手機電磁輻射對耳蝸超微結構及邊緣細胞的影響△

林怡 葉青 程劍彬 吳立錦

(1.福建省老年醫院耳鼻咽喉科 福州 350000； 2.福建省立醫院耳鼻咽喉科 福州350001)

近年來，由于科技發展帶來的通信便利性及生活電子化，智能手機的使用越來越普遍。第45 次《中國互聯網絡發展狀況統計報告》顯示，截至2020 年3 月，我國手機即時通信用戶規模達8.09 億人[1]。然而，手機帶來便利的同時，與其產生的電磁輻射相關的健康風險也受到人們的廣泛關注。手機電磁輻射是一種射頻輻射，國際癌癥研究機構將手機排放的射頻電磁輻射定義為一種可能的人類致癌物[2]。美國國家毒理局進行的短期研究(19 周)和意大利拉馬齊尼研究所進行的長期研究(2 年)均報道電磁輻射暴露使Sprague-Dawley(SD)大鼠大腦惡性膠質瘤和心臟神經鞘瘤的發病率增加。

雙耳是通話過程中手機電磁輻射的直接效應器官，其暴露距離最近、暴露時間最長。最近的一項研究[3]表明，慢性電磁輻射會導致聽力損失相關基因的表達失調，促進前庭神經鞘瘤細胞的轉化并導致聽力損失。內耳和聽覺中樞是聽覺系統中電磁輻射損傷的關鍵，其中耳蝸將來自中耳的聲音信號轉換為神經電信號以傳導至聽覺中樞，是內耳的重要結構[4]。此外，劑量學在人體接觸電磁輻射的風險評估中起著重要的作用，但長期手機電磁輻射暴露是否會對耳蝸超微結構產生影響還缺乏相關證據。在本研究中，為模擬出實際生活中長期使用手機通信的電磁波輻射強度，我們將SD 大鼠暴露于每日不同時長的手機通話狀態中，建立手機電磁波輻射大鼠模型，探討不同輻射暴露時間下長期手機電磁輻射對大鼠聽覺功能、耳蝸超微結構及邊緣細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年SD 大鼠40 只(體重200 ～250 g，雌雄不限)由福建醫科大學實驗動物中心提供[動物編號：SYXK(閩)2018-0001]。適應性喂養10 d 并完善耳部檢查以排除耳部病變后，采用隨機數字表法將大鼠分為4組，每組各10只：對照組(不接受輻射，28 d)、輻射6 h 組(輻射6 h/d，28 d)、輻射12 h 組(輻射12 h/d，28 d)、輻射24 h 組(輻射24 h/d，28 d)。實驗過程中大鼠的生活環境、光照、溫度、外界聲音、飲食恒定，以更精確保證單純電磁輻射對耳蝸的影響。

1.2 手機電磁輻射暴露

將大鼠置于相同暴露參數的環境下28 d，根據實驗分組每日接受不同時長的手機電磁輻射暴露，對照組大鼠除不接受電磁輻射外其余處理與輻射組相同。將塑料質大鼠籠置于大小為75 cm×45 cm×60 cm 的長方形外包細鐵絲網的木質輻照箱內，輻照盒為大小約28 cm×11 cm×23 cm 的長方形塑料盒。輻射源：SM-G3608 4G 手機(三星電子有限公司產品)。鼠在籠中為自由體位，手機處于通話狀態，手機頻率為 900 MHz，功率密度為0.05 MW/cm2，比吸收率(specific absorption rate，SAR)為0.76 W/kg。使用電磁輻射測定儀(北京龍震天科技發展有限公司；型號：LZT6200)進行暴露前測試。手機置于輻照箱內大鼠頭部的水平位置，距離大鼠耳部約7 cm。

1.3 聽覺功能評價

電磁輻射暴露實驗結束后，參照文獻[5]所述方法分別測試對照組及輻射各組大鼠的聽性腦干反應(auditory brainstem response，ABR)、40 Hz 聽 覺 事件相關電位(auditory event-related potential，AERP)1 kHz 反應閾及聽性穩態反應(auditory steady-state response，ASSR)1 kHz、2 kHz 和4 kHz 三個反應閾，以評價手機電磁輻射暴露對大鼠聽覺功能的影響。

1.4 耳蝸組織制備及結構觀察

聽覺功能評價實驗結束后，使用戊巴比妥(50 mg/kg)深度麻醉大鼠并采用斷頭法處死大鼠，打開聽泡，完整取出顳骨并分離耳蝸，在25 倍顯微鏡下打開圓窗和卵圓窗，于蝸頂用耳科纖維手術器械開一小孔。在含2 mmol/L CaCl2的0.1 mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液(pH=7.4)中用2.5%戊二醛灌注耳蝸至鼓室及前庭階，然后用同樣的固定液浸泡1 h。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌后，剝離蝸管骨壁，梯度濃度乙醇脫水后干燥，用離子濺射鍍膜儀噴金鍍膜，通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察耳蝸超微結構。光鏡下觀察標本則使用4%多聚甲醛灌注耳蝸并固定48 h，10 %乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetra-acetic acid，EDTA)脫鈣14 d(每隔48 h 更換一次溶液)，PBS 洗滌后進行石蠟包埋，平行蝸軸切片(片厚4μm)。石蠟切片脫蠟至水，蘇木精-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色后脫水封片，光鏡下觀察。

1.5 彗星實驗檢測耳蝸邊緣細胞DNA 損傷

參照文獻[6]所述方法進行耳蝸邊緣細胞提取及培養。使用彗星實驗檢測試劑盒(美國Trevigen 公司)檢測耳蝸邊緣細胞DNA 損傷情況。根據制造商說明，制備耳蝸邊緣細胞懸液(1×105cells/mL)后在37 ℃條件下將細胞懸液與低熔點瓊脂糖混合，將混合物涂布在預處理的載玻片上4 ℃冷卻30 min，用裂解液避光處理1 h 后進行凝膠電泳。乙醇脫水并干燥后，SYBR? Green 染色，熒光顯微鏡觀察DNA 損傷程度，CASP 彗星分析軟件分析尾部DNA 百分含量(tail DNA %)、尾矩(tail moment)及尾長(tail length)3 個指標，從而比較細胞DNA 損傷程度。

1.6 流式細胞儀檢測電磁輻射對細胞凋亡的影響

使用FITC Annexin V 細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD Pharmingen 公司)檢測耳蝸邊緣細胞的凋亡情況。根據說明，將耳蝸邊緣細胞以1×106cells/mL的濃度重懸于1×結合緩沖液中，然后取100 μL 溶液(即1×105個細胞)轉移到5 mL 培養管內，加入5 μL FITC Annexin V 和5 μL 碘化丙啶后將細胞置于黑暗中室溫(25 °C)孵育15 min。在每個試管中加入400 μL 1×結合緩沖液，在1 h 內通過流式細胞儀(美國Beckman Coulter 公司)進行分析。

1.7 流式細胞儀檢測輻射后活性氧水平

活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒購自上海碧云天公司。根據說明，以1:1 000 的比例用無血清培養液稀釋熒光染料2,7-二氯二氫熒光素、二乙酸酯(2,7-dichlorodi hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)至工作濃度為10 μmol/L，將耳蝸邊緣細胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA 中，37 ℃培養20 min。每隔3～5 min顛倒混勻，使探針和細胞充分接觸。使用無血清細胞培養液充分洗滌細胞，以去除未進入細胞內的DCFH-DA。收集細胞并使用流式細胞儀檢測ROS 水平。

1.8 統計學處理

采用軟件SPSS 20.0 對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料以表示。組間比較使用單因素方差分析及Turkey 檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 手機電磁輻射對大鼠聽覺功能的影響

通過檢測大鼠ABR 反應閾、40 Hz AERP 1 kHz反應閾，以及ASSR 1 kHz、2 kHz 和4 kHz 反應閾以評價電磁輻射對大鼠聽覺功能的影響。由表1 可見，隨著輻射時間的增加，反應閾逐漸升高；各輻射組大鼠的聽覺功能指標反應閾均高于對照組，差異均有統計學意義(P值均＜0.05)。

表1 對照組與輻射各組大鼠的ABR、40 Hz AERP、ASSR 各反應閾 單位： dB HL

2.2 手機電磁輻射對大鼠耳蝸超微結構的影響

2.2.1 掃描電鏡觀察

對照組外毛細胞纖毛束呈V 型排列，且均排列整齊，未出現纖毛粘連、倒伏或脫落(圖1A)。輻射6 h 組外毛細胞個別纖毛出現倒伏，其余結構未觀察到特異性變化(圖1B)。輻射12 h 組部分外毛細胞纖毛排列紊亂，第二、三排纖毛出現粘連、倒伏及脫落情況(圖1C)。輻射24 h 組外毛細胞纖毛大部分出現粘連、倒伏或脫落，僅剩個別外毛細胞纖毛結構及排列保持完整(圖1D)。

圖1 對照組與輻射各組大鼠耳蝸掃描電鏡圖(×3500) A.對照組；B.輻射6 h 組；C.輻射12 h 組；D.輻射24 h 組。

2.2.2 光學顯微鏡觀察

對照組大鼠耳蝸柯蒂器結構完整，靠蝸軸側單排內毛細胞及其外側外毛細胞排列整齊，細胞結構清楚，無明顯腫脹或破裂(圖2A)。輻射6 h 組，柯蒂器形態改變，螺旋隧道結構異常，個別外毛細胞排列不齊，其余結構未見明顯異常(圖2B)。輻射12 h 組，柯蒂器形態異常，螺旋隧道結構破壞，部分外毛細胞丟失，耳蝸內可見少量血細胞滲出(圖2C)。輻射24 h 組，柯蒂器形態異常，螺旋隧道結構破壞且內外毛細胞均出現丟失，蓋膜結構破壞，耳蝸內多個部位可見血細胞滲出(圖2D)。

圖2 對照組與輻射各組大鼠耳蝸HE 染色圖(HE×40)A.對照組；B.輻射6 h 組；C.輻射12 h 組；D.輻射24 h 組?！狙毎麧B出。

2.3 手機電磁輻射對耳蝸邊緣細胞的影響

通過檢測大鼠耳蝸邊緣細胞DNA 損傷程度、細胞凋亡率及ROS 水平，評估手機電磁輻射對邊緣細胞的影響。由表2 可見，各輻射組大鼠的耳蝸邊緣細胞尾部DNA 百分含量(%)、尾矩(μm)和尾長(μm)與對照組比較差異均無統計學意義(P值均＞0.05)。由圖3A 可見，各輻射組大鼠的耳蝸邊緣細胞凋亡率與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。ROS水平檢測結果表明，輻射6 h 組和輻射12 h 組大鼠耳蝸邊緣細胞ROS 水平與對照組比較并未出現顯著差異(P＞0.05)；而輻射24 h 組大鼠耳蝸邊緣細胞ROS 水平高于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.001)(圖3B)。

圖3 手機電磁輻射對耳蝸邊緣細胞的影響 A.對照組與輻射各組大鼠耳蝸邊緣細胞的凋亡情況；B.對照組與輻射各組大鼠耳蝸邊緣細胞的相對ROS 水平。與對照組比較，***示P ＜0.001，差異具有統計學意義。

表2 對照組與輻射各組大鼠耳蝸邊緣細胞彗星實驗參數值

3 討論

在手機通話過程中，雙耳比身體其他部位更為靠近電磁輻射的來源，手機電磁輻射對雙耳的潛在生物學效應可能比其他器官更為嚴重。耳蝸作為聽覺信號的轉換中樞，手機電磁輻射對其的相關影響仍然存在爭議。不同的輻射頻率和暴露時間可能會導致手機電磁輻射對耳蝸的影響表現出不同的結果。手機的全球移動通信系統通常采用900 MHz 或1800 MHz 頻段，Seckin等[7]指出，連續進行1 800 MHz電磁輻射暴露(出生后21 d，1 h/d)可導致幼鼠耳蝸中段的細胞凋亡與壞死，且會造成毛細胞間的連接復合體受損、支持細胞腫脹及柱細胞染色質和細胞質凝聚；而Yang等[8]則報道，1 800 MHz 手機電磁輻射暴露24 h 并不會對SD 大鼠耳蝸邊緣細胞的DNA 造成損傷，也不會導致邊緣細胞凋亡率增加。高頻的短期手機電磁輻射暴露對耳蝸的影響研究結果不盡相同。在本研究中，我們將大鼠暴露于900 MHz 手機電磁輻射，并設計為每組每日接受不同時長的手機電磁輻射，持續28 d，大大增加了輻射暴露周期，以模擬實際生活中成人長時間頻繁使用手機通訊的狀態。

ABR 通過記錄電位響應短暫的聽覺刺激，以評估聽覺通路到達中腦水平的傳導，可以量化聽覺器官的活動和功能[9]。早期的一項研究指出，當人體頭部暴露于手機電磁輻射15 min 后，ABR 的第五波(Ⅴ)出現延遲[10]；但Gupta等[9]報道長期使用手機(1 年以上)并未觀察到ABR 在病例組和對照組之間存在差異。而在本研究中，受手機電磁輻射暴露28 d 后大鼠的ABR 反應閾、40 Hz AERP 1 kHz 反應閾，以及ASSR 1 kHz、2 kHz 和4 kHz 反應閾均顯著高于對照組，并且隨著每日暴露時長的增加，反應閾值也出現升高。實驗結果與Gupta等[9]的研究出現差異，可能是由于我們在長期輻射暴露的基礎上考慮了每日輻射時長的因素，輻射頻率和輻射周期的增加反映了手機電磁輻射對大鼠聽覺功能的累積效應。

外毛細胞能夠放大聲音誘發的耳蝸機械反應，是內耳的“生物馬達”，也是耳蝸中最容易受到傷害的結構之一[11]。哺乳動物的外毛細胞具有非常典型的“V”形靜纖毛束，這些立體纖毛是機電轉換的核心，將聲音震動轉換為可以由大腦解讀的神經信號[12]。外毛細胞的喪失或功能衰竭是出現聽力缺陷的主要原因。在本研究中，隨著每日手機電磁輻射暴露時長的增加，掃描電鏡結果顯示大鼠耳蝸外毛細胞纖毛出現排列紊亂、倒伏、粘連甚至脫落的情況，與Seckin等[7]的研究結果一致。此外，光鏡則更直觀地觀察到螺旋器形態變化及結構破壞，特別是輻射12 h組和輻射24 h 組耳蝸內出現了血細胞滲出。輻射對耳蝸損傷的機制之一可能是輻射引起血管紋及其中微小血管的損傷，導致血-迷路屏障的形態結構損害[13]，可能出現血細胞滲出。此外，早期研究[14]發現，健康志愿者的耳部受手機輻射后其耳部皮膚血流量顯著升高[14]。以上證據提示，頻繁且長期暴露于手機電磁輻射后聽覺功能下降可能與耳蝸出現病理性改變有關。

邊緣細胞是血管紋的主要細胞成分之一，能夠吸收中間細胞產生的鉀離子，對耳蝸電位的產生和維持具有重要作用；邊緣細胞的丟失或功能障礙導致耳蝸電位的減少[15]。我們的實驗結果顯示，無論每日接受的輻射時長如何，手機電磁輻射暴露28 d后各輻射組大鼠的耳蝸邊緣細胞DNA 損傷情況及細胞凋亡率與對照組相比差異無統計學意義，與Yang等[8]的研究結果一致。眾所周知，線粒體DNA 是三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的重要生物學來源，ROS 升高可損傷線粒體DNA，導致嚴重后果，包括呼吸鏈受損，ATP 合成降低，線粒體膜電位崩潰，甚至細胞凋亡[16]。由于邊緣細胞比其他細胞含有更多的線粒體，它們特別容易受到ROS 的攻擊，而內耳的氧化損傷是感音神經性耳聾的原因[17]。世界衛生組織(WHO)將氧化應激評定為與射頻電磁輻射暴露最為相關的健康風險結果之一[18]。體外及體內研究[19-20]表明，手機電磁輻射會導致氧化應激水平上升。盡管在我們的研究結果中并未觀察到邊緣細胞DNA 損傷及凋亡增加，但輻射24 h 組大鼠的ROS 水平升高說明長時間手機電磁輻射的確會導致耳蝸邊緣細胞的氧化應激，但更長期的手機電磁輻射暴露引起的耳蝸氧化應激是否會導致邊緣細胞功能障礙或凋亡仍需進一步研究。此外，ROS 的過度產生導致外毛細胞損失是噪聲性聽力損失的原因之一[21]，因此ROS 也與耳蝸超微結構，特別是外毛細胞的損傷有關，ROS 的激活可能是手機電磁輻射產生生物學效應的主要機制。

綜上所述，長期手機電磁輻射暴露可引起SD大鼠耳蝸超微結構損傷，并導致聽覺功能下降，但不足以引起耳蝸邊緣細胞的DNA 損傷和凋亡，更長時間的輻射暴露會引起ROS 水平升高，而ROS 的激活可能是手機電磁輻射產生生物學效應的主要機制。