胃蛋白酶在聲帶息肉、聲帶癌中的作用分析△

高競逾 羅仁婧 阮標 江超武 劉卓慧 龍瑞清 梁秋林 張策 蘇路 李鵬

咽喉反流(laryngopharyngeal reflux,LPR)由于較高的發病率以及與一系列耳鼻咽喉科、呼吸內科疾病的相關性而得到越來越多的重視[1,2]。研究證實LPR是咽喉部良性和惡性病變的危險因素之一[3,4]。大量研究發現胃蛋白酶(pepsin)可能在聲帶息肉、任克水腫、聲帶白斑、喉癌等疾病的發病中起重要作用[5-7]。但聲帶良惡性病變中胃蛋白酶表達的差異仍然沒有明確的報道。本研究比較聲帶癌、聲帶息肉與健康人群間反流癥狀指數(reflux symptomindex,RSI)、反流體征評分(reflux finding score,RFS)、胃蛋白酶檢測試劑盒結果的差異,探討胃蛋白酶在聲帶良惡性疾病發病中的作用,為聲帶良惡性疾病的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2020年5月至2021年12月就診于昆明醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科的住院患者及健康志愿者共77例。分為聲帶息肉組、聲帶癌組以及對照組?；颊咴跈z查前2周內均未服用質子泵抑制劑、胃動力藥物等。排除標準:①處于急性上呼吸道感染或此前有咽喉部、胃腸道手術史者;②有Zolling-Ellison綜合征、賁門失弛緩、賁門痙攣、食管狹窄及其他食管病變者;③此前一個月內進行CPAP治療;④重大慢性疾病病史、精神疾病、神經系統疾病者;⑤中途發生嚴重癥狀,臨床判定需要進行干預者。所有研究對象均同意參與該項研究并簽署知情同意書,該項研究通過昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審批[(2022)倫審L第130號]。

聲帶息肉組27例,入選標準:喉鏡檢查示聲帶息肉,經保守治療(聲休、發聲訓練)無效,行支撐喉鏡下聲帶息肉取材活檢術,且術后病理檢查結果提示聲帶息肉。聲帶癌組27例,入選標準:喉鏡檢查示聲帶腫物,且經保守治療無效,行支撐喉鏡下聲帶腫物取材活檢術,術后病理檢查結果提示聲帶鱗狀細胞癌;其中,原位癌8例,浸潤癌4例,鱗狀細胞癌15例(高分化6例,中-高分化1例,中分化7例,低分化1例)。對照組23例,入選標準:無明顯聲帶病變,無耳鼻喉科相關疾病,無胃腸道相關疾病。三組年齡及性別分布見表1。

表1 三組受試者臨床資料、RSI、RFS評分及Peptest檢查結果

1.2研究方法

1.2.1RSI和RFS評分 對聲帶息肉組、聲帶癌組、對照組由同一醫師行電子喉鏡檢查以及 RSI、RFS評分,RSI>13分和/或RFS>7分者為陽性;反之則為陰性。

1.2.2胃蛋白酶檢測試劑盒試驗 收取研究對象早餐后1 h的唾液對三組受試者行胃蛋白酶檢測試劑盒(Peptest)檢測,并用定量儀精確測定胃蛋白酶濃度。

1.2.3胃蛋白酶的免疫組化檢測 采用兩步法對聲帶息肉組、聲帶癌組標本行胃蛋白酶免疫組化染色,根據染色的深淺和范圍對研究對象進行咽喉反流的客觀評估。一抗:胃蛋白酶A多克隆抗體[(PA5-103156)賽默飛世爾科技公司(中國上海)];二抗:增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(北京中杉金橋生物技術有限公司)(中國北京)。PBS代替一抗作為陰性對照,以胃底黏膜細胞的胃蛋白酶免疫染色結果為陽性對照。依據Formwitz評分方法,根據顯色程度與顯色細胞占比評分的乘積將顯色強度分為4級:0分為陰性,記0級;1～4分為弱陽性,記1級,5～8分為陽性記2級,9～12分為強陽性,記3級。

1.3統計學方法 運用SPSS25.0統計軟件包進行統計學分析,正態分布計量資料采用均數±標準差表示,多組間均數差異比較采用方差分析,兩組間均數差異比較采用Dunnett多重比較,兩組間等級資料差異比較采用秩和檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1三組RSI、RFS評分及Peptest檢查結果 由表1可見,經方差分析及多重比較:三組RSI評分均數存在著統計學差異(F=4.457,P=0.015),對照組與聲帶息肉組(P=0.026)、聲帶癌組存在著統計學差異(P=0.04),聲帶息肉組與聲帶癌組無統計學差異(P>0.05)(表1)。

三組RFS評分總體均數存在著統計學差異(F=37.534,P<0.001),對照組與聲帶息肉組(P<0.001)、聲帶癌組存在著統計學差異(P<0.001),聲帶息肉組與聲帶癌組存在著統計學差異(P=0.002)。

三組胃蛋白酶檢測試劑盒總體均數存在著統計學差異(F=3.435,P=0.037),對照組與聲帶息肉組(P=0.044)、聲帶癌組存在著統計學差異(P=0.045),聲帶息肉組與聲帶癌組無統計學差異(P>0.05)。

2.2聲帶息肉組和聲帶癌組胃蛋白酶免疫組化結果 由表2可見,經兩樣本秩和檢驗,聲帶息肉組和聲帶癌組胃蛋白酶免疫組化結果差異無統計學意義(P>0.05)(表2)(圖1)。

表2 聲帶息肉、聲帶癌組織中胃蛋白酶的表達(例)

圖1 喉部病變組織胃蛋白酶免疫組織化學染色圖像(免疫組化×400) a.陰性對照,聲帶息肉組織; b.陽性對照,胃底粘膜組織; c.弱陽性:聲帶息肉組織,少量淺棕色顯色; d.陽性,聲帶鱗狀細胞癌組織,顆粒狀棕色顯色; e.強陽性,聲帶鱗狀細胞癌組織,上皮層及基質密集分布大量深褐色顆粒

3 討論

近年來研究發現LPR所致的胃內容物反流至食管上括約肌以上被認為是引起聲帶病變的重要因素[8]。胃內容物除胃酸、膽汁、胰酶和食糜外,還含有胃蛋白酶,它是一種必需的、最具侵襲性的蛋白酶[9,10]。當LPR發生時,只要咽喉部pH>5.0時,就會激活靜態胃蛋白酶[11]。與食管黏膜不同,喉和下咽黏膜缺乏會產生碳酸氫鹽來保護黏膜細胞的碳酸酐酶[12],自我保護能力相對較弱,即使是少量的胃內容物反流,也會導致嚴重損傷,從而導致炎癥[10]。而反復的炎癥刺激導致咽喉上皮黏膜損傷,進一步增加其惡性轉化的風險。

本研究發現聲帶息肉組與聲帶癌組之間胃蛋白酶檢測試劑盒、RSI以及胃蛋白酶免疫組化結果差異無統計學意義(P>0.05),但兩組間RFS結果有差異(P<0.05),提示聲帶息肉和聲帶癌的發生都與咽喉反流有關,但其發病機制可能有所不同。咽喉反流所致的咽喉部損傷的諸多原因可分為兩方面[2,16]:一是直接損傷:胃十二指腸反流物胃酸、胃蛋白酶、胰酶、膽汁酸等對咽喉黏膜的直接刺激所導致的炎癥損傷,其中尤以胃蛋白酶對黏膜上皮的損傷最為嚴重;二是間接損傷:胃十二指腸反流物對食管遠端黏膜化學感受器的刺激引起迷走神經反射,所致的咳嗽、清嗓等間接刺激所致的黏膜損傷。Wang等[17]研究表明LPR內容物胃酸、胃蛋白酶所致的喉黏膜直接損傷是導致聲帶息肉的主要原因;而胡鴻敏等[3]通過病例對照研究發現LPR引起的清嗓可能是導致聲帶息肉的主要原因;Zou等[18]研究發現胃蛋白酶可能通過促進免疫細胞聚集,增加局部細胞因子,促進炎癥反應,可能是導致聲帶息肉發病的新機制。本研究認為這兩方面的因素均參與了聲帶息肉的發生,但哪方面因素為主有待進一步研究;而聲帶癌則主要與咽喉反流所致的咽喉部直接損傷有關。這也可以解釋本研究中聲帶息肉組RSI量表評分略高于聲帶癌組,可能是由于間接損傷所致的咽喉部的這種反應所致,例如咳嗽、清嗓等。

本研究中聲帶癌組RFS結果高于聲帶息肉組(P<0.05),提示聲帶癌組中咽喉黏膜的炎性反應較重,可能與胃蛋白酶所致損傷較重有關。結合本研究胃蛋白酶免疫組化分析結果,提示胃蛋白酶在聲帶息肉和聲帶癌組中的含量較高,胃蛋白酶更可能通過直接作用于細胞漿而損傷喉黏膜上皮細胞。Ao等[19]研究發現,高表達的 Glut-1 可能通過上調喉部 H+/K+-ATPase 的表達以重新激活吸收的胃蛋白酶,損傷喉黏膜,從而促進聲帶白斑向聲帶癌進展。Tina等[20]通過RNA測序鑒定胃蛋白酶失調通路和喉癌基因位點的差異,發現胃蛋白酶激活喉癌相關的信號通路,可能是導致喉癌發生的新機制。Johnston等[21]研究發現在胃蛋白酶的刺激下喉上皮細胞miRNA水平出現顯著變化;在暴露于非酸性胃蛋白酶的喉上皮細胞中,miRNA表達顯著失調,并表現出相應的靶癌蛋白Ras表達增加。Ras表達增加與細胞增殖增加相關,在喉癌中觀察到Ras表達異常[22]。上述機制可能在胃蛋白酶所致的聲帶黏膜損傷中起重要作用,最終導致聲帶癌的發生。

綜上所述,胃蛋白酶可能是聲帶息肉、聲帶癌的致病因素之一,但發病機制可能有所不同。本研究也存在局限性,由于考慮到倫理因素,未取正常人群的聲帶組織作為對照組進行研究。在聲帶良惡性疾病的防治過程中,如何抑制胃蛋白酶的作用將是未來研究重方向之一。