類風濕關節炎患者關節滑液及滑膜組織中CCP/AST表達水平及臨床意義

朱玉光，方麗佳，黃素玲（石家莊市中醫院檢驗科，石家莊 050011）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵蝕性關節炎癥為主要臨床表現的自身免疫病，其基本病理表現為滑膜炎，并逐漸出現關節軟骨和骨破壞，最終導致關節畸形和功能喪失[1]。目前關于RA 的發病機制尚不明確，多認為與自身抗原刺激機體產生自身抗體從而導致機體調節功能紊亂有關，研究發現[2]，RA 患者由于免疫系統功能紊亂，常發生免疫應答，使得機體中產生多種自身特異性抗體，進而引起各種促炎細胞因子的釋放，引起關節滑膜慢性炎癥、炎癥細胞浸潤、軟骨和骨骼破壞，最終導致關節組織的破壞。早期診斷、達標治療是控制病情和改善預后的關鍵，自身抗體對RA 患者的診斷與鑒別診斷以及病情嚴重程度和預后的判斷有著重要作用。類風濕因子（rheumatoid factor，RF）是RA 中首個檢測到的自身抗體，與RA 患者疾病活動度密切相關，陽性率約為70%，但RF 在其它疾?。ǜ稍锞C合征、血液病等）中均呈現陽性，因此其缺乏特異性[3-4]?？弓h瓜氨酸多肽（anticyclic citrulline peptide，anti-CCP）是一類以瓜氨酸類蛋白為靶抗原的自身抗體，是由RA 患者B 淋巴細胞自發分泌，而其他疾病患者和正常人群B 淋巴細胞并不自發分泌CCP，因此認為診斷RA 具有較高的靈敏度和特異度[5-6]。有學者認為CCP 可能作為早期致病靶抗原參與RA 的發病機制，誘導抗原特異性T 細胞的產生并引發一系列自身免疫反應，即在患病早期患者體內可能出現CCP抗原特異性T 淋巴細胞（CCP/AST）[7-8]?；诖?，本研究通過檢測RA 患者關節滑液及滑膜組織中CCP/AST 表達水平，為探究RA 發病的免疫學機制以及臨床治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 納入石家莊市中醫院2021年1～12月收治的128 例RA 患者作為RA 組，根據關節功能分類標準將患者分為輕度組（I～II 級，n=46），中度組（III 級，n=52）和重度組（IV 級，n=30）。納入標準：①所有患者均根據美國風濕病學會標準[9]診斷為RA，嚴重程度I～IV 級；②近期無免疫性藥物或抗體治療。排除標準：①其他風濕性疾??；②嚴重肝腎功能障礙患者；③有精神疾病史、妊娠哺乳期患者。選取同時期在石家莊市中醫院行關節鏡檢查的關節疼痛患者50 例作為對照組，其中男性18 例，女性32 例，年齡30～75（53.65±5.43）歲。RA 組患者男性43 例，女性85 例，年齡30～75（55.24±6.19）歲。RA組和對照組性別、年齡比較，差異無統計學意義（χ2/t=0.092，1.592，P=0.761，0.113）。本研究通過倫理委員會的批準，研究對象均提供知情同意書。

1.2 儀器與試劑 膠原酶 A，DNAse（Roche 公司，瑞士）；Pierce? BCA 蛋白質檢測試劑盒（賽默飛世爾科技公司，美國）；兔抗人RF 多克隆抗體、兔抗人β-ACTIN 多克隆抗體（Abcam 公司，美國）；兔抗人ACPA 多克隆抗體（CST 公司，德國）；辣根過氧化物酶偶聯二抗（上海碧云天公司）；Clarity? Western ECL Substrate，ChemiDoc?MP 成像系統（BIO-RAD 公司，美國）；SYBRGREEN 化學實時PCR（海德堡科技公司，德國）；StepOnePlus? Real-Time PCR System，ABI 7500 Prism 系統軟件（應用生物系統公司，美國）；BD LSRII 流式細胞儀（BD 公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：RA 組及對照組通過超聲引導關節鏡檢查獲得滑膜組織和關節滑液，Ficoll-Hypaque 梯度離心制備滑液單核細胞（synovial fluid mononuclear cells，SFMC），將細胞離心收集后，用細胞凍存液重懸，取1ml 細胞至凍存管中，放入凍存盒，將凍存盒置于-80℃冰箱保存備用。

1.3.2 蛋白質印跡分析：使用裂解緩沖液提取滑膜組織中蛋白質并通過Pierce? 二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質檢測試劑盒（賽默飛世爾科技公司，美國）進行定量。在每孔細胞中加入200μl 含100mmol/L 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和1 mol/L二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)的細胞裂解緩沖液RIPA，吹打細胞進行重懸，超聲裂解 20～30次，冰上裂解30min，100℃金屬浴 5 min，然后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳、轉膜，5ml/dl 脫脂奶粉進行封閉，孵育一抗[抗RF（Abcam，ab106646；稀釋度1∶1 000），抗ACPA（CST，3598S；稀釋度1∶1 000）和抗 β-ACTIN（Abcam，ab8227；稀釋1∶5 000）]，孵育二抗（辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG），電化學發光(electro chemiluminescence，ECL)plus 試劑檢測蛋白。用洗膜緩沖液沖洗后，使用Clarity? Western ECL Substrate（BIO-RAD 公司，美國）進行可視化，使用ChemiDoc? MP 成像系統（BIO-RAD 公司，美國）進行條帶檢測。

1.3.3 關節滑液中CCP/AST 表達分析：標記來自RA 患者和對照組中可溶性纖維蛋白單體復合物（soluble fibrin monomer complex,SFMC）樣本。樣品在BD LSRII 流式細胞儀上運行，并使用FlowJo軟件版本9.3.3 分析數據?？乖禺愋约毎念l率計算為結合部分中CD3+T 淋巴細胞與單核細胞比值(tlymphocyte-monocyte ratio，TMR)的總數除以CD4+T 細胞的總數。

1.3.4 滑膜組織CCP/AST 染色強度：雙重免疫熒光染色/激光共聚焦掃描觀察滑膜組織中CCP/AST染色強度，陽性細胞為細胞膜呈清晰紅、黃熒光染色，按陰性、弱、中、強分別評為 0～3 分。

1.4 統計學分析 采用軟件SPSS 25.0 進行所有數據的統計分析，經Shapiro-Wilk 檢驗是否符合正態分布，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間數據采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用例數和百分比表示，組間比較采用χ2分析；應用Pearson 相關性分析關節滑液、滑膜組織中CCP/AST 表達與RF 和ACPA 的相關性；采用Logistic回歸分析類風濕性關節炎發生的危險因素，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組滑膜組織RF 和ACPA 蛋白表達 對照組、輕度組、中度組和重度組患者滑膜組織中RF（1.01±0.01，1.53±0.03，2.01±0.08 和2.66±0.12 kDa）和ACPA（1.03±0.01，1.61±0.03，2.04±0.10和2.59±0.13 kDa）蛋白依次升高，差異具有統計學意義（F=14.207，12.446，均P＜0.001）；與對照組比較，輕度組、中度組、重度組滑膜組織RF 和ACPA 差異具有統計學意義（t=115.816，129.179；87.715，71.064；97.078，84.795，均P＜0.001）。與輕度組比較，中度組、重度組RF 和ACPA 差異有統計學意義（t=38.359,28.054;61.199,49.316,均P＜0.001）。中度組與重度組比較，RF 和ACPA 差異有統計學意義（t=29.399,21.456,均P＜0.001）。

2.2 關節滑液和滑膜組織中CCP/AST 表達分析 對照組、輕度組、中度組和重度組患者關節滑液中CCP/AST表達（8.26%±1.68%，22.46%±3.28%，33.58%±4.37%和46.15%±5.44%）、滑膜組織CCP/AST 染色強度（1.05±0.26，1.35±0.89，2.04±0.56 和2.78±0.15 分）依次升高，差異具有統計學意義（F=25.306，70.670，均P＜0.05）。與對照組比較，輕度組、中度組、重度組關節滑液和滑膜組織中CCP/AST 表達差異有統計學意義（t=27.011，3.674；38.331，12.504；47.129，18.741，均P＜0.05），與輕度組比較，中度組、重度組CCP/AST 表達差異有統計學意義（t=14.097，4.648；23.702，8.701，均P＜0.05）。中度組與重度組比較，差異具有統計學意義（t=11.457，7.076，均P＜0.05）。

2.3 相關性分析 輕度組、中度組和重度組患者關節滑液、滑膜組織中CCP/AST 表達與RF 和ACPA呈明顯正相關（r=0.840，0.934；0.802，0.913，均P＜ 0.001）。

2.4 RA 發生的危險因素分析 見表1。Logistic 回歸分析結果顯示，高血壓、糖尿病以及關節滑液、滑膜組織中CCP/AST 表達均為RA 發生的獨立危險因素（均P＜0.05）。

表1 Logistic 回歸分析RA 的危險因素

3 討論

類風濕關節炎（RA）是一種與滑膜炎和關節破壞相關的復雜炎癥性疾病，其特征是滑膜關節慢性炎癥、血管翳形成、進行性骨侵蝕和關節破壞，患者通常會出現關節腫脹和壓痛，嚴重可導致殘疾[10-11]。RA 的發展是一個持續的、進行性的、全身性的病理過程，在RA 發病前或早期即可在血清中檢測到RF，ACPA 等多種自身抗體。 隨著各種免疫、成纖維細胞和細胞因子的逐漸相互作用，滑膜組織逐漸產生慢性炎癥，并伴有骨侵蝕和破壞，導致各種臨床癥狀和損傷[12-13]。此外，許多器官系統可能會因全身性炎癥而受損，例如心臟組織、血管系統、腎臟、肺組織和神經系統等，因此RA 的早診斷、早治療尤為重要。

RA 的臨床特征還在于患者血清中存在特異性自身抗體，這些抗體在臨床常規中用作疾病診斷的生物標志物。類風濕因子（RF）是臨床上用來輔助診斷類風濕關節炎的一個經典指標，其可結合免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的Fc 區，形成有助于疾病過程的免疫復合物，其水平升高與持續活躍的滑膜炎、關節損傷、關節炎和殘疾密切相關[14]。但RF 對已確診RA 的特異度僅在60%～70%之間。CCP 抗體是早期診斷RA 的特異性指標，臨床敏感度67%～80%，特異度大于96%，與RF 的診斷敏感度相當，但特異度更高[15]。近年來，有研究發現，抗CCP 抗體陽性的RA 患者的骨破壞比陰性患者更嚴重，抗CCP 抗體的含量與RA 的病情嚴重程度及發展有關[16]?？乖嚯耐ㄟ^體內抗原遞呈細胞的表達激活 T 淋巴細胞，釋放免疫球蛋白、趨化因子和自由基等炎癥介質，從而引發 RA 的特征性病理變化[17]。CD4+T 細胞通過分泌促炎細胞因子在 RA中發揮重要作用，可促進RA 炎癥反應的持續存在。此外，T 細胞頻率已被證明可受疾病持續時間和治療的影響，這表明 T 細胞數量和功能的變化可反映整個疾病過程的變化[18]。研究發現[19]，環瓜氨酸化蛋白與淋巴細胞人類白細胞抗原-DR(HLA-DR)分子結合，通過T 細胞的抗原遞呈功能，進一步刺激RA 患者的T 細胞增殖，環瓜氨酸化蛋白是RA病理過程中的致病靶抗原，其可特異性刺激CCP/AST 的克隆增殖，并與患者病情嚴重程度有關。本研究結果顯示，輕度組、中度組和重度組患者關節滑液中CCP/AST 表達較對照組升高，且隨病情嚴重程度增加而升高，由此可見CD4+T 細胞參與了RA 的發生發展，其中CD4+T 亞群的失衡及其相關信號分子的紊亂在RA 的發生、發展中起著重要作用，基于CD4+T 細胞亞群平衡的免疫調節手段有望成為治療RA 的新策略。

本研究還發現，關節滑液、滑膜組織中CCP/AST 表達與RF 和ACPA 蛋白水平間存在正相關。且Logistic 回歸分析結果顯示，關節滑液、滑膜組織中CCP/AST 頻率均是RA 發生的獨立危險因素。由此可見，RA 患者血液和滑膜組織中CD4+T 細胞被瓜氨酸自身抗原刺激后逐漸激活擴增，進一步表達促炎和細胞溶解介質，殺傷靶細胞，最后導致關節組織破壞，加重疾病。這進一步證實了風濕性關節炎患者外周血、關節滑液及滑膜組織中CCP/AST檢測具備較好的臨床診斷價值，并且可以用于預估病情的預后。

綜上所述，RA 患者關節滑液及滑膜組織中CCP/AST 呈現高表達，且與疾病活動度及關節破壞有關，可用于評估此類患者臨床關節活動度及骨破壞程度。本研究的局限性在于：未收集有關患者治療和就診時疾病持續時間、疾病活動性或樣本提取時可能的關節外表現的信息，使得研究結果可能存在偏倚，后續研究中需要進一步擴大納入指標及研究范圍，以此證實研究結果的真實性。