地皮菜水應激蛋白的研究進展

陳曉霞,路曉慶,張桓虎

(1. 山西醫科大學 第二臨床醫學院,山西 太原 030001;2. 山西省腫瘤醫院,山西 太原 030001)

普通念珠藻(圖1)俗稱地皮菜[1],屬于藍藻門念珠藻屬[2],在全國各地均有所分布,因其豐富的營養價值和特殊的生物活性,而具有重要的藥用價值[3]。地皮菜中重要的組成部分水應激蛋白,屬于酸性多肽,等電點(PI)位于4.3～4.8[4-5]。目前,水應激蛋白已被發現廣泛存在于念珠藻屬中,但其在地皮菜中的含量更為豐富,其中,細胞外基質總蛋白量可達83.6%[6]。水應激蛋白的一些生物學活性,包括抗輻射、抗干旱和抗瘤性等都顯示其具有重要的研究價值[7]。

圖1 野生的念珠藻[1]Fig.1 Wild N. commune vauch[1]

1 水應激蛋白的來源

地皮菜由細胞細絲和大量細胞外基質組成,水應激蛋白則是地皮菜細胞外基質的特征性成分[8],對于維持細胞外基質的結構功能具有重要作用[9],可通過基因表達及蛋白質水解產生。這些具有異質性,在基因型中具有高度的多樣化,所表達的一系列蛋白被統稱為水應激蛋白[8]。其經胞內降解和修飾后,相對分子量大小各異。Sokamoto等[10]報道稱:水應激蛋白是1個單拷貝基因,由1個單順反子的操縱子調控,其各種亞型可能是由于脫酰胺、共價修飾或者是由蛋白酶水解構成。

2 水應激蛋白的結構

目前,關于水應激蛋白質的結構尚未明確。同源建模作為一種模擬蛋白質三維結構的常規技術,具有很強的權威性[11]。而蛋白質三維結構(SWISS-MODEL)是目前最具有權威性的系統[12-13]。根據已知的水應激蛋白基因片段,使用SWISS-MODEL對水應激蛋白的3D結構進行了預測,結果見圖2。其具體蛋白質結構的測定還需要依賴核磁共振和X線晶體學等技術的輔助驗證。蛋白結合位點仍需要借助肺通氣功能(PFT)成像功能化探針等技術進一步確定,以期尋找出特異性識別位點[14]。

圖2 水應激蛋白的3D預測結構Fig.2 3D predictive structure of N. commune vauch

3 水應激蛋白的制備

3.1 水應激蛋白的提取和分離

目前對地皮菜的研究多集中于水應激蛋白的活性功能方面,運用合適的手段從地皮菜中提取分離出高質量的水應激蛋白具有重要的理論和現實意義。目前,主要通過水提法、鹽提法和酸提法等方式提取植物蛋白[15]。由于水應激蛋白在干燥念珠藻中的含量較為豐富,因此,可采用生物化學手段,如:丙酮硫酸銨沉淀法[16-17]。該方法簡單快捷,能有效提取水應激蛋白[18]。但仍存在一些問題,例如:分離不充分時,會導致雜質混于樣品中。另外,較長時間的樣品浸泡,會影響丙酮對水應激蛋白的修飾。針對上述問題,應繼續研究相關的水應激蛋白提取、分離方法,以期尋找出更合適的提取方案,來增加提取純度,為水應激蛋白的深度提純和開發創造條件。

3.2 水應激蛋白的誘導表達

除了物理方法外,也可通過基因重組技術誘導原核系統對水應激蛋白進行大量表達[19]?？紤]到遺傳學、生物化學和分子生物學等方面,大腸桿菌已成為眾多異源蛋白質的首選表達系統[20]。

目前,學者們通過對表達與純化條件的不斷優化,成功獲得了具有生物活性的水應激蛋白[17],為其開發利用提供了基礎。此外,進一步的截短優化,成功獲取到了免疫反應小、安全性高的活性肽,并明確了截斷體活性片段的生物活性[17],也為研究水應激蛋白各保守結構,細化各結構域的生物活性創造了條件[21]。

4 水應激蛋白的生物活性

4.1 抗干旱作用

干旱脅迫是導致作物減產的重要環境因素[22]。植物可感知缺水信號,并啟動應對策略的能力被定義為抗旱能力[23]。地皮菜在干旱或濕潤的環境中都具有很強的適應能力。在干旱過程中,能處于一種“靜息”狀態,降低生存活動,此過程可長達100年[24]。而當水源充足時,便會迅速恢復其原有的生存能力,重新進行呼吸及光合作用[25]。早在20世紀80年代,學者們已經在結構、生理和生化水平上對地皮菜的干燥耐受性進行了研究[26]。Ye等[27]報道了水應激蛋白在藍藻類生物抵抗干旱環境中起到的關鍵作用。Scherer等[28]研究發現:當菌落經受干燥和再水化的重復循環時,地皮菜會積累一組新的酸性蛋白質,即為水應激蛋白;其經由再水化后,分泌到細胞外多糖鞘中,以維持基質的保護作用,為細胞提供生存保護[6,29]?？傊?水應激蛋白在地皮菜遭遇環境脅迫,特別是在干旱時,發揮著重要作用,即水應激蛋白可能是一種具有細胞應激抗性的蛋白。

4.2 抗輻射作用

地皮菜可適應具有高水平輻射的環境[10]。在黑暗條件下進行培養,會造成水應激蛋白的缺失,而紫外線會影響水應激蛋白mRNA的擴增,導致水應激蛋白分泌增加,使擴增比例最高可達4倍[30]。由此說明:水應激蛋白在抗輻射中發揮著重要作用[9]?，F今社會發展迅速,人們受到輻射損傷的風險大大增加,因此,需要不斷尋找更為有效、安全的抗輻射藥物。Peng等[31]和倫博書等[32]研究認為:部分中藥具有輻射保護作用,可抗自由基,抑制DNA的損傷,且具有更少的副作用。因此,地皮草中的水應激蛋白有望被開發為一種新的抗輻射制劑。

4.3 抗腫瘤活性

近年來,國內外學者圍繞水應激蛋白的抗癌功效也進行了一系列研究。Guo等[5]的研究結果證實:水應激蛋白可通過殺滅結腸癌細胞(HCT-116、HT-29和SW480)來阻滯結腸癌細胞的增殖,而這種殺傷作用對正常腸上皮細胞幾乎無影響。水應激蛋白還可通過G1/S阻滯誘導生長,介導含半胱氨酸蛋白酶(caspase)依賴途徑,誘導細胞的凋亡[5]。通過靶向受體FZD1,水應激蛋白通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路,從而發揮抗結腸癌的效應[17]。同時,郭松佳[33]進行了裸鼠實驗,同樣證實了在機體水平,水應激蛋白可以損傷腫瘤細胞,而對正常細胞無影響。

在腫瘤發展過程中,腫瘤轉移是影響預后的重要環節,通?？赏ㄟ^黏附改變,誘導轉移開端[34]。近年來,郭松佳等[35]發現:水應激蛋白能夠抑制結腸癌細胞的侵襲和浸潤。這一過程是通過促進人結直腸腺癌上皮細胞(DLD1)細胞間的黏附,以降低細胞-基質間黏附的實現,同時,此過程由鈣黏蛋白E(E-cadherin)及神經鈣黏素(N-cadherin)等關鍵分子以及下調PI3K/ AKT/mTOR通路激活自噬介導,證實了念珠藻水應激蛋白具有顯著的抗結腸癌活性[36]。目前,本課題組正在研究水應激蛋白抗胃癌及對其他腫瘤的效果,以期可以為腫瘤患者提供新的治療方法。

4.4 糖苷酶活性

水應激蛋白具有β-D-半乳糖苷酶活性,并且與1,4-β-D-木糖苷酶活性相關,可參與細胞周圍高分子聚合物的水解[37]。β-D-半乳糖苷酶通過催化乳糖,可進一步水解生成葡萄糖和半乳糖[38]。1,4-β-D-木糖苷酶在木聚糖降解的過程中起著重要的作用,可通過木糖和木糖寡糖的非還原末端連續去除β-木糖基殘基,從而在木聚糖水解期間減輕內切木聚糖酶的終產物抑制效應。降解之后的木糖對于念珠藻共生的細菌及真菌生長過程均具有重要作用,可幫助細胞擴散,從而擴大該藍藻的菌落[39]。

5 應用前景與展望

5.1 提取工藝的優化

目前,水應激蛋白的提取工藝,諸如:丙酮沉淀提取法具有殘留雜質多、會破壞有效成分等缺點,而基因工程表達的蛋白常常會形成不溶性的包涵體,喪失其原有生物功能。因此,尋找合適的蛋白提取工藝,尤其是將各法所提取的蛋白在各項指標上進行比對,具有重要意義。

5.2 農作物抗旱及抗輻射的應用

對于植物抗干旱能力的提高已成為目前作物研究的一大熱點。但尚未有過表達水應激蛋白能否改善作物抗干旱能力的相關報道,因此,深入利用水應激蛋白的抗旱特性,有望提高作物抵御嚴重干旱和抗紫外線輻射的能力。

5.3 抗消化系統腫瘤的應用前景與對分子機制的研究

目前,水應激蛋白對于腫瘤細胞的調控機制尚不完全清楚,并且缺乏其激活下游信號通路的機制說明。根據已獲取的基因序列,對水應激蛋白及受體蛋白的結合效果進行模擬,以尋找受體蛋白,對于篩選出靶標受體具有重要的參考價值。目前,國內外研究者仍在不斷挖掘中草藥中的抗癌成分,并以此為基礎,提取了大量有抗癌潛力的成分。研究提示:水應激蛋白在消化道腫瘤中可能發揮著重要的作用,具有重大的研究意義。

5.4 蛋白制劑的開發

藥物研發人員可以根據水應激蛋白的特性,利用蛋白質工程技術進一步開發出適用于腫瘤患者的蛋白藥物?；蚬こ炭梢詫崿F水應激蛋白的大量制備。然而對于蛋白質類藥物而言,其相對分子量大,給藥周期長而頻繁。如何利用新的生物技術,以提高水應激蛋白的生物利用度,對水應激蛋白進行改造修飾,穩定其生物活性,仍值得進一步研究。因此,水應激蛋白仍具有巨大的醫學應用潛力。