秀麗隱桿線蟲在食品營養功能評價中的研究進展

陳 旺 何海倫 鄭艷君 易翠平

(1. 長沙理工大學食品與生物工程學院,湖南 長沙 410114;2. 中南大學生命科學學院,湖南 長沙 410083;3. 湖南女子學院社會發展管理學院,湖南 長沙 410004)

中國目前處于國民營養滿足與慢性病防控戰略前移發展的轉折階段[1],通過飲食防治慢性病是一種無毒健康的方法,食品中含有多種生物活性成分(多糖、多酚、多肽等),具有抗肥胖、抗衰老和抗氧化等作用。因此,開展食品的營養和功能研究,探究食品對人體慢性病的調控機理,為全民的飲食健康提供理論指導是十分有必要的。

食品功能的評定方法主要有傳統化學方法、細胞試驗和小鼠試驗。但是,這些試驗方法存在明顯的缺陷,如傳統的體外方法(化學方法和細胞試驗)研究化學物質的抗衰老作用和機制不確定和不足,小鼠動物模型使用耗時且昂貴,難以適應大量食品樣品的初步篩選等。表1列出了食品功能評定不同方式的優勢和局限性。

表1 不同模型在食品營養功能中應用的優缺點

秀麗隱桿線蟲是一種能夠在實驗室內大量培養的動物。該動物具有體積小(成年后1 mm)、壽命短(2～3周)、生殖周期短(3 d)、孵化卵多(約300個卵)等優點[14]。秀麗線蟲身體透明,用于貯藏脂肪的消化道占據了身體的大部分,這使得在試驗過程中很容易觀察結果并進行分析[15]。另外,秀麗線蟲具有302個神經元,能夠準確地將神經元、神經遞質、突觸、受體和個體行為聯系起來[16]。其體內具有大多數與哺乳動物神經元功能相關的基因,與人類基因同源性達到65%以上[14]。由此可見,秀麗隱桿線蟲可被用作研究食品對于體內脂肪生成,神經系統的衰老和氧化的試驗模型。

研究擬對秀麗隱桿線蟲在食品營養功能,例如抗肥胖、抗衰老、抗氧化方面所取得的研究進展進行綜述,討論影響抗肥胖、抗衰老、抗氧化的機理,此外,對食品營養功能的研究進展進行總結,以期為今后食品營養功能的研究方法提供參考。

1 秀麗隱桿線蟲用于肥胖模型的評價

1.1 食品對線蟲脂質代謝的調控機制

研究[14]報道,65%以上秀麗隱桿線蟲的脂質代謝相關基因在人類中具有同源物,其脂肪生成和分解途徑與人類高度相似。食品中的多糖、醇類等多種活性物質亦可激活線蟲體內與人類同源的脂質代謝基因,通過胰島素/胰島素樣(IIS)信號傳導、Daf-7/TGFβ受體和5-羥色胺等途徑降低線蟲體內脂肪的積累。因此,秀麗隱桿線蟲可用于人體中食品脂質代謝的相關研究[17]。

IIS途徑在秀麗隱桿線蟲的各種生物過程中起著至關重要的作用,包括脂肪代謝、生殖成熟、壽命、滯育和脅迫抗性[17]。在調控秀麗線蟲的脂肪代謝中,通路中的上游基因daf-2(人類胰島素/IGF-1受體的同源基因)突變會使新陳代謝轉變為增加脂肪和糖原的產生。它能通過激酶級聯過程調控age-1(人類磷脂酰肌醇-3-OH激酶)基因和PDK-1蛋白,該蛋白再通過磷酸化SGK-1/akt-1/-2復合物,對daf-16基因產生抑制作用。而daf-16基因能夠進一步影響關于脂肪調控的相關下游基因,包括fat-5、fat-6、fat-7等,導致線蟲體內脂肪積累[18]。在Li等[19]的研究中,重組蕎麥多肽能夠通過IIS途徑調節線蟲體內的daf-2和daf-16基因,產生減低脂肪積累的作用。另外,秀麗線蟲攝入咖啡醇后,會通過減少食物的攝取影響daf-2基因表達,并經ⅡS途徑誘導daf-16核異位使體內脂肪積累減少;類似的咖啡中的咖啡因、綠原酸等其他活性物質在秀麗線蟲中產生相同的現象[20]。

Daf-7/TGFβ受體調控途徑:daf-7是TGF-β的同源物,并且是平行的胰島素信號傳導途徑,其也能夠增加葡萄糖轉運和脂肪酸合成。TGF-β配體由daf-7編碼,而daf-1和daf-4編碼TGF-β受體,接下來的下游基因daf-3編碼調節進入dauer的Smad轉錄因子,并通過調控谷氨酸信號(G蛋白、囊泡谷氨酸轉運體和3種谷氨酸受體)影響脂肪的貯存[18]。Guo等[21]采用高糖誘導秀麗隱桿線蟲模型來評價柚皮苷的抗肥胖作用。秀麗線蟲攝入柚皮苷后,油紅O染色顯示體內脂肪積累顯著減少,另外,通過全轉錄組測序和基因集變異分析表明,柚皮苷上調了線蟲的脂質生物合成和代謝途徑,以及TGF-β等信號通路,導致柚皮苷能在線蟲抗肥胖中發揮重要作用。

5-羥色胺途徑:在人類中,5-羥色胺受體激動劑和5-羥色胺再攝取抑制劑會降低食欲并促進身體脂肪減少[22]。而線蟲試驗中,經過5-羥色胺喂食會導致脂肪減少和喂食率增加。它能夠分別調控mod-1基因受體、ser-6基因和G蛋白偶聯受體,影響下游的acs-2、ech-1和kat-1等基因以及β氧化,達到抑制秀麗線蟲體內脂肪堆積的作用[18]。Lin等[23]利用秀麗線蟲作為模型,評估了6種膳食黃酮類化合物(芹菜素、菊花素、木犀草素和黃酮醇山奈酚、楊梅素、槲皮素)對脂肪積累的影響。其中對線蟲脂肪堆積的抑制作用最強的木犀草素,可提高線蟲神經元中5-羥色胺的合成,從而促進脂肪分解和脂肪酸β氧化。

其他途徑:SBP-1/SREBP和NHRS途徑。SBP-1蛋白是甾醇反應元件結合蛋白(SREBP)的同源物,SREBP是哺乳動物脂肪合成途徑的關鍵轉錄調節因子,有助于哺乳動物脂肪的積累[24]。而NHRS是哺乳動物核激素受體,能夠精確控制能量代謝。其中NHR-49是脂肪消耗的關鍵調節劑,具有調控線蟲脂肪消耗,維持脂肪酸飽和度平衡的作用。SREBP和NHR與特定啟動子結合后,將激活線蟲的脂肪調控機制,其中MDT-15,是一種既能與SREBP結合,又可以特異性地與NHR-49結合的基因。當調控機制激活后,這兩個調控因子通過調節下游的fat-5、fat-6、fat-7基因和/或影響脂質合成、脂肪酸β氧化,降低線蟲體內的脂肪積累[18]。

1.2 研究方法

秀麗線蟲用于食品脂質代謝的研究需要先將線蟲同步化處理,再染色鑒定;通常包括M9緩沖液洗滌、異丙醇固定、油紅O染色、隨機選蟲、顯微鏡定量測定等步驟[25]。秀麗線蟲通體透明,可以在油紅O、尼羅紅等染色后,觀察其體內脂肪的分布并定量分析[26]。與生化分析等方法比較,該法操作簡單,樣本少,費用低,可以清楚地觀察脂肪的分布。也可以用甘油三酯測定試劑盒法,將秀麗線蟲的甘油三酯與其他脂溶性化合物區分開來,彌補染色法不能測定脂溶性化合物的缺點,但這種方法需要大量的線蟲,不適合篩選[14]。因此,試驗中常將兩種方法聯合使用,以保證試驗結果的準確性。例如Bai等[27]利用秀麗線蟲探究苦瓜皂苷對脂代謝的影響時,同時采用了紅油O染色法和甘油三酯試劑盒的方法測定線蟲體內脂肪的積累情況,此方式不僅可以直接觀察到苦瓜皂苷對線蟲體內脂肪分布的影響,還能通過定量的方式表現出皂苷明顯降低了秀麗隱桿線蟲體內的總脂肪。

由此可見,秀麗隱桿線蟲作為一種肥胖研究的模型,已用于食品中生物活性物質對體內脂肪的積累和代謝的影響的研究,然而目前這種模型研究主要集中在水果和蔬菜,例如苦瓜、西蘭花[28]等,在動物與谷物等方面研究較少。動物性食物是日常飲食必備,其體內分離出的多肽具備降低脂肪積累的潛力[29];谷物是多糖、膳食纖維和維生素的極好來源,這些生物活性物質也能夠降低體內脂肪含量,比如Finley等[30]利用豆科植物減少秀麗隱桿線蟲的腸脂肪沉積,Gao等[31]利用大麥膳食纖維減少秀麗隱桿線蟲體脂含量等,然而目前這方面的研究主要集中在其分離和鑒定上,在抗肥胖方面的應用潛力有待于進一步開發。

2 秀麗隱桿線蟲用于抗衰老模型的評價

2.1 食品對線蟲抗衰老的調控機制

衰老是所有生物在生長繁殖過程中不可避免的,且衰老同時伴隨各種疾病,比如糖尿病、高血壓等[32],延緩衰老可提高人類生活質量。食品中含有大量的抗衰成分,通過飲食調節是一種健康的延緩衰老的方式。研究[33]表明,秀麗隱桿線蟲體內的胰島素/胰島素樣(IIS)信號傳導、飲食限制和線粒體呼吸途徑中的遺傳因素與衰老有關。

2.1.1 Insulin/IGF-1(IIS)信號途徑daf-2和age-1是IIS途徑的兩個上游基因,當daf-2與胰島素樣肽結合時,產生的相互作用會激活age-1,可能通過磷酸化激活3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDPK-1)并抑制下游基因daf-16表達來控制機體衰老。Daf-16是C.elegans體內唯一一個人類長壽基因FOXO的同源物,是Insulin/IGF-1信號通路下游的主要靶點,主要接收來自上游途徑的信號,調控與衰老、發育、應激等相關基因的轉錄水平以調控人類壽命[34]。Daf-16活性越高,線蟲壽命越長。存在于葡萄、桑葚中的多酚物質——白藜蘆醇能夠延長秀麗線蟲的壽命,其通過daf-16途徑下調線蟲的泵送速率和運動行為,并能保護機體免受氧化應激損傷[35]。另外,Lu等[36]針對富含于芝麻中的亞麻木酚素對秀麗線蟲體內抗衰老作用的研究結果表明,培養基中加有亞麻木酚素可以延長線蟲22%的壽命,并在基因水平上發現亞麻木酚素可以上調daf-16下游基因的表達,但不能延長daf-16突變體的壽命。

2.1.2 TOR或mTOR(雷帕霉素) 雷帕霉素的靶點是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,通過調節蛋白質合成、自噬和多種其他細胞過程來調節生長、發育和行為。其與蛋白結合后形成兩種復合物mTORC1和mTORC2,其中mTORC1具有合成代謝功能,包括促進蛋白質合成和抑制自噬,并被氨基酸、氧氣和生長因子信號激活,當mTORC1活性通過RNAi敲除該信號通路中的成分而降低時,壽命延長,這種方式需要skn-1和daf-16。Skn-1和daf-16能夠激活MAPK/ERK通路活化mTORC1,使核糖體S6激酶(S6K)和內質網(ER)產生應激反應來調控細胞的增殖化、自噬凋亡等。而mTORC2能增加AKT、SGK等酶的活性,促進生長,但需要與核糖體相互作用才能發揮活性[37-39]。

2.1.3 線粒體呼吸途徑 許多已知影響壽命的基因產物均與能量代謝密切相關,線粒體功能因此也被認為是影響壽命的主要因素之一[14]。對于線蟲線粒體功能影響的因素主要包括燃料傳感器腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和CLK-1基因等。在線蟲中過量表達AMPKα亞單位,即AAK-2,可以延長壽命。AAK-2蛋白被環境壓力或蠕蟲的正常老化引起的腺苷酸與三磷酸比率的增加而激活[40]。研究[41]表明,甲殼酸可以通過aak-2和skn-1調節,抑制咽送率和運動行為的降低,延長線蟲壽命。而表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)誘導產生的活性氧刺激線蟲壽命延長依賴于AMPK/aak-2、SIRT1/sir-2和FOXO/daf-16的表達,并由此提出可誘導的AMPK/SIRT1/FOXO依賴性氧化還原信號傳導模塊,利用這種傳導模塊可以延長壽命[42]。另外,Clk-1同樣是影響線粒體功能的關鍵因子,Clk-1能夠編碼一種去甲氧基泛醌羥化酶,這是生物合成泛醌(輔酶Q10)所必需的,能夠作為從線粒體復合體的電子和質子的載體[3]。當其突變后會減慢線蟲的生長發育速度,包括細胞周期、發育和成年行為。鹿茸作為一種具有抗衰老的功能性食品,Wang等[43]為探究鹿茸抗老化的調控機制,利用秀麗線蟲作為模型進行試驗,結果表明其提取物在氧化應激條件下可以顯著延長秀麗線蟲的壽命,并發現鹿茸甲醇提取物的活性是由clk-1信號傳導途徑介導的。

2.1.4 飲食限制調控途徑 研究[3]表明,在并不饑餓的條件下,膳食的減少攝入可以延長壽命,在飲食限制調控途徑中研究得較為廣泛的為EAT-2基因和SIR-2.1基因。在秀麗隱桿線蟲中,一些eat突變體在咽泵(蠕蟲的攝食行為)中存在缺陷,會降低食物的輸送效率,導致飲食減少而延長線蟲的壽命[44]。Smita等[44]通過研究發現,從蘆筍中分離的甾體皂苷可以延長秀麗線蟲18%的壽命,這種對壽命的影響是eat-2所介導的,并通過對咽泵率的計算證實了這種方式與飲食限制誘導相似,兩種方式均能降低咽部輸送率。當然甾體皂苷對于壽命的延長不只是這一種方式介導的,還受到SKN-1/NRF-2、DAF-16/FOXO的影響[45]。秀麗隱桿線蟲的sir-2.1基因是第一個被證明影響多細胞動物壽命的Sir2同源物。sir-2.1基因能夠延長秀麗線蟲壽命15%～50%,sir-2.1的作用機制是和HSF-1、胰島素/IGF信號通路(IIS)以daf-16獨立模式協同作用,通過調控下游的daf-16基因,使其具有延長壽命的功能[46]。在秀麗隱桿線蟲中,sir-2.1的過度表達可以促進長壽,通過過度抑制這些基因使動物更易形成dauer,從而決定動物成年期的壽命[47]。芝麻素可以通過飲食限制觸發的sir-2.1基因激活誘導自噬,通過誘導自噬提高線蟲的壽命[48]。同樣Ma等[49]通過靈芝提取物處理缺乏SIR-2.1的線蟲時發現,線蟲壽命未得到延長,表明sir-2.1基因所誘導的自噬途徑是延長壽命所必需的。

2.2 研究方法

利用秀麗隱桿線蟲評價食品抗衰老功能的方法有兩類:一類是觀察食物提取物處理后的線蟲壽命長短評價,一般采用顯微鏡觀察線蟲的存活狀況,并采用鉑絲觸碰確認線蟲存活情況;也有研究人員[50]開發了基于WormFarm平臺等自動觀察線蟲壽命的測量系統。另一類是研究與衰老相關的指標,例如咽泵率、身體運動、脂褐素等。咽泵率隨線蟲年齡變化而變化,在L4時期達到最大,之后隨著年齡增加而降低,通過在限定時間內線蟲的咽部收縮次數的方法來計算咽泵率[37]。身體運動能力則通過一定時間內身體彎曲次數來衡量[38];脂褐素通過熒光顯微鏡測定[39]。

綜上,秀麗隱桿線蟲可用于研究食品的抗衰老作用,能夠為預防衰老、延長壽命提供潛在方案;然而目前研究的生物活性成分多為多酚類物質,例如類黃酮、兒茶酸、酚酸等,維生素等其他活性物質的抗衰老效果也可在秀麗隱桿線蟲模型中進一步評估。

3 C. elegans用于抗氧化模型的評價

3.2 食品對線蟲抗氧化的調控機制

研究[51]表明,癌癥、阿爾茲海默癥等疾病大都與過量氧化自由基有關聯,食品中的功能多肽、多酚等均具有良好的抗氧化性能的物質,對于這些物質抗氧化機制的研究一直頗受關注。秀麗隱桿線蟲作為一種簡單易培養的多細胞生物,其體內中具有與哺乳動物抗氧化同源的調控因子,比如skn-1、sod、clt、mev-1等,所以能夠將其作為研究抗氧化的模式生物。

3.2.1 Insulin/IGF-1(IIS)信號途徑 研究人員注意到,daf-2和age-1突變體不僅具有長壽和dauer形成的特征,而且通過上調SOD和CAT的活性表現出對氧化應激的高抗性。Sod是抗氧化酶系中超氧化物歧化酶基因,包括sod-1至sod-5,其中sod-1、sod-2編碼最主要的超氧化物歧化酶,當體內這兩種基因表達缺失時,會導致線蟲對氧化應激反應敏感,氧化損傷增加[52]。clt是過氧化氫酶編碼基因,包括clt-1和clt-2兩種,過氧化氫酶可以保護線蟲免受過氧化氫應激損傷。過氧化氫是脂肪酸β-氧化的副產物,當線蟲年齡增大時,clt基因含量降低,這可能就是年齡大易受氧化應激損傷的原因[53]。研究發現,南瓜多糖[54]和柑橘提取物[55]等均能通過提高sod和clt基因的表達使超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性增強,達到抗氧化的目的。

3.2.2 MAPK途徑 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,一般分為MAPKKK、MAPKK和MAPK三部分模塊,在MAPK家族中,包括3個途徑:ERK、JNK和p38[46],p38能夠形成PMK-1-p38-MAPK通路,通過轉錄因子SKN-1調控氧化應激反應。其中轉錄因子skn-1是哺乳動物NRF-2蛋白的同源物,具有促進抗氧化應激和長壽的功能[48]。在氧化應激反應中,PMK-1能夠磷酸化SKN-1,導致其在腸核中積累,進而激活II期解毒酶基因gcs-1的轉錄[47]。賦予氧化還原穩態和抗氧化應激能力,當體內skn-1突變時,會降低對氧化應激的抗性[46]。Ma等[49]研究發現,芝麻餅中的肽可以通過skn-1介導延長線蟲的壽命,增強抗氧化應激能力,降低體內ROS水平。樹莓、蘋果、藍莓、木耳等提取物也能夠通過該途徑緩解線蟲的氧化應激損傷,提高抗氧化酶活性,增強對百草枯的抗性[56-58]。

3.2.3 MEV-1 在秀麗隱桿線蟲中,mev-1能夠編碼線粒體中琥珀酸脫氫酶細胞色素b560亞單位的直系同源物,這是氧化磷酸化所必需的[59],當它發生突變時,體內會產生過量的超氧陰離子,使線蟲對氧化條件敏感[60]。Lim等[61]研究秀麗隱桿線蟲攝入麥醇溶蛋白誘導的應激反應時發現,秀麗隱桿線蟲攝入麥醇溶蛋白后,體內細胞中的活性氧的產生顯著增加,導致對氧化應激敏感的mev-1突變體泵吸速率下降最為嚴重,因此麥醇溶蛋白很有可能通過mev-1途徑造成線蟲產生氧化應激反應。而攝入藍莓提取物后會使線蟲體內抗氧化基因上調,包括有mev-1、skn-1、sod-3、cat-1等,從而提高線蟲的抗氧化應激能力[62]。

3.2 研究方法

目前的研究主要通過測定細胞內活性氧(ROS)和氧化酶含量、氧化應激反應來評價食品的抗氧化性。ROS含量主要是利用熒光分光光度計或熒光顯微鏡等測定熒光探針在細胞內被自由基氧化后發出的熒光強度,常用的熒光探針是2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCF-DA)[45]。氧化酶含量通常是通過試劑盒或分光光度計法進行測定,主要是測定超氧化物歧化酶和過氧化氫酶,分光光度法測定的原理在于體系內加入發色基團后,氧化劑能夠使發色基團發色,而酶則與氧化劑反應抑制顯色,通過分光光度計測定顯色的深淺來判斷酶活力[46]。最后一種測定抗氧化性的方式是通過氧化應激反應來測定,這種方法是通過在培養基中加入氧化劑,對線蟲產生致命的氧化應激,觀察在這種環境下線蟲的存活率,通過存活率的百分比來判斷食品是否對秀麗隱桿線蟲具有抗氧化作用,在此過程中所用到的抗氧化劑包括百草枯[47]、叔丁基過氧化氫[45]等。

在秀麗隱桿線蟲用于評價食品的抗氧化功能中,除上述物質外,咖啡因[63]、香豆酸[64]、花青素[15]等也能夠提高線蟲抗氧化能力。雖然目前關于食品對秀麗隱桿線蟲抗氧化能力的影響研究報道較多,但食品種類繁多,其中的營養成分復雜,依然還有很多成分未能得到充分的研究,例如礦物質元素,且對不同食品混合食用對抗氧化能力的影響目前研究較少,因此通過秀麗隱桿線蟲研究食品抗氧化功能具有良好的前景。

4 展望

秀麗隱桿線蟲作為食品營養功能研究的優良模型,彌補了體外(生化試驗、細胞試驗)研究模型的不足,搭建起了連接體外和體內研究的橋梁。而且,目前食品中的功能成分尚未得到充分研究;混合食品提取液后對秀麗隱桿線蟲體內調節的影響研究較少;體內調節途徑以及調節機制之間的相互作用尚未完全明確等。因此,利用秀麗線蟲壽命短、繁殖快等優點,作為食品營養功能的高通量篩選模型,有助于發掘出具有優良的抗肥胖、抗衰老和抗氧化等功能的食品成分;另外線蟲便于分子生物學操作,并與人類基因具有高度同源性,可以結合基因組技術和代謝組學技術研究食品中的功能性成分對線蟲基因的影響和調控機制,為食品的抗肥胖、抗衰老和抗氧化的功能研究提供新的理論依據。