龍芽草總黃酮的閃式提取工藝優化及提取物的抑菌和抗炎活性研究

楊 佳, 金哲勇, 姜 君, 金英花*

(1.延邊大學 農學院; 2.延邊大學 實驗動物中心：吉林 延吉 133002)

龍芽草(AgrimoniapilosaLdb.)在民間亦被稱為仙鶴草、脫力草和狼牙草,是薔薇科多年生草本植物,在我國的傳統醫學中被尊為一味珍貴的中草藥[1]。龍芽草中主要含有黃酮類、三萜類、鞣質類等活性成分,并含有鉀、鎂、鐵、硫、磷等微量元素[2]。目前,龍芽草已被廣泛應用于各種疾病的緩解與治療中,如腫瘤、梅尼埃病、滴蟲性陰道炎、咳血、腹瀉等疾病[3-4]。近年來,關于龍芽草的研究主要集中在其活性成分及其在抗腫瘤和降血糖方面的藥理作用。有文章報道,龍芽草富含豐富的黃酮類化合物[5]。研究發現,植物中的黃酮具有廣泛的藥理作用,其抑菌效果覆蓋了多種細菌和真菌[6-8]。此外,黃酮類化合物通過調控炎癥等相關信號通路展現出卓越的抗炎活性[9]。然而,盡管龍芽草在治療疾病上的效果備受推崇,但其具體的活性成分與作用機制尚未得到深入的研究和解讀,特定單一化合物的藥理研究也相對有限。

傳統的黃酮提取方法存在諸多限制,如酶解提取法提取化合物的過程中可能會破壞化合物的某些結構,從而影響到提取的最終結果[10]。而閃式提取法采用特殊的高速動態分子滲透與強烈振動原理來迅速破解植物細胞組織,這種方法確保了細胞內的有效成分能與提取溶劑充分作用,并使目標產物被迅速提取,其優勢在于提取時間短、效率高,并能有效保證所提取的目標產物的結構完整度及生物活性[11]。

該研究采用了響應面法對龍芽草中的總黃酮提取工藝進行了優化,并進一步探索了其生物活性。該研究可為龍芽草在臨床治療上的應用以及未來的新藥開發提供有力的理論支持,具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 植物材料

龍芽草采自吉林省和龍頭道鎮,由延邊大學金英花老師鑒定并提供,將其莖、葉、花穗烘干后進行試驗。

1.2 試驗菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,CGMCC1.282),購自中國微生物菌種保藏中心;沙門氏菌(Salmonellaenteritidis,CGMCC1.755),購自中國微生物菌種保藏中心; 銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,CGMCC1.596),購自中國微生物菌種保藏中心;李斯特菌(Listeriamonocytogenes,CGMCC1.7730),購自中國微生物菌種保藏中心; 大腸桿菌(Escherichiacoli,CGMCC1.8745),購自中國微生物菌種保藏中心; 蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus,CGMCC1.911),購自中國微生物菌種保藏中心。

1.3 試劑與儀器

二甲基亞砜(DMSO)(天津市科密歐化學試劑有限公司,天津,中國)、脂多糖(LPS)(L8274)(Sigma-Aldrich,America)、噻唑藍(MTT)(Sigma-Aldrich,America)、DMEM(Thermo Fisher,America)、胎牛血清(FBS)(Thermo Fisher,America)、2,3,5三苯基氯化四氮唑(TTC)(北京索萊寶科技有限公司,北京,中國)、BCA protein assay kit(Thermo,America)、Anti-iNOS(ABN26)(Millipore,America)、COX-2(SC-1746)(Thermo,America)、β-actin(SC-1616)(Thermo,America)、二氧化碳培養箱(Thermo,America)、酶標儀(上海精密科學儀器有限公司,上海,中國)、電導率儀(上海精密儀器有限公司,上海,中國)、旋轉蒸發器(北京博醫康試驗儀器有限公司,北京,中國)、恒溫培養箱(上海昕儀儀器儀表有限公司,上海,中國)、閃式提取器(上海釩幟精密設備有限公司,上海,中國)、Western Blot電泳儀(Bio-Rad,America)、超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備公司,江蘇,中國)、熒光顯微鏡(OLYMPUS,Japan)、高速冷凍離心機(SIGMA,Germany)。

1.4 方法

1.4.1 龍芽草總黃酮閃式提取工藝的優化研究

1) 單因素試驗 ①提取時間的選擇：取龍芽草粉末10 g,分別按照液料比30∶1 (mL∶g),加入70%甲醇溶劑于閃式提取器內,分別設定提取時間為30、40、50、60、70 s。②提取溶劑濃度的選擇：取龍芽草粉末10 g,分別按液料比30∶1 (mL∶g),分別加入30%、40%、50%、60%、70%的甲醇溶劑進行提取,提取時間設定為之前所選擇的最佳時間。③提取液料比的選擇：取龍芽草粉末10 g,分別按照提取液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (mL∶g)進行提取,提取時間與提取溶劑濃度均設置為之前所選擇的最佳提取條件。

2) 響應面優化在單因素試驗的基礎上,以提取時間、提取溶劑濃度、提取液料比為響應值,采用3因素3水平響應面分析法,通過Design-Expert.8.06分析軟件對龍芽草總黃酮提取工藝進行優化,因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析法的因素與水平

3) 總黃酮含量的測定

參考Siqun J[12]的方法,并稍加改動,以蘆丁作為標準品,利用硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定提取物總黃酮的含量。

1.4.2 龍芽草提取物(APLE)抑菌活性研究

1) 最低抑菌濃度

采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法測定APLE對金黃色葡萄球菌等的MIC[13]：在96孔板加入菌懸液,以DMSO作對照。每孔加入TTC溶液,通過觀察是否有紅色產生來確定不同菌種的最低抑菌濃度。

2) 菌生長測定

參考李麗等[14]的方法進行微生物生長曲線的繪制：取菌懸液加入錐形瓶中,處理組錐形瓶中分別加入濃度為MIC的APLE,對照組加入等量培養液。每隔0.5 h吸取1次菌懸液至比色皿中,用分光光度計在波長600 nm處測定其吸光值,繪制生長曲線。

3) 電導率測定

取50mL濃度為1×108CFU/mL的菌懸液于錐形瓶中。處理組錐形瓶中分別加入濃度為MIC的APLE,對照組加入等量培養液。使用電導儀每隔0.5 h測定菌懸液的EC值。

1.4.3 APLE抗炎活性研究

1) 細胞毒性檢測

Raw 264.7細胞接種于96孔板后加入不同濃度的APLE,對照組加入細胞培養基(不含FBS的DMEM)。孵育24 h后棄去培養液,加入MTT于恒溫培養箱孵育2 h后,棄去培養液,加入150 μL的DMSO,混勻,用酶標儀測量波長550 nm處的OD值,計算細胞活性。

2) NO的測定

將Raw 264.7細胞以2.5×105cells/孔/300 μL的密度接種于孔板中?？瞻捉M(不含FBS的DMEM)與LPS組分別加入DMEM每孔300 μL,試驗組加入不同濃度的APLE(25、50、100 μg/mL)處理細胞1 h后,除空白組外加入6 μL的LPS(100 ng/mL)處理,37 ℃培養24 h后收集細胞上清液。使用NO標準品工作液(NO Stand)制作標準曲線。在96孔板中每孔加入50 μL上清液和Griess試劑(按1∶1比例),使用酶標儀在波長為550 nm處測定OD值,根據標準品OD值制作標準曲線,計算NO含量。

3) iNOS和COX-2 測定

樣品前處理：將Raw 264.7細胞鋪于6孔板中經LPS和APLE處理后,用提前預冷的PBS清洗細胞2次,每孔加入110 μL的RIPA對細胞進行裂解,裂解30 min,用細胞鏟將全部細胞刮下并收集于1.5 mL離心管中(冰上操作),4 ℃,12 000 r/min 離心15 min,收集上清液,于-20 ℃冰箱保存,上清液為即總蛋白。采用蛋白質定量法(BCA)進行蛋白質定量,確保免疫蛋白印跡中上樣量的準確性。

將收集的總蛋白與蛋白緩沖液4∶1混勻,使蛋白變性(100 ℃沸水煮5 min),立即將變性后的總蛋白液置于冰上冷卻。首先進行檢查裝置的氣密性,在玻璃板間隙加入已配置完成的10%分離膠,加入甲醇使下分層膠的氣泡消失,等待15 min后棄去甲醇。隨后灌注已配置好的5%濃縮膠,立即插入梳子(10孔),待其凝固后拔出梳子。組裝電泳儀裝置,加樣,加入1×電泳緩沖液,Marker、總蛋白液。其中電泳條件為恒壓120 V,90 min。電泳結束后,將PVDF膜甲醇中浸泡30 s,激活PVDF膜,再按照正極―海綿―濾紙―PVDF膜―膠―濾紙―海綿-負極的順序組裝,進行轉膜(30 V,600 min)。轉膜結束后,根據蛋白分子量標記并裁剪,用TBS-T清洗PVDF膜3次,每次10 min,使用10%脫脂牛奶封閉90 min后,4 ℃孵育稀釋過一抗(1∶1 000)24 h后,回收一抗,加入二抗(1∶5 000),室溫孵育90 min。加入配置的ECL化學顯影劑,使用凝膠成像儀將其進行曝光成像。使用Image-J處理圖像并分析其蛋白的相對表達量。

1.5 數據分析

每個試驗組均設置3次重復,使用SPSS 25.0統計軟件和 GraphPad Prism 9 軟件分析所有數據,通過Duncan多重檢驗來進行方差分析,P< 0.05被認為具有統計學意義

2 結果與分析

2.1 APLE提取工藝研究

2.1.1 單因素試驗

該研究利用閃式提取法對龍芽草進行提取,以總黃酮含量為評價指標。試驗結果表明,最佳提取時間為40 s(圖1)。最佳提取液料比為40∶1 (mL∶g)(圖2),提取溶劑濃度為40%時,總黃酮含量最高(圖3)。

圖1 提取時間對總黃酮含量的影響

圖2 提取液料比對總黃酮含量的影響

圖3 提取溶劑濃度對總黃酮含量的影響

2.1.2 響應面試驗

使用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2進行回歸擬合分析,可得到二次多項式方式回歸模型為：

表2 響應面試驗設計與結果

R1=93.743 36+0.389 77A+3.419 12B+2.565 95C+0.007 14AB-0.013 40AC-0.645 1BC-10.542 85A2-12.251 95B2-11.322 90C2.

式中,R1為總黃酮含量(mg/g);A為提取液料比,B為提取溶劑濃度,C為提取時間。

由回歸模型進行方差分析結果可知,該模型回歸顯著(P<0.01),失擬項(P=0.255 3)不顯著,表明自變量與響應值之間的模型關系顯著,說明回歸方程與實際情況擬合良好,可以用此模型來分析和預測提取結果(表3)。

表3 回歸模型顯著性與方差分析

由軟件分析得到二維等高線圖及三維響應曲面(圖4-6),通過等高線和響應面圖直觀地反應了提取液料比、提取溶劑濃度和提取時間之間的相互作用對龍芽草提取物總黃酮含量的影響。響應面的最高點所對應的影響因素數值可以看作提取龍芽草提取物總黃酮的最佳提取條件;結果顯示,通過Box-Behnken試驗設計法得到了與實際情況相符合的回歸模型。如表3的方差分析結果所示,提取溶劑濃度對提取物總黃酮含量的影響最大,其次是提取時間,提取液料比對提取物總黃酮含量的影響最小。提取液料比、提取溶劑濃度、提取時間每2個因素之間(AB、AC、BC)均無顯著性交互作用。

圖4 提取溶劑濃度和提取液料比交互作用的響應面和等高線圖

圖5 提取溶劑濃度和提取時間交互作用的響應面和等高線圖

圖6 提取液料比和提取時間交互作用的響應面和等高線圖

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件分析模型,發現龍芽草提取物總黃酮的最佳提取條件為：A提取液料比為40.19∶1 (mL∶g),B提取溶劑濃度為41.37%,C提取時間為41.09 s。此時龍芽草提取物總黃酮含量最大,為95.12 mg/g。進行3次獨立重復試驗,對此結果進行驗證,測得平均提取物總黃酮含量為(94.25±0.005) mg/g,試驗值與理論值誤差較小,所以采用響應面分析法優化得到的提取條件參數準確可靠,具有較實用的價值。

2.2 抑菌活性

APLE對6種試驗菌的最低抑菌濃度(MIC)如表4所示。在0.5～64 mg/mL濃度范圍內,APLE對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、李斯特菌的MIC值均為32 mg/mL,沙門氏菌的MIC值為16 mg/mL,蠟樣芽孢桿菌的MIC值為4 mg/mL,說明提取物對蠟樣芽孢桿菌的抑菌作用最強,其次是沙門氏菌。因此,在進一步的試驗中,對提取物處理后的蠟樣芽孢桿菌和沙門氏菌生長變化情況及電解質釋放情況進行了調查。

表4 APLE的最低抑菌濃度

APLE對蠟樣芽孢桿菌與沙門氏菌生長的影響由圖7可知,APLE對蠟樣芽孢桿菌和沙門氏菌生長有明顯抑制作用,在培養初期(0～1 h),對照組與APLE處理組無顯著差異。但在培養1 h后,對照組的蠟樣芽孢桿菌和沙門氏菌進入對數生長期,OD600快速上升,但APLE處理組的OD600上升速度緩慢,這表明APLE處理后的蠟樣芽孢桿菌與沙門氏菌生長受到了抑制。

注：A為蠟樣芽孢桿菌;B為沙門氏菌

菌懸液中電導率的大小與細胞膜的完整性呈正相關,當細菌細胞膜遭到破壞時,細胞膜通透性增加,引起胞內電解質外泄,使胞外電導率上升。由圖8可見APLE作用前后細菌培養基中電導率的變化。在培養過程當中,對照組培養液的電導率變化不明顯,相較于對照組中蠟樣芽孢桿菌和沙門氏菌培養基中電導率,試驗組培養基中的電導率顯著高于對照組,且隨時間變化逐漸上升,并且在5 h的試驗過程中未見變緩趨勢。這說明龍芽草黃酮破壞了細胞膜的完整性,使胞內電解質滲出,進而導致菌體培養液的電導率升高,但樣品對細胞膜的破壞不夠徹底,進而導致細菌還在以一定速率增長或樣品對細胞膜的破壞較慢導致其呈現逐漸上升趨勢。

注：A為蠟樣芽孢桿菌;B為沙門氏菌

2.3 抗炎活性

為篩選后續抗炎試驗中的安全用藥濃度,分別使用1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL的APLE對Raw 264.7細胞進行處理,24 h后用MTT法檢測細胞活力,如圖9所示,APLE濃度低于200 μg/mL時,對細胞活性沒有影響,因此,采用25、50、100 μg/mL作為后續試驗藥物濃度。

注：與空白組相比,***P<0.001。

為探究APLE對LPS誘導的Raw264.7的NO是否具有抑制釋放的作用,使用不同濃度APLE(25、50、100 μg/mL)處理細胞,結果如圖10所示,經LPS(200 ng/mL)刺激后,顯著促進了細胞中NO的釋放量,而經過APLE處理后細胞的NO釋放量與未經處理的細胞相比,具有顯著的抑制作用,且呈現一定的濃度依賴性。

注：與空白組相比,****P<0.000 1;與LPS組相比：###P<0.001。

使用Western Blot法檢測iNOS、COX-2的表達量。如圖11(A)所示,經LPS處理后,細胞中的iNOS、COX-2表達量均呈現明顯的上升趨勢,而經APLE處理后,細胞中的iNOS、COX-2表達量均有顯著下降,經Image J進行灰度統計,結果如圖11(B)所示,APLE對iNOS、COX-2的表達量的呈現濃度依賴性的抑制效果。

注：與LPS組相比,**P<0.01,***P<0.001。

3 討論與結論

不同的提取條件會對提取物中總黃酮含量產生不同程度的影響,當液料比為10∶1 (mL∶g)時,總黃酮含量偏低,可能是因為提取溶劑過少,樣品不能夠完全被提取;隨著液料比的提高,總黃酮含量顯著上升;當液料比高于40∶1 (mL∶g)時,總黃酮含量降低,可能是由于某些醇溶性物質與黃酮存在競爭關系,影響總黃酮的浸出,導致其含量下降[15];當提取溶劑的濃度達到40%時,所得總黃酮含量最高,而隨著提取溶劑濃度進一步升高,黃酮含量降低,這可能是由于隨著提取溶劑濃度升高,龍芽草中其他醇溶性物質含量有所上升,使得總黃酮含量下降[16]。

近年來,植物提取物的抑菌和抗炎癥活性已成為研究領域的熱點。王彩霞等[17]發現,在2 mg/mL濃度下,厚樸(Houpoeaofficinalis) 和麻葉菊(Indocypraeamontana) 提取物對葡萄座腔菌具有較好的抑菌活性,抑制率分別達到 95.80%和78.31%;高語[18]研究了獨活、薄荷等35味中藥的抑菌活性,發現35味中草藥均具有一定的抑菌作用。其中,新疆產秦艽、玫瑰和沙棘對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌具有顯著的抑菌能力,甘草對革蘭氏陽性菌具有較強抑菌作用。該試驗發現,APLE對6種供試菌種均有一定的抑菌活性;其中,APLE對蠟樣芽孢桿菌與沙門氏菌的抑菌活性最強。通過檢測樣品菌懸液中電導率與蛋白質含量的變化,發現胞內電解質大量泄露,這說明龍芽草抑制細菌增殖的機制可能與增加了微生物壁膜通透性有關[19]。

有研究發現,總黃酮具有抗炎作用,其作用機制主要包括影響前列腺素和NO的產生、產生抗炎細胞因子、抗氧化平衡和調節氧化應激等方面[20-21]。晏俊玲等[22]利用超聲提取法提取出苦筍總黃酮,發現NO抑制率隨總黃酮濃度的升高而增大,當苦筍總黃酮提取濃度達到1.20 mg/mL時,NO抑制率最大,達到93.94%,表明在此濃度下苦筍總黃酮能夠較好抑制LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中NO的產生,同時可推測苦筍總黃酮具有一定的抗炎效果。趙雙雙等[23]以巨噬細胞RAW 264.7為試驗細胞株,通過檢測NO濃度評估無舌川西小黃菊的抗炎效果,發現無舌川西小黃甲醇提取物和乙酸乙酯萃取物均有顯著的抗炎作用。該研究通過Western Blot法檢測APLE對LPS誘導的Raw 264.7細胞中的iNOS與COX-2在蛋白水平表達的影響,發現APLE能夠顯著抑制iNOS與COX-2的表達,從分子和蛋白的角度進一步證實了APLE對LPS誘導的Raw 264.7細胞損傷具有一定的保護作用。綜上所述,APLE在開發天然抑菌劑方面具有良好的應用前景,而對其具體作用機制與抑菌活性成分有待進一步研究。