富血小板血漿在椎間盤退變治療中的應用

田志康 綜述 孟純陽 審校

(1濟寧醫學院臨床醫學院,濟寧 272013;2濟寧醫學院附屬醫院脊柱外科,濟寧 272029)

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)造成的頸肩腰腿痛全球發病率超過80%[1]。作為人體內最大的無血管組織,椎間盤由中央髓核(nucleus pulposus,NP)、外纖維環和軟骨終板3部分組成。包括過度機械負荷、生物因素、細胞營養的變化和炎癥微環境在內的多種因素均可誘發IDD[2]。值得注意的是,退變椎間盤內的炎癥可以驅動細胞外基質(extracellular matrix,ECM)降解、生長因子活性及合成代謝速率降低,從而導致椎間盤保水和承重能力下降,引起椎間盤突出,壓迫脊神經誘發頸肩腰腿痛[3]。

當前IDD的治療主要包括保守治療和手術治療,其中保守治療以緩解疼痛為主要目的,包括休息、物理和藥物治療方法。手術治療則是通過消除脊柱節段間的運動來減少椎間盤源性疼痛。尋找一種行之有效的無創非手術療法已成為當前的難點和熱點。隨著生物治療技術的快速發展,使用自體細胞療法治療IDD的病例日益增加,其中最具代表性的是富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)和含有間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的骨髓濃縮物。

1 PRP分類與制備

PRP是眾多生物療法中一項很有前景的新技術,它是由自體全血離心得到的,包含許多從血小板α-顆粒和致密顆粒中釋放的生物活性介質,還有一些來自血漿的成分,如凝血酶原、纖維蛋白原、纖維連接蛋白等。PRP的生物學功能表現在與活化的血小板表達的黏附蛋白一起參與組織損傷識別和受損組織修復,并在細胞信號通路中發揮核心作用[4]。由于其極具潛力的再生作用,已成為骨科急慢性疾病的一種有前途的治療工具[5-6]。此外,PRP不僅對髓核細胞(Nucleus pulposus cells,NPCs)有促增殖、促分化、抗凋亡的作用,而且可以通過誘導ECM的合成和分泌來調控細胞外微環境。PRP應用于IDD有以下優點:1)不發生免疫排斥反應;2)可以避免疾病的傳播;3)可以通過離心制備,且比重組生長因子價格低。然而,由于其制備標準不統一,不同的制備方法可能導致細胞和細胞因子在PRP中的濃度不同[7-8],給研究PRP帶來了巨大的挑戰。

根據白細胞和纖維蛋白含量不同,PRP主要分為4類:純富血小板血漿(pure platelet-rich plasma,P-PRP)、白細胞富血小板血漿(leukocyte-containing platelet-rich plasma,L-PRP)、富白細胞血小板纖維蛋白和純富血小板纖維蛋白。不同類型的PRP因其物質成分的含量不同,對IDD的修復作用也不同[8]。眾所周知,白細胞的數量上升會增加TNF-α、IL-1β等炎癥相關因子的表達。盡管P-PRP和L-PRP均能誘導正常髓核間充質干細胞(N-NPMSCs)的增殖和分化,上調ECM相關蛋白的表達。但是L-PRP中的白細胞會激活NF-κB通路,上調椎間盤細胞的分解代謝細胞因子MMP-1和MMP-13,增強椎間盤細胞的分解代謝,抵消血小板釋放的生長因子的抗炎作用,對IDD的修復產生不利影響[9]。此外,L-PRP中的白細胞可以激活退變的髓核間充質干細胞(D-NPMSCs)的炎癥反應和分解代謝[10],抑制NPMSCs的增殖和分化,從而減緩其對退變椎間盤的修復作用。與N-NPMSCs相比,D-NPMSCs形成的集落更少,增殖更慢,PRP中的白細胞成分降低了PRP的促增殖作用,因此,P-PRP或許是更適合的早期IDD治療策略。目前制備PRP沒有明確的標準,不同方法得到的PRP中生物活性成分含量和療效存在顯著差異[11]。有研究比較了手工制備一次離心法及OSP套裝制備二次離心法制備的PRP對IDD修復作用的影響[12]。結果顯示,相對于手工制備方式,以OSP為代表的套裝制備法所得PRP的白細胞濃度和血小板富集倍數均高于手工組。同時套裝制備組對退變椎間盤有更明顯的細胞增殖作用,可以更好地促進膠原蛋白Ⅱ(collagen type Ⅱ,COLⅡ)的合成。然而,套裝制備組的白細胞濃度也較高,其產生的促炎因子能夠促進蛋白聚糖(aggrecan,AGC)的去硫?；⒄T發其降解,抑制細胞外基質的合成,降低療效。因此,有必要進一步明確PRP的制備標準以及各組分對退變椎間盤的精確作用,并分離出白細胞等不利于IDD修復的成分,使其在臨床發揮更佳的作用。

2 PRP在IDD修復中的研究

2.1 體外研究

PRP中有豐富的生長因子,其中轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的濃度最高,其不僅可以促進ECM的合成,同時還可以參與免疫調節、損傷修復等多種生理過程[13-14]。經PRP處理后,NPCs中TGF-β1的濃度明顯升高,同時PRP可以有效提高COLⅡ、AGC、sox-9 mRNA的表達水平,以及Smad2/3、COLⅡ、AGC的蛋白表達。用TGF-β1抑制劑抑制TGF-β1受體的激活,可降低Smad2/3、COLⅡ和AGC的表達[15]。這表明,PRP通過髓核細胞的TGF-β1受體激活TGF-β1/Smad2/3通路,增加ECM成分的合成分泌,發揮IDD治療作用。

P-PRP來源的外泌體(platelet-rich plasma exosomes,PRP-exo)是PRP釋放的含有高濃度生長因子的微粒,能消除NPCs中H2O2誘導產生的活性氧,并抑制NPCs促炎細胞因子(IL-1β、IL-18、TGF-β和IL-6)的生成和分泌[16]。同時,PRP-exo可以通過下調Keap1來促進Keap-Nrf2復合物釋放Nrf2,并使Nrf2從細胞質轉移到細胞核發揮其抗氧化作用,抑制氧化應激介導的細胞焦變性,從而減輕IDD。此外PRP-exo通過調控NF-κB和MAPK通路來抑制M1巨噬細胞的極化,促進STAT6磷酸化影響M2巨噬細胞的極化,增加NLRP3泛素化和減少IL-1β和Caspase-1的產生促進NLRP3的自噬降解。同時,PRP-exo還可減少IL-1β誘導的NPCs凋亡[17]。PRP-exo對IDD的治療作用顯示了PRP在IDD非細胞療法中的巨大潛力。

這都充分驗證了PRP在促進NPCs增殖、分化、抗炎、抗氧化等方面具有重要作用。盡管如此,對PRP-exo的相關研究還很有限。將來的研究可以向分離PRP中的有效成分(如外泌體、TGF-β1等)來修復退變的椎間盤靠攏。同時,PRP對細胞增殖的積極作用不與PRP的濃度呈正相關,高濃度的PRP也可能抑制細胞增殖,而低濃度的PRP可能對細胞增殖有長期的積極影響[15]。

2.2 體內研究

PRP的體內實驗不僅可以模擬臨床環境的修復過程,還可以發揮其作為一種自體動態、海綿狀纖維蛋白基質支架的真正治療潛力,為臨床應用奠定基礎。

與體外研究得出的結論一致,由于PRP中TGF-β含量較高,可以激活TGF-β/Smad 2/3途徑,促進COLⅡ和其他基質成分的合成和分泌,從而延緩IDD[15]。含有PRP的水凝膠能有效修復大鼠的退變椎間盤[18]。PRP發揮修復作用的前提是被凝血酶等激活物激活,從而將其含有的各種生長因子釋放出來。然而激活后的PRP會立即轉變為凝膠狀,不利于注射。這為PRP的研究帶來了新的挑戰,先前的研究從激活的PRP中提取出呈現液態、可用于椎間盤注射的富血小板血漿釋放物(platelet-rich plasma releasate,PRPr),注射入退變椎間盤后,椎間盤高度、組織學形態、細胞數量、ECM含量均得到明顯改善,并且PRPr治療后椎間盤內的AGC和COLⅡ含量升高[19]。提高PRP中血小板含量將有助于獲取更高活性的PRPr,這為PRP治療IDD提供了新的方向。

細胞治療IDD的局限性之一是由于IDD的惡劣微環境限制了MSCs的生存和分化能力[20],而PRP卻可以通過誘導ECM合成和分泌來調控細胞外微環境[21]。

最近,有研究將PRP作為水凝膠成分,構成負載MSCs的載體,用來修復退變的椎間盤。結果顯示含有PRP的水凝膠不僅可以維持椎間盤結構的完整性,同時可以增強MSCs的增殖活力及抗氧化能力[22-23]。

含有PRP的水凝膠與骨髓間充質干細胞或脂肪間充質干細胞聯合注射到退化的動物椎間盤中發現MSCs在體內移植后能存活12周,遠超過單純注射MSCs[24-25]。這是由于注入椎間盤的PRP可以被周圍組織激活,與MSCs形成三維支架,維持MSCs的增殖與活力,保持其持續的再生作用。以上這些研究表明,PRP與MSCs的聯合治療或許是治療IDD的更好方式,然而最佳的PRP和MSCs的移植方法和治療比例仍不明確,希望將來可以制定出與MSCs聯合使用的最佳比例。且PRP通過哪種方式來調控MSCs的增殖分化能力及抗氧化還有待進一步探討。

3 PRP在IDD修復中的臨床應用

體外實驗和體內實驗都已證明PRP對退變椎間盤的治療作用,接下來需要在臨床試驗中進一步驗證。一項對47例慢性腰椎間盤源性疼痛患者的前瞻性、雙盲、隨機對照研究表明[26],與對照組相比,椎間盤內注射PRP在功能[功能評分指數(Functional Rating Index,FRI)、疼痛(數值評分量表(Numeric Rating Scale,NRS)]和患者滿意度方面有統計學意義的改善。經過一年的隨訪,NRS、FRI和SF-36疼痛評分從基線到6個月再到1年得到持續顯著的改善。兩年以后PRP注射液治療對疼痛和功能的改善仍舊具有統計學意義,并且注射PRP沒有顯示出不良事件[27]。Cheng等[28]將隨訪時間再次延長至5～9年,結果顯示這部分患者在注射治療5～9年同樣表現出統計學上和臨床上顯著的疼痛和功能改善。一系列臨床隨訪充分說明PRP采取椎間盤注射法治療IDD是可取的并且具有長期療效。此外,有研究評估了在透視引導下硬膜外椎板間注射5mLPRP治療慢性IDD相關下腰痛患者的臨床療效。在為期3個月的研究中,患者癥狀逐漸持續改善,VAS評分和改良Oswestry殘疾問卷評分均有所改善。值得注意的是,經硬膜外注射的PRP可直接進入病變神經根區域,同樣沒有產生不良反應[29]。鑒于該試驗隨訪時間較短,仍需進一步的研究來探明經硬膜外椎板間注射PRP的長期有效性及安全性。

在有限的研究中我們可以發現,不論是在椎間盤內注射PRP還是通過硬膜外椎間板注射PRP,對退行性椎間盤的治療都有作用,且沒有不良事件發生。希望將來可以有更多的臨床資料來優化PRP治療策略,更好地服務于臨床IDD的修復。

4 總結與展望

IDD是一種慢性退行性疾病,其特點是NPCs數量減少,ECM降解,促炎因子水平升高。PRP作為生物治療IDD的重要組成部分,其所含有的各種生長因子不僅發揮促進NPCs增殖、ECM合成、抑制炎癥反應、改善退變椎間盤的微環境的作用。而且PRP不會造成免疫排斥反應和疾病的傳播,還可以通過離心制備。經PRP改善后的微環境更加適合MSCs的生存,此外,PRP與MSCs在IDD的聯合使用,為IDD的修復提供了一個全新的、可行的策略。

然而,PRP的制備標準一直未能得到統一,不同方法得到的PRP中生物活性成分含量存在顯著差異,且對于能夠引發最優作用效果的PRP的確切體積分數尚無明確定論。目前已明確修復作用機制的生長因子是TGF-β1,其他生長因子的作用機制還有待進一步研究。值得注意的是隨著年齡的增長,PRP依賴其生長因子對IDD的修復作用會因細胞膜上生長因子的受體的減少而變差,所以PRP主要作為一種早期預防椎間盤進一步退變的治療方式。隨著生物治療成為研究熱點,PRP與MSCs的聯合應用或許可以結合兩種治療的優點,成為新的研究方向。

利益沖突:所有作者均申明不存在利益沖突。