飼糧添加不同水平蘆丁對肉雞肉品質和抗氧化功能的影響

馬龍飛,陳順,周斌斌,劉慧娟,張佳琦,王恬,王超

(南京農業大學動物科技學院,江蘇 南京210095)

肉雞產品具有較高的營養價值及相對低廉的價格,現已成為居民肉類食品中不可缺少的部分。隨著生活水平的日益提高,消費者對肉雞的肉品質也有了更高要求。研究發現,過量的氧自由基可與雞肉中大量蛋白質、脂質特別是不飽和脂肪酸(UFA)發生氧化反應,降低雞肉風味,嚴重影響肉品質[1]。此外,肉的保水性、色澤和嫩度也會影響肉品質,影響消費者的購買欲望。營養調控是一種有效改善雞肉品質的方式。近年來,在飼糧添加具有綠色、多功能等特點的植物提取物以提高機體抗氧化功能、改善雞肉品質的營養調控方式受到廣泛關注[2]。

蘆丁(rutin)又名蕓香苷,是一種多酚類化合物,化學式為C27H30O16,可從白紋豆屬、菖蒲屬、桉樹屬等植物中獲得[3-4]。蘆丁對超氧化物、過氧化物及自由基等表現出較高的抗氧化性質,具有廣泛應用于醫藥、飼料等行業的潛力[5],同樣蘆丁還具有抗菌[6]、抗炎[7]、預防肥胖[8]和維護腸道功能[9]等作用。研究發現,蘆丁可減少高脂飲食誘導小鼠肌肉中脂肪含量[10];還可顯著改善銀鯰魚肌肉中的脂肪酸分布,進而防止肌肉損傷[11];還有研究發現飼糧添加0.15%蘆丁可緩解嗜水藻誘導的銀鯰魚氧化應激,提高抗氧化能力[12]。蘆丁在畜禽生產中也有廣泛應用,Hassan等[13]研究發現,在肉仔雞飼糧中添加1 000 mg·kg-1蘆丁可顯著增強肉仔雞肝臟抗氧化能力,提高生長性能;蘆丁可增強奶?？箲つ芰?提高其生產性能[14];王海波等[15]也發現蘆丁可提高湖羊機體抗氧化能力。目前,關于蘆丁的研究主要集中在小鼠、魚類及反芻動物上,飼糧中添加蘆丁對肉雞肉品質的影響研究尚未見報道。因此,本試驗通過在飼糧中添加不同水平的蘆丁,從肉雞肌肉品質、脂肪酸含量、抗氧化能力等系統評估蘆丁對肉雞肉品質的影響,為蘆丁在肉雞上的應用及研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

選擇256只1日齡AA肉雞[(43±0.5)g]為試驗對象,將其隨機分為4組,每組8個重復,每個重復 8只雞,分別飼喂基礎飼糧添加0 mg·kg-1(對照組),以及250、500和1 000 mg·kg-1蘆丁(處理組)。試驗期 42 d,分為飼養前期(1～21 d)和飼養后期(22～42 d)?；A飼糧按照美國國家研究委員會頒布的家禽營養需求標準(NRC,1994)配制,相應成分和營養水平見表1。試驗所用蘆丁(純度>95%)購自上海阿拉丁生物技術股份有限公司。

表1 基礎飼糧原料組成及營養組成Table 1 Ingredient compositions and nutrient compositions of basal diets %

1.2 飼養管理

禽舍消毒1周后采用3層疊籠飼養,每籠8只肉雞,各組間各重復的肉雞在同層高的籠子里進行飼養,避免層高對其產生的影響。試驗期間,肉雞自由采食粉料和飲水,前3 d房間溫度保持恒溫(34±1)℃,每周穩定下降2～3 ℃,最終溫度為22 ℃,相對濕度45%～55%,按常規程序進行免疫。

1.3 樣品采集與處理

在試驗第42天時,試驗雞禁食12 h后,每重復選取接近該重復平均體重的1只雞屠宰,解剖取左側胸肌樣品,用于抗氧化酶活和相關基因表達的分析,右側胸肌樣品用于肉品質、低場核磁共振技術(NMR)、脂肪酸等相關指標測定。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 胸肌肉品質取右側胸肌使用色度計(Konica Minolta Sensing Inc,日本)測定肌肉肉色(亮度、紅度、黃度),使用便攜式pH計(HI9125,HANNA Instruments,意大利)測定肌肉pH值(pH45 min、pH24 h),使用數字嫩度儀(C-LM3B,東北農業大學)測定肌肉剪切力,使用電子天平等儀器測定肌肉蒸煮損失和滴水損失(24和48 h)等指標,具體操作步驟參照王雨雨等[16]的方法。

1.4.2 胸肌水分狀態及分布情況稱取胸肌樣品(約2 g)使用PQ001 LF-NMR分析儀(上海紐邁電子科技有限公司)測定肉雞胸肌中結合水、不易流動水、自由水的弛豫時間(T2b、T21、T22)并計算得出相應峰面積比(P2b、P21、P22)。具體操作步驟參照黃子信等[17]的方法。

1.4.3 脂肪酸組成分析脂肪酸組成測定采用氣相色譜法,稱取2 g左右胸肌樣品到試管中,用氯仿-甲醇法提取肌肉中的脂質,加2 mL十五碳酸(5 mg·mL-1)、2 mL氯仿-甲醇(2∶1)、1 mL 8.3 mol·L-1鹽酸,混勻。在水解(70～80 ℃,40 min)期間,每10 min振蕩試管1次。水解完成后取出試管冷卻至室溫。然后用氫氧化鈉/甲醇對脂肪酸甲酯進行氣相色譜預處理后上氣相色譜儀(Agilent Technologies Co,Ltd,Palo Alto,CA)檢測,具體步驟參照Yu等[18]的方法。

1.4.4 胸肌組織抗氧化酶活性測定取胸肌組織樣品(約100 mg)與生理鹽水按質量體積比為1∶9的比例勻漿,在4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min,吸取上清液用于測定胸肌組織中總蛋白(total protein,TP)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和總抗氧化能力(total anti-oxidant capacity,T-AOC)、總超氧化物歧化酶(total-superoxide dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase,CAT)的活性。試劑盒均購自南京建成生物研究所,測定步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4.5 胸肌組織mRNA相對表達量測定取胸肌組織樣品(約0.1 g),使用TRIzol試劑(TaKaRa)提取總RNA,通過RT-qPCR檢測目的基因mRNA表達量。具體操作根據劉慧娟等[19]的研究方法。以β-actin為內參基因,使用2-ΔΔCT方法計算各基因mRNA的相對表達量[20]。引物序列見表2。

表2 本試驗中PCR引物序列Table 2 PCR primers sequences in this experiment

1.5 數據統計與分析

采用SPSS 22.0統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析,并用Duncan’] s法進行多重比較,采用多項式中的線性和二次分析對蘆丁不同梯度的效果進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同水平蘆丁對肉雞肌肉品質的影響

如表3所示：與對照組相比,飼糧中添加250、500和1 000 mg·kg-1蘆丁顯著降低了胸肌宰后24和 48 h 的滴水損失(PT<0.05),且肉雞胸肌宰后24和48 h的滴水損失與蘆丁添加量有顯著劑量效應(PL<0.05;PQ<0.05);添加250與500 mg·kg-1蘆丁分別降低了胸肌的蒸煮損失與剪切力值(PT<0.05),且胸肌蒸煮損失和剪切力值與蘆丁添加量呈二次曲線相關(PQ<0.05);添加500和1 000 mg·kg-1蘆丁顯著提高了胸肌pH24 h值(PT<0.05),且隨著蘆丁添加量的增加,胸肌pH24 h值呈線性增加(PL<0.05)。但飼糧添加250、500和1 000 mg·kg-1蘆丁對胸肌肉色和pH45 min值未產生顯著影響(PT>0.05)。

表3 不同水平蘆丁對肉雞胸肌肉品質的影響Table 3 Effects of different levels of rutin on breast muscle quality of broilers

2.2 不同水平蘆丁對肉雞胸肌水分分布狀態的影響

如表4可知：與對照組相比,飼糧中添加500 mg·kg-1蘆丁顯著降低了肉雞胸肌中自由水的弛豫時間T22值(PT<0.05);飼糧添加250、500和1 000 mg·kg-1蘆丁對肉雞胸肌中結合水、不易流動水和自由水的峰面積比(P2b、P21和P22)未產生顯著影響(PT>0.05)。

表4 不同水平蘆丁對肉雞胸肌水分分布狀態的影響Table 4 Effects of different levels of rutin on breast muscle water distribution of broilers

2.3 不同水平蘆丁對肉雞肌肉脂肪酸含量的影響

如表5所示：與對照組相比,飼糧中添加250和500 mg·kg-1蘆丁顯著增加了肉雞胸肌中硬脂酸含量(PT<0.05),500 mg·kg-1蘆丁組胸肌中棕櫚油酸和二十四碳一烯酸含量顯著增加(PT<0.05),且胸肌中硬脂酸、棕櫚油酸和二十四碳一烯酸含量與蘆丁添加量呈二次曲線相關(PQ<0.05);飼糧中添加500和 1 000 mg·kg-1蘆丁顯著提高了肉雞胸肌中花生一烯酸和多不飽和脂肪酸(PUFA)含量(P<0.05),1 000 mg·kg-1蘆丁組胸肌中γ-亞油酸含量顯著降低(PT<0.05);并隨著蘆丁添加量的增加,胸肌中花生一烯酸、花生四烯酸、多不飽和脂肪酸和γ-亞油酸含量值呈線性增加(PL<0.05),但飼糧添加250、500和1 000 mg·kg-1蘆丁對肉雞胸肌中其他脂肪酸含量未產生顯著影響(PT>0.05)。

表5 不同水平蘆丁對肉雞胸肌中脂肪酸含量的影響Table 5 Effects of different levels of rutin on fatty acid content in breast muscle of broilers %

2.4 不同水平蘆丁對肉雞肌肉抗氧化能力的影響

如表6所示：與對照組相比,飼糧中添加500 mg·kg-1蘆丁顯著降低了胸肌中MDA含量(PT<0.05),提高了T-SOD活性(PT<0.05),胸肌中T-SOD活性和T-AOC與蘆丁添加量呈線性增加(PL<0.05),胸肌中MDA含量與蘆丁添加量呈二次曲線相關(PQ<0.05),但飼糧添加250、500和1 000 mg·kg-1蘆丁對肉雞胸肌中GSH-Px和CAT活性無顯著影響(PT>0.05)。

表6 不同水平蘆丁對肉雞肌肉抗氧化能力的影響Table 6 Effects of different levels of rutin on antioxidant capacity muscle in broilers

2.5 不同水平蘆丁對肉雞肌肉抗氧化相關基因表達量的影響

如圖1所示：與對照組相比,飼糧中添加250和500 mg·kg-1蘆丁顯著提高了胸肌中SODmRNA的表達量(PT<0.05),且SODmRNA的表達量(PQ<0.05)與蘆丁添加量呈二次曲線相關(PQ<0.05);飼糧中添加500 mg·kg-1蘆丁顯著提高了胸肌中Nrf2 mRNA的表達量(PT<0.05),并隨著蘆丁添加量的增加,胸肌中Nrf2和GSH-PxmRNA的表達量呈線性增加(PL<0.05)。但飼糧添加250、500和1 000 mg·kg-1蘆丁對HO-1和NQO1 mRNA的表達量無顯著影響(PT>0.05)。

圖1 不同水平蘆丁對肉雞肌肉抗氧化相關基因mRNA表達量的影響Fig.1 Effects of different levels of rutin on mRNA expression of antioxidant-related genes in broiler muscles

3 討論

3.1 不同水平蘆丁對肉雞肌肉品質和水分分布的影響

肉色、pH、滴水損失、蒸煮損失、系水力及嫩度等是反映肉品質的主要指標[21]。肌肉pH值反映了其酸堿度,其可直接影響肌肉的肉色和剪切力等,動物屠宰后糖酵解反應產生乳酸,其可降低肌肉pH值,導致肌肉風味變差,保水性下降,進而影響肌肉品質[22]。本試驗中,添加500和1 000 mg·kg-1蘆丁顯著提高了肉雞胸肌pH24 h值,此結果表明蘆丁能夠提高肉雞胸肌pH值并改善肌肉品質。肌肉肉色可反映肌肉的生理和生化等水平,是評價肉品質的重要指標之一[23]。鄭旭[24]研究表明,飼糧添加10和50 mg·kg-1槲皮萬壽菊素可顯著降低肉雞胸肌黃度值。在本試驗中,飼糧中添加蘆丁對肉雞肌肉肉色的相關指標并無顯著影響,這可能與蘆丁的純度和添加劑量不同有關。肌肉滴水損失和蒸煮損失的提高對肉的外觀、保水性、食用質量等造成不良影響[25]。肌肉剪切力值可用來評價肌肉的嫩度,剪切力值低則肉質嫩度高,肉質適口性好[26]。在本試驗中,飼糧中添加蘆丁能夠顯著降低胸肌屠宰后24和48 h的滴水損失,這與Ouyang等[27]研究發現苜蓿黃酮可降低肉雞胸肌滴水損失的試驗結果相似。添加250 mg·kg-1蘆丁顯著降低了胸肌蒸煮損失,而添加500 mg·kg-1蘆丁顯著降低了胸肌剪切力,姜義寶等[28]研究表明,飼糧添加紅車軸草異黃酮能夠降低肉雞肌肉中滴水損失和剪切力值,本試驗結果與之類似。綜上,蘆丁可通過提高肉雞胸肌pH24 h值,降低滴水損失、蒸煮損失和剪切力值,增強雞肉保水性和嫩度。

肌肉組織中的水分主要包括結合水、不易流動水和自由水。結合水與細胞內部的蛋白質緊密結合,不影響肌肉保水性;不易流動水存在于細胞內部,其含量增加表明肌肉保水性提高;自由水存在于肌肉細胞間隙,為容易流失的不穩定水[29]。弛豫時間(T22)值可反映不易流動水的自由程度,其值越高,不易流動水越容易轉變為自由水,導致水分流失增加,保水性能下降[30]。吳燁等[31]研究結果表明,不易流動水和自由水的弛豫時間(T21)和(T22)隨著肌肉pH值升高而降低,而本試驗結果表明,飼糧中添加500 mg·kg-1蘆丁能夠顯著降低胸肌中自由水弛豫時間(T22)值,這與蘆丁可提高胸肌pH24 h值結果相符。綜合胸肌滴水損失來看,飼糧添加蘆丁可以提高肉雞肌肉的保水性。

3.2 不同水平蘆丁對肉雞肌肉脂肪酸含量的影響

肌肉不同脂肪酸含量對肉的嫩度、風味和營養價值等均會產生影響,是評價肉品質的重要指標[32]。本試驗結果表明飼糧中添加500 mg·kg-1蘆丁顯著增加了肉雞胸肌中硬脂酸、棕櫚油酸和二十四碳一烯酸的含量。棕櫚油酸等不飽和脂肪酸(UFA)在加熱過程中氧化產生香氣,而硬脂酸也是肌肉中主要的風味前體物質之一,其含量越高,肉質風味越好[33]。因此,本試驗結果提示添加蘆丁可通過提高肌肉中多種不飽和脂肪酸及硬脂酸含量,增加雞肉風味。SFA含量過高會引起膽固醇沉積等心血管疾病,而PUFA含量提高不僅可增加肉質風味,還具有調節脂質代謝、緩解炎癥反應,預防癡呆癥和多種心血管疾病的作用,因此,SFA和PUFA常用來評估肌肉的營養價值[34-36]。本試驗結果表明,飼糧中添加500和1 000 mg·kg-1蘆丁顯著提高了肉雞胸肌中PUFA含量,但對肉雞胸肌中SFA含量沒有顯著影響。因此,蘆丁可通過改變肌肉中脂肪酸的含量,進而改善肌肉的營養價值。其原因可能是蘆丁中的酚羥基釋放的氫與過氧化物結合,通過阻止PUFA氧化,降低肌肉中脂肪酸的氧化程度[37]。

3.3 不同水平蘆丁對肉雞肌肉抗氧化功能的影響

氧化應激會對雞肉的風味、肉色和營養價值造成不良影響,導致肉品質下降[38]。我們通過對胸肌抗氧化能力研究發現,飼糧中添加500 mg·kg-1蘆丁顯著降低了胸肌中MDA含量,提高了T-SOD活性。脂質氧化是肌肉氧化的方式之一,MDA是脂質過氧化的重要產物,SOD可通過轉化高活性自由基超氧化物,減弱肌肉氧化作用[39-41]。本研究中,500 mg·kg-1蘆丁可通過降低MDA含量與提高T-SOD活性來減少脂質過氧化,提高肌肉的抗氧化能力。此外,飼糧中添加500 mg·kg-1蘆丁還顯著提高了胸肌中Nrf2和SODmRNA的表達量。Nrf2可通過調節相關抗氧化基因表達來增強機體的抗氧化能力[42],這與Tian等[43]在試驗中發現腹腔注射蘆丁可以增強大鼠抗氧化防御系統的結果一致;Shi等[44]研究也表明飼糧中添加黃酮類化合物芩黃素可通過激活小鼠肝臟中Nrf2 mRNA的表達量,提高機體抗氧化能力。而SODmRNA的表達量的提高與T-SOD活性增強的結果一致。肌肉抗氧化能力的提高可以通過抑制細胞膜上不飽和脂肪酸的過氧化作用,防止產生的自由基與細胞膜上的蛋白質結合引起膜結構改變,使細胞膜通透性增強,從而起到保水的作用[45]。肌肉抗氧化能力的提高也可通過提高肌紅蛋白穩定性,改善肌肉色澤[46],與本研究中蘆丁可提高PUFA含量和改善肉品質的結果一致。蘆丁對肌肉抗氧化功能的改善作用一方面是蘆丁作為多酚類物質,本身具有抗氧化作用[47];另一方面是蘆丁通過激活Nrf2信號通路,上調相關抗氧化酶基因的表達,提高肌肉抗氧化能力[48]。

綜上所述,飼糧添加蘆丁可通過激活Nrf2信號通路中相關基因的表達提高肉雞肌肉抗氧化能力,而肌肉肉品質的提高與脂肪酸組成的變化與蘆丁提高肌肉抗氧化能力有關。在本試驗條件下,蘆丁的適宜添加量為500 mg·kg-1。因此,蘆丁可改善肉雞肌肉品質的作用在畜禽生產方面具有較高的應用前景。