紅景天苷改善順鉑引起的小鼠耳蝸毛細胞和螺旋神經節神經元損傷的機制*

李兆龍 徐義策 李澤文 周潔

順鉑(cisplatin,CIS)是多種惡性腫瘤的一線化療藥物,可引起進行性的、不可逆的和累積性的聽力損傷,這種耳毒性是限制其臨床應用的重要原因[1]。目前尚無針對CIS耳毒性的有效預防措施,因此有必要尋找減輕或阻止CIS耳毒性的保護劑,以突破CIS化療的劑量限制。研究[2,3]表明,CIS可在耳蝸中蓄積并長期存在,誘導耳蝸毛細胞(cochlear hair cell,CHC)和螺旋神經節神經元(spiral ganglion neuron,SGN)過度產生并積累活性氧(reactive oxygen species,ROS),導致細胞丟失或死亡,進而損害聽力。中藥提取物紅景天苷(salidroside,SAL)具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、神經保護等功效[4]。已證實,SAL可改善氨基糖苷類藥物[5]及金屬錳[6]的耳毒性,推測其對CIS的耳毒性也有改善作用。CHC的支持功能和SGN的傳導功能依賴于細胞存活,是聽力維持的生理基礎[7]。環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)為重要的第二信使,可誘導蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)/cAMP效應元件結合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)信號通路激活,促進下游抗凋亡蛋白(Bcl-2)和神經保護因子(BDNF、NF)的表達,預防細胞(包括神經元)凋亡,有利于細胞存活[8,9]。然而,SAL對CIS耳毒性的改善作用是否與cAMP/PKA/CREB通路有關并不清楚。故本研究擬采用CIS處理離體耳蝸組織,觀察SAL干預對CIS所致CHC、SGN損傷和cAMP/PKA/CREB通路的影響,以探討SAL改善CIS耳毒性的可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級新生2 d的C57BL/6小鼠50只,由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心饋贈。

1.2試劑和儀器 SAL(純度≥98%)購自Sigma公司;特異性cAMP抑制劑SQ22536、PKA抑制劑H-89購自MCE公司;神經元β3-tubulin抗體、羊抗兔(Alexa Fluor 647或Alexa Fluo 488或HRP偶聯)IgG抗體、DAPI、NF-M抗體購自CST公司;肌球蛋白(myosin7a,MYO7A)、BDNF抗體、ROS檢測CellROXTMDeep Green試劑盒購自Invitrogen公司;cAMP ELISA試劑盒、GAPDH抗體、PKA抗體、p-CREB抗體、CREB抗體、Bcl-2抗體購自Abcam公司;化學發光試劑購自Millipore公司;蛋白提取試劑購自上海生工公司;激光共聚焦顯微鏡購自奧林巴斯公司;電泳和轉膜設備購自BioRad公司。

1.3實驗方法

1.3.1耳蝸基底膜的分離和培養[10]將新生2 d的C57BL/6小鼠斷頭處死,75%酒精消毒全身后,固定頭部并暴露雙側顳骨,解剖鏡下分離雙側聽泡置于Hank’s平衡液中,小心去除螺旋韌帶等,分離出條狀的耳蝸基底膜[含有內毛細胞(IHC)、外毛細胞(OHC)及SGN]。將耳蝸基底膜(Corti器面朝上)平鋪在含有膠原蛋白的無血清BME培養液凝膠表面,輕壓固定,在培養箱中過夜(37℃,5%CO2)。次日,更換新鮮培養液并加入CIS或SAL進行干預。

1.3.2分組及給藥 隨機數字法將耳蝸基底膜分為對照組(C組)、CIS組、SAL組、SAL+SQ22536(cAMP抑制劑)組和SAL+H-89(PKA抑制劑)組,每組20條。C組僅加入無血清BME培養液;CIS組在培養液中加入15 μmol/L CIS[11];SAL組在CIS組基礎上加入5 μmol/L SAL[7];SAL+SQ22536組在CIS組基礎上加入5 μmol/L SAL和5 μmol/L SQ22536;SAL+H-89組在CIS組基礎上加入5 μmol/L SAL和30 μmol/L H-89。在培養箱中孵育48 h后進行后續實驗。

1.3.3免疫熒光染色 用4%多聚甲醛固定各組耳蝸基底膜(n=10,β3-tubulin、MYO7A各5條),用PBS、Triton X-100處理后,加入羊血清封閉45 min;滴加一抗兔抗小鼠神經元β3-tubulin(1∶800)或兔抗小鼠MYO7A(1∶50)作用過夜、滴加二抗(Alexa Fluor 647偶聯抗兔IgG或Alexa Fluo 488偶聯抗兔IgG,稀釋比1∶500)避光作用2 h,并用DAPI(1∶1 000)核染色劑作用10 min,封片后在共聚焦顯微鏡下拍照。計數CHC(MYO7A標記的完整細胞)和SGN(β3-tubulin標記的完整細胞)數量。

1.3.4ROS含量檢測 多聚甲醛固定各組耳蝸基底膜(n=5),用PBS處理后,加入CellROXTMDeep Green工作液(綠色熒光)避光作用30 min,加入DAPI(1∶1 000)核染色劑作用10 min,封片后在共聚焦顯微鏡下拍照。用Image J分析綠色熒光強度,以評估耳蝸基底膜中ROS含量。

1.3.5cAMP含量檢測 將處理好的基底膜從凝膠表面小心剝離,用RIPA裂解液裂解各組耳蝸基底膜(n=5),離心上述裂解液,收集上清,按照指導書依次加入cAMP ELISA工作液,在酶標儀讀取OD450nm,計算cAMP含量。

1.3.6Western blot檢測 收集1.3.5所得裂解液上清并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白樣品(30 μg),并轉移到PVDF膜;用封閉液(5%脫脂奶粉)封閉后,相繼加入一抗[GAPDH抗體(1∶2 000)、PKA抗體(1∶1 000)、p-CREB抗體(1∶500)、CREB抗體(1∶500)、Bcl-2抗體(1∶500)、BDNF抗體(1∶1 000)、NF-M抗體(1∶1 000)]、HRP標記二抗(1∶3 000);用化學發光液顯影蛋白條帶并拍照。以GAPDH為內參分析PKA等蛋白條帶相對灰度。

2 結果

2.1各組基底膜毛細胞免疫熒光染色觀察結果 C組耳蝸基底膜中可見三排OHC和單排IHC有序緊致排列,CHC形態規則;CIS組CHC排列混亂,分層不清楚,體積腫大;SAL組CHC排列及形態趨于規則;SAL+SQ22536組和SAL+H-89組CHC排列及形態較SAL組差(圖1)。與C組相比,CIS組CHC數量較少(P<0.05);與CIS組相比,SAL組CHC數量較多(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組和SAL+H-89組CHC數量較少(P<0.05)(表1),說明SAL可以減輕CIS引起的耳蝸毛細胞損傷。

圖1 各組基底膜免疫熒光染色觀察CHC形態

表1 各組CHC、SGN數量及ROS相對熒光強度比較

2.2各組基底膜SGN免疫熒光染色觀察結果 C組耳蝸基底膜中可見密集分布的圓形或橢圓形的SGN,細胞質、核染色均勻,可見大量由胞體延伸出的神經突;CIS組個別SGN細胞核破碎,大量SGN的神經突缺失;SAL組SGN形態趨于正常;SAL+SQ22536組和SAL+H-89組SGN形態較SAL組差(圖2)。與C組相比,CIS組SGN數量較少(P<0.05);與CIS組相比,SAL組SGN數量較多(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組和SAL+H-89組SGN數量較少(P<0.05)(表1),說明SAL可以減輕CIS引起的耳蝸SGN損傷。

圖2 各組基底膜免疫熒光染色觀察SGN形態

2.3各組ROS含量檢測結果 由表1可見,與C組相比,CIS組ROS含量較高(P<0.05);與CIS組相比,SAL組ROS含量較低(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組和SAL+H-89組ROS含量較高(P<0.05)(圖3、表1),說明SAL可改善GIS引起的氧化損傷。

圖3 CellROXTM Deep Green試劑盒檢測耳蝸基底膜ROS含量

2.4各組cAMP/PKA/CREB信號通路檢測結果 由表2可見,與C組相比,CIS組cAMP含量、PKA蛋白及p-CREB/CREB水平較高(P<0.05);與CIS組相比,SAL組cAMP含量、PKA蛋白及p-CREB/CREB水平較高(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組cAMP含量、PKA蛋白及p-CREB/CREB水平較低(P<0.05),SAL+H-89組PKA蛋白及p-CREB/CREB水平較低(P<0.05)(圖4、表2),說明SAL激活了cAMP/PKA/CREB信號通路。

表2 各組cAMP含量、PKA、p-CREB、CREB蛋白水平比較

圖4 Western blot檢測各組PKA、p-CREB、CREB蛋白水平

2.5各組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白表達檢測結果 由表3可見,與C組相比,CIS組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平較高(P<0.05);與CIS組相比,SAL組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平較高(P<0.05);與SAL組相比,SAL+SQ22536組、SAL+H-89組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白較低(P<0.05)(圖5、表3),說明SAL促進了BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白的表達。

表3 各組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平比較

圖5 Western blot檢測各組BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平

3 討論

據報道,約40%～80%的CIS化療患者會出現永久性聽力損傷[12]。本研究中,CIS組CHC和SGN數量顯著減少且排列混亂,大量SGN的神經突缺失,同時ROS含量增加了3.8倍,這是因為耳毒性藥物可引起耳蝸組織中ROS/氮物質的積累、線粒體功能障礙等,造成CHC和/或SGN損傷[3,13]。

中藥紅景天具有“扶正益本、補氣生血”等功效,SAL為其糖苷提取物,可通過抗焦亡、抗氧化、抗代謝應激等對大腦[14]、耳[6]、肝臟[15]等產生保護作用。本研究中SAL的作用濃度為5 μmol/L,這是由于Ding等[5]通過一系列實驗確定了5 μmol/L SAL預處理能顯著減輕錳誘導的耳毒性,故本實驗中采用這一濃度。既往研究[3,13]已證實,ROS在CIS所致聽神經損害中發揮關鍵作用,其水平增加最終導致CHC和SGN凋亡和死亡,抑制其可減輕CIS所致的聽神經損害。本研究顯示,與CIS組相比,SAL組ROS含量降低了2.5倍,CHC和SGN數量和形態均明顯改善,表明SAL可以降低CIS誘導的CHC和SGN內ROS含量,從而起到保護CHC和SGN的作用,緩解CIS引起的耳毒性。

cAMP/PKA/CREB通路的活化通過PKA介導的CREB磷酸化實現,它作為轉錄因子調節各種基因[16]。正常生理環境下,PKA以無活性的形式存在于細胞中;遇刺激時,cAMP在細胞中積累增加,與調節亞基結合釋放出具有活性的PKA,催化CREB蛋白的Ser133發生磷酸化(p-CREB),p-CREB與BDNF、NF、Bcl-2等靶基因啟動子區特定序列結合并啟動轉錄,提高細胞的抗凋亡能力和存活能力[8,9,16],是細胞損傷后啟動的自我修復。BDNF和NF是重要的神經營養因子,有利于神經元的生長、分化和存活,維持神經元的功能和可塑性,是細胞應對多種傷害性刺激的保護因子[17]。Bcl-2為重要的抗凋亡蛋白,通過阻止細胞凋亡促進細胞存活[8]。本研究結果中,CIS組耳蝸基底膜中cAMP含量及PKA、p-CREB/CERB、BDNF、NF-M、Bcl-2蛋白水平增多,可能因為CIS產生的ROS等有害物質激活了自我保護性cAMP/PKA/CREB信號通路,但不足以抵抗CIS造成的CHC和SGN損傷。而SAL可以進一步增加耳蝸基底膜中cAMP含量、PKA、p-CREB/CERB蛋白水平及下游靶蛋白BDNF、NF-M、Bcl-2的表達,說明SAL的保護作用導致cAMP/PKA/CREB信號通路進一步活化,有助于減輕多種條件誘導的細胞凋亡[18,19]。本研究還發現,SAL的上述保護作用可被cAMP抑制劑SQ22536或PKA抑制劑H-89減弱,提示激活cAMP/PKA/CREB信號通路可能是SAL改善CIS耳毒性的機制之一。

綜上所述,SAL可能通過cAMP/PKA/CREB通路促進抗凋亡蛋白和神經保護因子表達,緩解CIS引起的CHC和SGN損傷,且SAL也具有抗癌活性[20],并可增強順鉑的抗癌作用[21],提示SAL可能可以作為預防CIS耳毒性的藥物。