2.3GLP2R與差異基因的蛋白互作網絡及其與關鍵基因的相關性 使用R軟件(v4.2.3)對肝細胞肝癌mRNA 轉錄組數據進行正常組織與癌癥組織的差異表達分析,篩選出log2FoldChange絕對值大于2,且P<0.05的基因作為差異基因。利用STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)及Cytoscape軟件(v3.7.2)探尋GLP2R與差異基因的關系,篩選出關系較為緊密的基因作為關鍵基因。

1.2.4GLP2R與關鍵基因的單因素和多因素Cox分析 對GLP2R及篩選出的關鍵基因做單因素與多因素Cox回歸分析,探尋其與肝癌患者預后的關系。

1.2.5GLP2R與關鍵基因在肝癌中的功能富集分析 對GLP2R及篩選出的關鍵基因行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析,尋找差異基因的富集通路。

1.2.6GLP2R表達與肝癌中免疫細胞浸潤的關系 利用TIMER2.0數據庫,探究GLP2R與TIMER中6種免疫細胞,與CIBERSORT中22種免疫細胞的相關性,以GLP2R在肝癌中的中位數表達水平將患者分為高低組,利用CIBERSORT分析高低組免疫細胞浸潤的差異性。

1.3 統計學方法采用R軟件(v4.2.3)進行數據分析。Mann-WhitneyU檢驗分析GLP2R mRNA在肝癌組織、癌旁組織中的表達差異,Cox回歸分析肝癌患者預后的危險因素,Kaplan-Meier生存曲線分析GLP2R mRNA表達水平與肝癌患者預后的關系,GLP2R mRNA表達水平與免疫細胞浸潤程度的相關性采用Spearman相關分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 泛癌中GLP2R的mRNA差異表達為了明確GLP2R在各種腫瘤中的mRNA表達,通過使用TIMER 2.0數據庫分析腫瘤組織和正常組織中的GLP2R的差異表達模式,我們的結果顯示,GLP2R mRNA 表達除了在肝細胞癌中顯著下調,還在膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤性癌、宮頸鱗狀細胞癌和宮頸內腺癌、結腸腺癌、食管癌、多形性膠質母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、腎嫌色細胞癌、腎透明細胞癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤、前列腺腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、甲狀腺癌及子宮內膜癌中顯著下調(P<0.05)。見圖1。

圖1 TIMER2.0數據庫中GLP2R在不同癌癥腫瘤組織和癌旁正常組織的 mRNA表達水平

2.2 肝癌中GLP2R的差異表達分析及GLP2R的預后價值從TCGA 數據庫中下載肝癌數據,并對GLP2R在肝癌與正常細胞表達分組比較,繪制肝癌患者的Kaplan-Meier生存曲線顯示:腫瘤樣本中GLP2R較正常樣本表達降低(P<0.0001)。見圖2。GLP2R低表達組的肝癌患者生存時間較好(P<0.05)。見圖3。

圖2 TCGA數據庫中GLP2R在肝癌腫瘤組織和癌旁正常組織的mRNA表達水平

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析GLP2R表達水平與HCC預后的關系

2.3 GLP2R與差異基因的蛋白互作網絡及關鍵基因的篩選篩選差異基因,構建蛋白互作網絡及篩選關鍵基因。使用R軟件對肝癌數據集行差異分析,以log2FC絕對值大于2,P<0.05篩選得到差異基因。見圖4,共1629個差異基因,GLP2R正好存在于1629個差異基因內。將1629個差異基因導入string數據庫構建網絡,使用Cytoscape將其可視化,見圖5。篩選與GLP2R相關聯的基因作為關鍵基因,得到6個關鍵基因,分別為:GLP1R、VIPR1、GNGT1、GCG、GIP、GNG4。見圖6。

圖4 差異基因表達火山圖

圖5 差異基因網絡互作圖

圖6 關鍵基因網絡互作圖

2.4 GLP2R與關鍵基因的單因素和多因素Cox分析結果顯示,在單因素Cox回歸中,GLP2R、GLP1R、GNGT1均與預后相關(P<0.05),見表1。在多因素Cox回歸中,GLP2R、GLP1R、GNGT1均為患者不良預后的獨立危險因素(P<0.05),見表2。GLP2R是LIHC患者的獨立預后因素。

表1 GLP2R與關鍵基因的單因素Cox分析

表2 GLP2R與關鍵基因的多因素Cox分析

2.5 GLP2R與關鍵基因在肝癌中的功能富集分析對GLP2R及篩選的6個基因做GO富集分析,整理出包含GLP2R的富集通路,結果如下:生物過程方面,主要富集在細胞對胰高血糖素刺激的反應,腺苷酸環化酶-調節G蛋白偶聯受體信號通路,細胞對肽激素刺激的反應等過程,分子功能方面,主要富集在胰高血糖素受體活性,肽激素結合,激素結合,G蛋白偶聯肽受體活性,肽受體活性,肽結合,酰胺結合等。見圖7。

圖7 GLP2R與關鍵基因在肝癌中的功能富集分析 a:GO富集分析柱狀圖;b:GO富集分析點圖

2.6 GLP2R表達與肝癌中免疫細胞浸潤的相關性本研究通過TIMER 2.0數據庫,對GLP2R基因表達分別與TIMER、CIbersort中HCC中免疫細胞浸潤水平行相關性分析,結果顯示:GLP2R表達與TIMER中6種免疫細胞行免疫細胞浸潤相關性分析,發現GLP2R表達與CD4+T細胞(Rho=0.198,P<0.05)、中性粒細胞(Rho=0.225,P<0.05)、巨噬細胞(Rho=0.323,P<0.05)、髓樣樹突狀細胞(Rho=0.215,P<0.05)的免疫浸潤水平呈正相關,見圖8a;GLP2R表達與CIbersort中22種免疫細胞行免疫細胞浸潤相關性分析,發現GLP2R表達與記憶靜息CD4T細胞(Rho=0.156,P<0.05)、中性粒細胞(Rho=0.113,P<0.05)、M2巨噬細胞(Rho=0.169,P<0.05)、嗜酸性粒細胞(Rho=0.127,P<0.05)的免疫浸潤水平呈正相關,與CD8+T細胞(Rho=-0.178,P<0.05)、活化的NK細胞(Rho=-0.113,P<0.05)、濾泡輔助性T細胞(Rho=-0.241,P<0.05)、γδ T細胞(Rho=-0.107,P<0.05)的免疫浸潤水平呈負相關,見圖8b。

圖8 GLP2R表達與肝癌免疫細胞浸潤相關性 a:GLP2R基因表達與TIMER中免疫細胞浸潤水平相關性;b:GLP2R基因表達與CIbersort中免疫細胞浸潤水平相關性

2.7 GLP2R不同表達水平與肝癌中免疫細胞浸潤的差異性CIBERSORT分析表明,CD8T細胞、單核細胞在GLP2R低表達組患者中的比例高于高表達組(P< 0.05),而記憶靜息CD4 T細胞、M0巨噬細胞、靜息樹突狀細胞在低表達組患者中的比例低于高表達組(P<0.05)。見圖9。

圖9 GLP2R表達高低組與肝癌中免疫細胞浸潤的差異

3 討論

HCC全球發病率及死亡率分別列所有腫瘤的第五位和第三位[1]。越來越多的研究發現,免疫浸潤對惡性腫瘤的發展與預后有重要意義[7,8]。GLP2R屬于G蛋白偶聯受體超家族[9],對于GLP2R在肝癌中的表達及其對肝癌預后及免疫浸潤的影響的研究尚未見報道。

通過對TCGA-LIHC肝癌樣本和癌旁正常樣本的對比,發現GLP2R在肝癌組織的表達異常降低。通過生存分析及單因素、多因素Cox回歸,發現肝癌患者中GLP2R低表達組有更好的生存期,GLP2R可以作為影響肝癌患者總生存期的獨立預后因素。通過對肝癌患者免疫細胞浸潤的研究發現,GLP2R對肝癌的作用可能與部分免疫細胞浸潤有關。這些結果表明,GLP2R或許參與了肝癌的發生與發展,這可能與腫瘤微環境中的免疫細胞浸潤有關。

GLP2R基因已定位于人類染色體17p13.3[10]。對編碼人和大鼠GLP2R的cDNA的克隆表明,它是一種G蛋白連接的七跨膜結構域受體,與胰高血糖素、GLP1和GIP受體具有同源性[14]。GLP2R介導GLP2的作用,屬于G蛋白偶聯受體超家族,是胰高血糖素受體家族的成員[9]。根據動物研究,GLP2R主要在胃腸道的腸道神經元中表達[15,16],有實驗在小鼠肝臟中發現了全長GLP2受體(GLP2R)mRNA轉錄物,盡管其水平遠低于空腸[17]。一項使用qPCR來表征小鼠GLP2R表達的研究也表明,GLP2R在肝臟中存在表達[18]。對豬的組織研究也表明,GLP2R在肝臟中表達[19]。研究發現,在鼠類中,GLP2R主要在胃腸道中表達[20,21],且已被證明GLP2R可以通過刺激隱窩室中的細胞增殖和抑制凋亡細胞死亡來維持腸上皮的完整性[21～25]。對小鼠的實驗還表明,下丘腦阿黑皮素原(POMC)神經元中的GLP2R是促進肝臟胰島素敏感性和血糖控制所必需的[26]。POMC神經元中的GLP2R對于肝臟葡萄糖產生至關重要,POMC神經元中GLP2R選擇性缺失的小鼠表現出肝臟胰島素抵抗[27]。還有研究發現,GLP2R基因與小鼠的肝臟炎癥有關,GLP2R的缺失會增加小鼠肝臟炎癥的生物標志物[28]。GLP2R還與部分肝切除術后的肝臟再生有關[18]。

目前研究表明,GLP2R在有限數量的腫瘤類型中的表達,包括回腸類癌[11]、胃腸道間質瘤[12]、和宮頸癌癥[13]。有研究報道,GLP2R與胃腸道癌癥相關[29,30]。GLP2R轉錄物在人類結腸直腸癌中表達[31],GLP2R蛋白在人類結腸腫瘤中表達[32]。GLP2R被認為是通過調節結腸上皮整合而導致結直腸癌進展的關鍵基因類型[30]。對胃癌的研究表明,GLP2R影響胃癌患者生存時間,有潛力作為胃癌的預后標志物之一[29]。對肺癌的研究發現,GLP2R在對EGFR-TKIs或順鉑耐藥的非小細胞肺癌細胞中高表達,GLP2-GLP2R信號可能改變細胞對藥物的敏感性,這表明GLP2-GLP2R信號可能是建立癌癥細胞耐藥性的因素之一[33]。敲除GLP2R基因顯著抑制體外胃癌細胞的增殖、遷移[34]。本研究中,GLP2R在肝癌組織相對正常組織表達較低。肝癌患者的低GLP2R表達組有較好的生存時間。

最近研究發現,免疫浸潤參與惡性腫瘤的發展,且對其預后有重要意義。研究發現,GLP2R影響結腸患者的預后,且與患者腫瘤免疫狀態有關[35]。還有研究表明,GLP2R在結直腸癌腫瘤樣本中顯著下調,且GLP2R可能在結直腸癌進展和免疫反應抑制中發揮重要作用[36]。對胃癌的研究也表明,GLP2R與免疫細胞浸潤有顯著相關性[29]。本研究通過對肝癌患者免疫細胞浸潤的研究發現,GLP2R表達與CD8+T細胞的免疫浸潤水平呈負相關。有研究表明,CD8+T細胞高浸潤與肝細胞癌患者較高的生存率有關[37]。該實驗結果與本研究相符。GLP2R可能與部分免疫細胞作用對肝癌患者的預后產生影響。

綜上,本研究通過生物信息學方法,闡述了GLP2R基因對肝癌預后及免疫浸潤的相關性。研究結果顯示GLP2R基因在肝癌組織中低表達,低表達的GLP2R與肝癌患者較好預后相關。GLP2R基因可能影響HCC免疫浸潤水平,GLP2R基因可作為HCC潛在的免疫治療靶點,為肝癌患者的治療提供新思路。