斜生柵藻對全氟辛酸和Zn2+聯合脅迫的生理生化響應

楊順航，李立杰，余佳妮，葛 恒，馬永華，廖木蘭 ,尤德雨，李慧明,譚鳳霞，柴 毅1,,，汪正剛

（1.長江大學濕地生態與農業利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025;2.長江大學動物科學技術學院，湖北 荊州 434025;3.長江大學農學院，湖北 荊州 434025；4.荊州市漁都特種水產養殖公司，湖北 荊州 434000）

全氟辛酸（Perfluorooctanoate，PFOA）是典型的全氟化合物（Perfluorinated compounds，PFCs），是一種新興的、持久性的環境污染物，普遍存在于各種環境介質中，尤其在水環境中表現出明顯的遠距離遷移性和匯集性[1]。目前在我國長江[2-3]、錢塘江流域[4]及湖泊[5]中均有檢出。研究表明PFOA 會對動物的生長發育、繁殖、代謝和免疫等造成毒性作用[6-9]，并可以通過食物鏈富集積累，嚴重危害生物健康。我國于2020 年將PFOA 列入《優先控制化學品名錄》[10]。

鋅是常見的重金屬污染物之一，通常用于金屬開采和精煉，會與廢水污染物一起進入水生系統[11]，具有難降解性。在工業化地區的河流[12-13]、河涌[14]和湖泊[15-16]中普遍檢出。Zn是水生生物生長生理必需的微量元素，適度攝入有助于增強免疫力及抗病能力，而過量攝入則會對其生長、組織發育、免疫等生理生化功能造成影響[17-21]。

隨著環境污染問題的加劇，水生生物可能暴露在多種污染物下，如重金屬和持久性有機污染物。近來的研究越來越關注不同種污染物對水生生物可能的聯合作用，如微塑料和鉛對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）[22]；馬度米星銨和銅對鯽（Carassius auratus）[23]；銀和二氧化鈦納米顆粒對大型水蚤（Daphnia magna）[24]。然而，目前關于全氟化合物和重金屬對水生生物尤其是藻的聯合毒性作用的研究報道較少。微藻是水生態系統中主要的初級生產者，具有體積小、世代周期短和對環境敏感等特點，也是食物鏈中富集環境污染物的起點。因此，本研究通過探究PFOA 和Zn 單一及聯合脅迫對斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）藻細胞生長、光合色素、抗氧化酶活性和轉化氨氮等的影響，闡明二者對斜生柵藻的聯合毒性作用，明確重金屬和全氟化合物在水環境中的暴露風險，以期對水環境風險評價、管控、可持續發展與利用及污染水體中藻類參與的氮循環提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

受試生物：斜生柵藻（S.obliquus，FACHB-13）購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。

試劑：七水合硫酸鋅ZnSO4·7H2O（CAS7446-20-0）純度為99%，購自阿拉丁試劑有限公司；全氟辛酸（PFOA，CAS335-67-1）純度為96%，購自sigma-aldrich 化學制品有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 藻種擴大培養

采用BG11 培養基進行接種，將其置于光照培養箱（GZX-250BSH-Ⅲ，上海新苗醫療器械制造有限公司）中擴大培養。培養條件：溫度（25±1）℃，光暗比12 h:12 h，照度5 000～8 000 lx，每日搖動培養瓶3～4次，每7～14 d轉接一次，藻類進入對數生長期后使用改良的BG11培養基（未添加ZnSO4·7H2O）饑餓培養3 d 后進行實驗。配制的BG11 培養基及玻璃器皿均經120 ℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30 min。擴培與轉接均在無菌操作臺中操作。

1.3 實驗設計及方法

實驗方法參照《淡水生物水質基準推導技術指南》[25]，微藻采用靜態暴露方式。將ZnSO4·7H2O 與PFOA 分別溶于水配置成一定質量濃度的母液。根據預實驗結果設定PFOA 和Zn2+對斜生柵藻急性毒性效應的濃度，如表1。用培養基稀釋，現用現配。選取對數生長期的斜生柵藻藻液，以3 000g離心15 min，去離子水重懸，再離心，重復3 次，去除藻細胞表面去除的殘留物質，藻泥加入300 mL 錐形瓶中，再加入培養液稀釋已配置的母液至所需質量濃度，藻液培養體積為150 mL，初始藻密度為1 ×106mL-1，空白組（組號1）和實驗組均設三個重復。為防止藻細胞粘在瓶壁，每日搖動培養瓶3～4 次，實驗周期為96 h。

表1 鋅、全氟辛酸單一及聯合實驗設計Table 1 Design of single and compound exposure groups to Zn2+and PFOA mg/L

單一毒性實驗測得PFOA 和Zn2+對斜生柵藻的96 h-EC50，定義EC50(PFOA)+EC50(Zn2+)=1 TU(毒性單位)，根據預實驗結果，聯合毒性實驗梯度設置如表1。每組三個平行，并設置空白對照組。

1.4 藻細胞濃度測定

用血細胞計數板對藻細胞進行計數，波長685 nm下測定藻液光密度，建立不同藻細胞濃度和光密度之間的線性關系（?=80.897 1x-0.139 1，R2=0.997 6)，根據光密度線性方程計算出的藻細胞濃度表示生物量，每24 h 計測定各組斜生柵藻的光密度，實驗結束后繪制生長曲線[26]。

1.5 葉綠素a(Chl a)質量濃度測定

在實驗結束時，各處理組取5 mL 藻液，以3 000g離心15 min，并用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.3）清洗3次，去除上清液，加入5 mL體積分數為95%的乙醇在75 ℃水浴鍋中水浴3 min。再次離心后測定在649 nm和665 nm處光密度，并依據下面公式進行計算葉綠素a質量濃度（mg/L）[27]：

1.6 生理生化指標、活性氧自由基(ROS)、藻細胞膜通透性和線粒體跨膜電位(Δψm)測定

總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量、總蛋白含量（TP）、活性氧自由基（ROS）和總超氧化物歧化酶活性（SOD）用南京建成生物工程研究所相應的試劑盒（A015-3-1、A003-1、A045-4、E004-1-1、A001-3-2）進行測定。二乙酸熒光素（Fluorescein Diacetate，FDA）法測定細胞通透性[28]。羅丹明（Rhodamine 123，Rh123）法測定線粒體跨膜電位（Δψm）[28]。

1.7 細胞表面形態分析

96 h 時，對照組、16 mg/L Zn2+處理組、350 mg/L PFOA 處理組與1.5 TU 聯合暴露處理組分別收集5 mL 藻細胞。藻細胞固定加入0.01 mol/L PBS（pH 7.3）清洗三次，在真空低溫干燥機中-75 ℃脫水6 h，再噴金45 s，使用掃描電鏡(SEM，TESCAN VEGA 3)觀察拍照[26]。

1.8 暴露液指標測定

1.8.1 暴露液中總氮、硝態氮、氨氮含量的測定 取50 mL 藻液用循環水式真空泵抽濾，抽濾后的濾液過孔徑0.45 μm濾膜得到濾液。

總氮含量用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定[29]。硝態氮含量用紫外分光光度法測定[30]。氨氮含量用納氏試劑比色法測定[31]。

1.8.2 Zn2+和PFOA 濃度的測定 取實驗前后的藻液，高速離心（4 500g，10 min）獲得上清液，利用原子吸收分光光度法[32]對上清液中的Zn2+濃度進行測定，利用高效液相色譜法（HPLC）[33]對上清液中的PFOA 濃度進行測定，重復三次取平均值為上清液中Zn2+和PFOA的濃度，計算去除率（%）。

式中：N，去除率（%）；c1，去除前水體中污染物質量濃度（mg/L）；c2，去除后水體中污染物質量濃度（mg/L）。

1.9 數據處理

1.9.1 急性毒性 利用概率單位-質量濃度法[9]計算96 h-EC50。

式中：N1為t1時刻的細胞數，Nn為tn時刻的細胞數。

式中：Uc為對照組的比生長速率，Ut為處理組的比生長速率。

把各濃度的生長抑制率I轉換為概率單位，進行線性回歸分析，得到回歸方程，并計算PFOA 和Zn2+分別對斜生柵藻的96 h-EC50。

1.9.2 聯合毒性 利用毒性單位法（TU）、添加指數法（AI）和混合毒性指數法（MTI）三種方法評定聯合毒性效應[34]。

1.9.3 數據統計分析 實驗均進行三次重復，數據采用SPSS（PASW Statistics 18）軟件進行Probit 擬合、單因素方差分析（ANOVA）的LSD 多重比較（P＜0.05時差異顯著）。用Graphpad Prism 8.0繪圖。

2 結果

2.1 鋅和全氟辛酸對斜生柵藻生長的影響和毒性效應

不同暴露條件對斜生柵藻生長情況的影響如圖1 所示，隨著培養時間的延長，各處理組的細胞濃度基本均呈現升高趨勢，在實驗所選的處理濃度，污染物對斜生柵藻表現出明顯的抑制作用（P＜0.05），且隨著濃度增高抑制作用增強。在96 h時抑制率最高。

圖1 不同暴露條件對斜生柵藻的生長影響Fig.1 Growth of Scenedesmus obliquus under different exposure conditions

根據概率單位-質量濃度法獲得Zn2+與PFOA對斜生柵藻的EC50擬合曲線整理數據如表2，可知Zn2+和PFOA 的96 h-EC50分別為14.17 mg/L 和198.98 mg/L，即鋅離子對斜生柵藻的生長抑制更為明顯毒性作用更強，兩種污染物聯合脅迫對斜生柵藻的96 h-EC50為0.97 TU。根據毒性單位法、相加指數法和混合毒性指數法算出數值如表3，綜合三種毒性評價方法得出結論，兩者對斜生柵藻的聯合毒性作用應為部分相加作用。

表2 線性擬合模型參數和96 h-EC50值Table 2 Parameters of linear fitting model and the 96 h-EC50 values

表3 聯合作用類型Table 3 Joint action type

2.2 鋅和全氟辛酸對斜生柵藻Chl a含量的影響

Zn2+和PFOA 對斜生柵藻Chl a 含量的影響如圖2 所示。96 h 培養中，隨暴露濃度的增加，斜生柵藻Chl a含量與其生長情況呈現相似的遞減規律，且均差異顯著（P＜0.05），表現出劑量-效應關系。斜生柵藻在單一Zn2+暴露中，隨著Zn2+濃度的升高，各濃度組Chl a 含量呈現下降趨勢，16 mg/L Zn2+處理組質量濃度最低，為0.38 mg/L（圖2(a)）。在PFOA單一暴露組中（圖2(b)），不同濃度的PFOA 處理組Chl a含量均低于對照組，其中280、350 mg/L的處理組之間無明顯差異（P＞0.05），分別為0.39、0.35 mg/L。Zn2+和PFOA 聯合暴露體系中（圖2(c)），各組Chl a含量均呈現下降趨勢，且差異顯著（P＜0.05），且在1.5 TU時達到最低為0.37 mg/L。

圖2 不同暴露條件下斜生柵藻的葉綠素含量變化Fig.2 Changes of chlorophyll content in Scenedesmus obliquus under different exposure conditions

2.3 鋅和全氟辛酸對斜生柵藻細胞膜通透性和線粒體跨膜電位（Δψm）的影響

如圖3，單個細胞膜通透性水平隨污染物濃度的升高而升高，Δψm呈現降低趨勢。4～16 mg/L Zn2+處理組與對照組間差異顯著（P＜0.05），單個細胞膜通透性水平分別為對照組的1.37～2.55 倍，Δψm相比對照組分別下降18.88%～45.88%。在PFOA單一暴露組中（圖3(b)）各處理組與對照組間均差異顯著（P＜0.05）；Zn2+和PFOA 聯合暴露體系中（圖3(c)），0.6～1.5 TU處理組細胞通透性水平為對照組的1.28～2.64倍，差異顯著（P＜0.05）。Δψm水平相比對照組下降10.02%～45.13%，差異顯著（P＜0.05）。

圖3 不同暴露條件下斜生柵藻的細胞通透性和線粒體跨膜電位變化Fig.3 Changes of cell permeability and mitochondrial transmembrane potential in Scenedesmus obliquus under different exposure conditions.

2.4 鋅和全氟辛酸對斜生柵藻ROS和MDA的影響

不同暴露條件下斜生柵藻的ROS和MDA 的變化如圖5 所示，在96 h 實驗中，ROS 和MDA 含量均隨污染物濃度的增加而升高。如圖4(a)，8、16 mg/L的Zn2+處理組與對照組相比差異顯著（P ＜0.05），ROS 分別為對照組的2.17、4.32 倍，MDA 為對照組的1.21、1.43 倍。由圖4(b)，與對照組相比，140～350 mg/L 的PFOA 處理組差異顯著（P＜0.05），350 mg/L 的處理組ROS 和MDA 最高，分別為對照組的4.68 和1.68 倍。聯合暴露體系中（圖4(c)），1.2、1.5 TU處理組ROS含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05），分別為對照組的2.84、4.51 倍，0.6～1.5 TU處理組MDA含量為對照組的1.30～1.65倍，差異顯著（P＜0.05）。

圖4 不同暴露條件下斜生柵藻的ROS和MDA變化Fig.4 Changes of ROS and MDA in Scenedesmus obliquus under different exposure conditions

圖5 不同暴露條件下斜生柵藻的總蛋白含量的變化Fig.5 Changes of TP in Scenedesmus obliquus under different exposure conditions

2.5 鋅和全氟辛酸對斜生柵藻抗氧化酶和能量代謝的影響

不同暴露條件對斜生柵藻的TP 含量的影響如圖5 所示，在96 h 實驗中，隨著污染物濃度的升高，各組的TP 質量濃度均呈現明顯降低趨勢。Zn2+、PFOA 單一及聯合暴露中斜生柵藻的最低TP 質量濃度均為污染物最高濃度組，且分別為對應批次中對照組的50.97%、42.93%、47.13%。

不同暴露條件對斜生柵藻的T-AOC 和SOD 活性影響如圖6 所示，T-AOC 和SOD 活性隨著污染物濃度的升高呈現升高趨勢。如圖6(a)，2～16 mg/L的Zn2+處理組T-AOC 為對照組的1.42～2.64 倍，差異顯著（P＜0.05）。1～8 mg/L Zn2+處理組SOD 活性，與對照組相比沒有顯著差異（P ＞0.05），16 mg/L的處理組與對照組相比差異顯著（P＜0.05），為其的1.26倍。在PFOA單一暴露組中（圖6(b)），不同濃度的PFOA 處理組T-AOC 和SOD 活性均高于對照組，且350 mg/L 處理組最高，分別為對照組的3.15 和1.47 倍。聯合暴露體系中（圖6(c)），1.2 TU、1.5 TU處理組T-AOC 分別為對照組的2.03、2.95 倍，SOD活性分別為對照組的1.21、1.38倍。

圖6 不同暴露條件下斜生柵藻的總抗氧化能力和超氧化物歧化酶活性變化Fig.6 Changes of T-AOC and SOD in Scenedesmus obliquus under different exposure conditions

2.6 生理生化指標之間的相關系數

如表4所示，ROS與MDA、T-AOC、SOD活性和細胞膜通透性水平呈顯著正相關，分別與Chl a、TP和Δψm呈顯著負相關。

表4 斜生柵藻各參數之間的Pearson相關系數Table 4 Pearson correlation coefficient matrix among parameters of Scenedesmus obliquus

2.7 鋅和全氟辛酸暴露對藻細胞的損傷

藻類細胞的表面形態如圖7。對照組藻細胞外部形態呈現橢球形且結構完整，細胞表面鞭毛清晰可見(圖7(a))。而16 mg/L Zn2+處理組（圖7(b)）中藻細胞外部形態溶解破裂，部分碎裂物團聚在一起。350 mg/LPFOA 處理組（圖7(c)）中藻細胞外部可見明顯溶解破裂且有嚴重的變形。1.5 TU聯合暴露組（圖7(d)）中藻細胞表面形態變形，有部分團聚體吸附導致細胞裂解，間隔模糊。

圖7 不同暴露條件下斜生柵藻外部形態變化Fig.7 Changes of external form in Scenedesmus obliquus under different exposure conditions

2.8 鋅和全氟辛酸暴露濃度對斜生柵藻轉化氨氮的影響

由圖8 可以看出，不同濃度的污染物對暴露液中總氮和氨氮含量存在明顯影響，整體呈現升高趨勢，硝態氮一直處于較低水平。

圖8 不同暴露條件下斜生柵藻暴露液中總氮、硝態氮、氨氮含量變化Fig.8 Changes of TN、NO3--N and NH4+-N Content in Scenedesmus obliquus under different exposure conditions

如圖8(a)所示，培養96 h 后，4～16 mg/L 的Zn2+處理組總氮質量濃度（0.21～0.26 mg/L）顯著高于對照組（0.162 mg/L）（P＜0.05）。暴露液中的硝態氮一直處于較低水平（0.026～0.081 mg/L），高濃度處理組間（8、16 mg/L）差異顯著（P＜0.05）。對照組中氨氮質量濃度僅為0.017 mg/L，而16 mg/L 的Zn2+處理組中氨氮質量濃度達到0.163 mg/L。

如圖8(b)所示，280、350 mg/L 的PFOA 處理組總氮質量濃度（0.21、0.28 mg/L）已明顯高于對照組（0.166 mg/L）。硝態氮含量（0.027～0.032 mg/L）無明顯變化趨勢。各處理組暴露液中氨氮質量濃度（0.06～0.48 mg/L）均高于對照組（0.029 mg/L）。

聯合暴露體系中（圖8(c)），0.6～1.5 TU 處理組暴露液中總氮質量濃度（0.19～0.29 mg/L）顯著高于對照組（0.16 mg/L）（P＜0.05）。硝態氮處于低水平（0.024～0.036 mg/L）。0.6～1.5 TU 處理組暴露液中氨氮質量濃度（0.14～0.50 mg/L）顯著高于對照組（0.027 mg/L）（P＜0.05）。

2.9 鋅和全氟辛酸暴露濃度對斜生柵藻去除率的影響

不同暴露條件斜生柵藻對Zn2+和PFOA 的去除率影響如圖9 所示。Zn2+單獨暴露時，斜生柵藻對其的去除率隨處理組濃度的升高呈現先升后降最后達到平穩狀態的趨勢，且在其質量濃度為2 mg/L時去除率最高為42.83%，大于8 mg/L去除率達到平穩狀態，為14%左右；PFOA 單獨暴露時，斜生柵藻對其的去除率一直處于平穩狀態，在2%左右；聯合暴露時斜生柵藻對Zn2+的去除率隨處理組濃度升高呈現先降低后趨于穩定在10%左右，而對PFOA 的去除率略低于單獨暴露時的，為1.1%左右。

圖9 鋅和全氟辛酸不同暴露條件下斜生柵藻對其去除率的變化Fig.9 Efficiency of Scenedesmus obliquus in removing zinc and PFOA

3 討論

3.1 鋅和全氟辛酸對斜生柵藻生長的影響

在本研究中，Zn2+和PFOA 單一及聯合暴露時，隨污染物濃度的升高，對斜生柵藻的生長表現出明顯的抑制作用，Zn2+和PFOA 的96 h-EC50分別為14.17 mg/L 和198.98 mg/L，聯合脅迫對斜生柵藻的96 h-EC50為0.97 TU。根據毒性單位法、添加指數法和混合毒性指數法計算得出兩種污染物對斜生柵藻的聯合作用類型為部分相加作用。田永靜等[35]研究發現鋅與雙酚A 對普通小球藻（Chlorella vulgaris）的聯合作用類型為協同作用，即聯合暴露會加強其在水環境中的毒性效應。周靜韻等[9]研究發現PFOA 和PFNA 對杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的聯合毒性表現為相加效應，對三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）為協同效應，實驗范圍內PFOA 和PFNA 對兩種藻均表現出明顯的抑制作用。這與本研究結果相一致，二元混合物毒性增強。在本研究中，觀察細胞外部形態時發現Zn2+單一暴露和與PFOA 聯合暴露時，細胞外部可見明顯團聚體纏繞在藻細胞周圍，PFOA 處理組的藻細胞可見明顯的裂解和變形。這可能是因為鋅在水體中單獨暴露時為自由離子[36]，通過與斜生柵藻細胞膜蛋白配體結合表現出生理活性，并替代藻細胞原有的必要元素，參與到細胞生化反應中，導致蛋白質構型變化和斜生柵藻細胞應激，表現為中毒。PFOA 會與細胞膜表面的疏水位點結合，破壞細胞膜完整性，導致胞外污染物進入細胞內損傷細胞器，進而對柵藻胞內代謝產生抑制作用。當Zn2+和PFOA 聯合暴露時，PFOA 可能會與Zn2+絡合成新的產物，這種新的絡合物可能會增加斜生柵藻分子配位點或與原本分子配位點的酸堿軟硬程度更接近，從而表現為更高的毒性[37]。

細胞膜對細胞內外物質交換發生作用[38]。污染物脅迫時，微藻首先會通過自身細胞壁所含官能團或分泌胞外物質與污染物發生螯合，已進入胞內的會在細胞質中絡合形成沉淀，排出胞外[39]。因此，污染物對微藻的損傷首先體現在破壞藻細胞膜和細胞器內膜系統[40]。本研究中，Zn2+和PFOA 單一及聯合脅迫下，細胞膜通透性隨暴露濃度的增加呈上升趨勢。在觀察細胞外部形態時發現，16 mg/LZn2+處理組、350 mg/LPFOA 處理組、1.5 TU 聯合暴露組這三種條件下的藻細胞可見明顯的變形甚至裂解破碎。說明污染物一方面會過氧化細胞膜上的酶和磷脂等物質，另一方面，污染物還會與膜蛋白結合形成配位鍵，使蛋白質內部作用力網絡發生變化而導致蛋白質構型變化，最終損傷細胞膜，表現為細胞膜通透性升高及滲透壓發生變化[41]，導致細胞內蛋白質流失和細胞凋亡。畢相東等[42]研究小檗堿對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）細胞膜通透性的影響時也發現同樣規律。

Chl a 含量變化可以反應微藻的光合作用狀況[43]。在本研究中，隨著污染物濃度的升高，斜生柵藻Chl a 含量顯著下降（P＜0.05）。其原因是Zn2+和PFOA 及其絡合物均能抑制光合作用相關酶的活性，損傷細胞膜和葉綠體結構以阻礙光合色素合成，破壞光合作用，影響能量儲備[44]。本實驗中，當Zn2+和PFOA 質量濃度高于2、140 mg/L，聯合毒性超過0.6 TU 后，TP 含量呈現明顯下降趨勢，最低TP含量均為污染物最高濃度組。TP 含量與Chl a 含量呈現正相關，說明光合作用的減弱導致蛋白質代謝合成途徑受到抑制。前人研究發現，較高濃度的Zn2+會抑制蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的光合作用，濃度繼續增大則會抑制浮游植物的生長、破壞光合器官[35]；PFOA 對蛋白核小球藻的生長具有抑制作用，葉綠素和光合系統也受其負面影響，并且與其光合代謝的相關基因大部分表現出下調[45]。這與本研究結果相一致。

線粒體跨膜電位（Δψm）是由于線粒體內膜兩側的電子分布的不對稱而導致的。正常情況下，線粒體內膜滲透性非常低，這是保持電化學質子梯度和氧化磷酸化的基本結構[46]，而當線粒體內膜被破壞時，Δψm水平就會降低并且導致藻細胞凋亡。本研究中，16 mg/L 的Zn2+、350 mg/L 的PFOA 和1.5 TU處理組Δψm水平分別為對照組的40.75%、34.89%和39.81%。這表明高濃度污染物能夠引起級聯反應，導致細胞凋亡。其具體作用機制是：一方面高濃度的污染物會導致線粒體外膜對蛋白質的通透性增高，可溶性的少量膜間蛋白從線粒體釋放出來[47]。同時釋放Caspase 活化物細胞色素C，導致細胞凋亡[48]。引起Δψm水平降低[49]。另一方面，污染物脅迫時，線粒體通透性轉換孔（MPTP，MPT pore）開放，允許相對分子質量小于1.5×106的分子通過，從而導致內膜兩側離子梯度消失，Δψm水平降低，釋放凋亡誘導因子（Apoptosis inducing factor，AIF）引起細胞凋亡。

3.2 鋅和全氟辛酸對斜生柵藻的抗氧化體系的影響

在微藻中，產生ROS 的主要途徑有葉綠體光合與線粒體電子傳遞鏈以及細胞膜上的氧化還原反應[50]，正常情況下，抗氧化系統能快速清理機體正常產生的少量ROS，使ROS產生和抗氧化系統清除速率一直處于動態平衡中。在接觸到污染物時，藻細胞會產生大量的超過抗氧化系統承受的ROS，并在細胞內累積，毒害藻細胞的光合器官，引起抗氧化系統響應和膜脂質過氧化（主要產物為MDA）[51]。

本研究中ROS 含量隨污染物濃度的增加而升高。16 mg/L Zn2+、350 mg/L PFOA 和1.5 TU 處理組ROS 水平分別為對照組的4.32、4.68、4.51 倍。這表明斜生柵藻在受到高濃度污染物脅迫時，光合作用和線粒體電子傳遞受阻，細胞膜損傷，過剩的電子就會進入分子氧，從而生成ROS?？寡趸到y不能有效清除ROS，就會引起ROS含量升高。藻細胞內ROS的產生與累積可能是污染物致毒機制之一。

T-AOC 是反映機體抗氧化系統功能的綜合指標，SOD 是抗氧化系統的重要組成部分，機體利用抗氧化系統分解細胞中由于應激反應所產生的過量ROS[51-52]。在本研究中，T-AOC 和SOD 活性在高濃度處理組受到誘導而呈現升高趨勢，16 mg/L Zn2+、350 mg/L PFOA 和1.5 TU 處理組T-AOC 分別為對照組的2.64、3.15、2.95 倍，SOD 活性分別為對照組的1.26、1.47、1.38 倍。這表明，隨著污染物濃度增加，藻細胞產生清除過氧化物、維持細胞功能的應激反應，此時抗氧化系統激活抗氧化酶來清除ROS。沈洪艷等[52]研究頭孢噻肟鈉對斑馬魚（Danio reriovar）SOD 活性、MDA 含量及DNA 損傷的影響，以及Kuang 等[53]研究鎘對銅綠微囊藻抗氧化反應時也發現同樣的現象和規律。

MDA 含量能夠反映細胞生物膜受到氧化作用的破壞程度[51]。本研究中MDA 含量在高濃度處理組脅迫條件下顯著增加（P＜0.05），16 mg/L Zn2+、350 mg/L 的PFOA 和1.5 TU 處理組MDA 水平分別為對照組的1.43、1.68、1.65 倍。這表明受到高濃度Zn2+、PFOA 單一及聯合脅迫時，抗氧化系統不足以清除過量ROS 導致膜脂過氧化反應程度提升，生成大量MDA，破壞細胞氧化作用，加劇細胞膜損傷。

3.3 鋅和全氟辛酸暴露濃度對斜生柵藻轉化氨氮的影響

氮素是植物生長發育所必需的營養元素，也是水體環境中對養殖動物產生威脅的污染物之一[54-55]。本研究中氨氮含量與總氮含量均隨污染物濃度的增加而增加，且污染物濃度越高差異越明顯，其中最高濃度聯合暴露處理組與對照組差異最為明顯，硝態氮則一直處于較低水平（0.024～0.081 mg/L）。這可能是因為低濃度污染物能夠誘導斜生柵藻細胞產生金屬硫蛋白（MT）等污染物抗性蛋白，這些蛋白能夠結合污染物使污染物對藻細胞的毒性減弱，而較高濃度污染物破壞了細胞膜等結構，使抗性蛋白從細胞內外流，毒性顯著增強，氨氮吸收過程受到的抑制作用增強，暴露液中的氨氮和總氮含量升高，這也說明Zn2+和PFOA 混合時毒性增強。轉化生成的硝態氮含量低，說明Zn2+和PFOA 單一及聯合暴露時均未對氨氮轉化過程相關酶或者基因產生較大的影響。這與前人的研究結果[56]基本一致。

3.4 鋅和全氟辛酸暴露濃度對斜生柵藻去除率的影響

本研究中，Zn2+單獨脅迫斜生柵藻時，隨著Zn2+初始濃度的升高，去除率先升高后降低最后穩定在14%左右，推測斜生柵藻對Zn2+存在一個固定的去除閾值，在達到這個值之前斜生柵藻會持續去除Zn2+，而較高濃度的Zn2+會對斜生柵藻產生毒害作用，造成細胞壁破碎，去除率持續下降，直到斜生柵藻細胞產生的應激反應中和Zn2+的毒害作用，最終達到動態平衡，此時去除率保持平穩狀態。PFOA單獨脅迫斜生柵藻時，斜生柵藻對其的去除率相對較低且一直在2%左右波動。PFOA 是一種疏水陰離子化合物，疏水性有利于藻細胞對其去除，但其陰離子官能團與帶負電荷的藻細胞之間的靜電作用不利于藻細胞對其吸附，在斜生柵藻去除PFOA以靜電作用為主，即呈現排斥作用導致去除率較低[57-58]。聯合暴露時，斜生柵藻對Zn2+的去除率隨處理組濃度升高呈現降低后穩定于10%左右，且從趨勢看同初始濃度時對Zn2+的去除率略小于Zn2+單一暴露時，而對PFOA 的去除率與其單獨脅迫時相差不大，這歸因于有部分Zn2+與PFOA 結合形成絡合物，其不與細胞壁上的官能團結合，而是部分進入藻細胞內產生毒害作用。

3.5 鋅和全氟辛酸單一及聯合暴露毒性效應

污染物之間的相互作用通常分為拮抗、加和、部分加和及協同作用。對斜生柵藻的聯合毒性研究中，王璞等[59]研究發現相同濃度Cd2+和納米二氧化鈦nTiO2的72 h-EC50值與單一實驗處理組相比顯著上升，表現為拮抗效應；姜航等[60]研究發現MPs和ROX 單一及聯合處理組均能顯著抑制斜生柵藻的藻密度與Chl a含量，兩者的聯合毒性作用為拮抗作用。本研究結果表明，鋅和全氟辛酸對斜生柵藻的聯合作用類型為部分相加作用，毒性強度表現為聯合脅迫＞鋅＞全氟辛酸。在自然水體中，重金屬和全氟化合物是長期共存的，而兩者對水生生物的長期聯合效應尚未探明，因此，有關重金屬和全氟化合物對水生生物的慢性毒性實驗及微藻對兩種污染物的吸收降解和生物富集研究有待后期開展。

4 結論

鋅和全氟辛酸對斜生柵藻的聯合作用類型為部分相加作用，毒性強度表現為聯合脅迫＞鋅＞全氟辛酸。Zn2+和PFOA 單一及聯合暴露時，高濃度處理組（16 mg/L Zn2+、350 mg/L PFOA 和1.5 TU 處理組）會顯著影響斜生柵藻的光合系統和抗氧化體系（P＜0.05），破壞細胞膜和線粒體結構。聯合暴露時抑制氨氮吸收作用更為明顯。斜生柵藻對PFOA 的去除率僅有2%，對Zn2+去除率最高（37.5%）且隨暴露濃度的增加而逐漸降低，表明斜生柵藻可以有效去除鋅污染，但對全氟辛酸污染去除效果欠佳。