日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸屏障相關基因表達、消化酶活性和微生物菌群的影響

劉靜,王釗,于昊,夏雨婷,李鵬,牛偉強,萬永杰,茆達干*

(1.南京農業大學動物科技學院,江蘇 南京 210095;2.啟東瑞鵬牧業有限公司,江蘇 南通 226000)

肉羊產業是畜牧業的重要組成部分,但常規飼料資源短缺等問題阻礙了肉羊產業的發展。開發非常規飼料資源、豐富飼料種類是促進養羊業可持續發展的關鍵。蠶豆是我國重要的糧食作物和飼料原料,然而在長江以南等蠶豆主產區,其副產物蠶豆皮未得到充分利用。蠶豆皮除常規營養成分外,含有果膠和多巴等化學成分,并富含膳食纖維及原花青素等生物活性物質。研究表明,在動物飼料中添加一定比例的蠶豆皮膳食纖維,有利于促進腸道蠕動、吸收營養物質、提高動物生長性能,且蠶豆皮中的原花青素是其發揮抗氧化活性作用的主要成分[1]。豆皮可被腸道微生物利用,經腸道中的菌群發酵而發揮益生元作用,促進有益菌的增殖,抑制有害菌的增殖,維持腸道微生態平衡[2]。

研究表明,空腸上皮細胞對調節營養物質的攝取和代謝發揮著重要作用,對微生物的定殖能立刻做出反應[3],其上皮細胞可利用膳食纖維經微生物發酵產生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)為反芻動物提供能量來源,并且調節腸道炎癥反應[4]。腸黏膜上皮細胞彼此相連,構成完整的生物屏障,細胞質膜蛋白與接頭蛋白形成的蛋白網狀結構是緊密連接的重要部分[5],具有調節腸道通透性的作用。炎癥細胞因子影響腸黏膜緊密連接蛋白表達和分布[6]。消化酶可促進食物中糖、脂肪和蛋白質的水解,這一過程主要發生在十二指腸和空腸段。腸道微生物結構主要受日糧組成的影響,還與外界應激和生殖激素等密切相關[7]。

本課題組前期在等能等氮的基礎上,分別在基礎日糧中添加不同比例的蠶豆皮日糧飼喂湖羊,結果發現日糧添加30%蠶豆皮組湖羊的生長性能顯著提高。腸道是繼瘤胃消化吸收后的主要營養物質吸收場所,影響反芻動物生產性能等。研究表明小腸對營養物質的消化吸收受到腸道屏障功能、消化酶活性及腸道菌群結構等因素的影響[8]。因此,本試驗以湖羊空腸為對象,研究日糧添加30%蠶豆皮對黏膜屏障相關基因表達、消化酶活性和食糜微生物區系的影響,以探究改善湖羊生產性能的潛在機制,為蠶豆皮的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試驗日糧

選擇體況良好、體重相近[(27±2.0)kg]的4月齡雄性湖羊30只,隨機分為2組(n=15),每組 3個重復,每個重復5只羊。對照組(CON)飼喂基礎日糧,試驗組(BBS)飼喂添加30%蠶豆皮的基礎日糧。2組日糧組成和營養成分見表1。

表1 日糧組成及營養組成水平(風干基礎)Table 1 Diet composition and nutritional level(air-dry basis) %

1.2 試驗設計與樣品采集

預試期為10 d,正式期50 d。試驗期間,每天08：00和14：00各飼喂1次,自由采食和飲水。試驗結束,每組選擇中位體重的5只羊屠宰(n=5),宰前禁食24 h、禁水2 h,頸動脈放血屠宰。解剖后采集空腸組織樣品和食糜于凍存管中,干冰保存帶回實驗室-80 ℃冷凍保存,用于后續腸黏膜屏障相關基因、消化酶活性和食糜微生物測序試驗。

1.3 試驗樣品測定

1.3.1 空腸黏膜屏障相關基因表達量應用RT-qPCR檢測空腸黏膜屏障相關基因mRNA相對表達量,包括閉合蛋白1基因(Claudin-1)、閉鎖蛋白基因(Occludin)、黏蛋白2基因(mucoprotein-2,MUC-2)、閉合小環蛋白基因(zonula occludens-1,ZO-1)、白細胞介素6基因(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素10基因(interleukin-10,IL-10)、白細胞介素1β基因(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α基因(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)。使用RNA提取試劑盒(RC112,南京諾唯贊生物科技有限公司)提取組織總RNA,反轉錄試劑盒(R323-01,南京諾唯贊生物科技有限公司)獲得cDNA,定量試劑盒(Q311-01,南京諾唯贊生物科技有限公司)檢測mRNA相對表達量。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成,序列如表2所示。對內參基因β-actin標準化后,通過2-ΔΔCT方法計算基因相對表達水平。

表2 目的基因引物序列Table 2 Primer sequences of target genes

1.3.2 空腸黏膜消化酶活性測定應用生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測空腸黏膜胰蛋白酶(A080-2)、脂肪酶(A054-2)和α-淀粉酶(C016-1)的活性,具體方法參照說明書。

1.3.3 空腸食糜微生物多樣性測定從空腸食糜樣品中提取微生物組樣本總DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量和濃度。參照Logue等[9]的方法設計引物序列并進行PCR擴增,產物經純化和定量,擴增子池用于測序,利用Illumina NovaSeq 6000測序儀進行測序。測序原始數據經特定條件過濾篩選得到擴增序列變體特征序列(amplicon sequence variant,ASV)和ASV豐度表,去除序列數為1的ASV,利用QIIME2軟件統計微生物群落的α和β多樣性。多樣性測定由杭州聯川生物技術股份有限公司完成。

1.3.4 生物信息學分析根據ASV序列文件,采用SLIVA數據庫和NT-16S數據庫進行物種注釋,并根據ASV豐度表對各物種在各樣本中的豐度進行統計。注釋置信度閾值為0.7?；赑ICRUSt 2功能預測結果,得到來自KO等數據庫功能注釋結果,以展示豐度差異顯著的功能。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸黏膜屏障相關基因表達的影響

由表3可知：日糧添加30%蠶豆皮(BBS)組湖羊空腸中編碼細胞連接相關基因Claudin-1、Occludin、MUC-2、ZO-1 mRNA水平較對照組(CON)無顯著變化(P>0.05),編碼炎癥因子相關基因IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA水平較對照組無顯著變化(P>0.05),但IL-1βmRNA水平在BBS組中顯著降低(P<0.05)。

表3 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸屏障相關基因表達的影響Table 3 Effects of dietary broad bean skin(BBS)on jejunum barrier-related gene expressions in Hu sheep

2.2 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸黏膜消化酶活性的影響

由表4可知：日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸黏膜α-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性均無顯著影響(P>0.05)。

表4 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸黏膜消化酶活性的影響Table 4 Effects of dietary BBS on the activity of digestive enzymes in the jejunum mucosa of Hu sheep U·mg-1

2.3 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸食糜微生物多樣性的影響

韋恩(Venn)圖反映腸道內容物樣品的操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)數目。每組各檢測4個樣本(2組各有1個樣本菌群含量過少,均未上機進行后續測序)。由圖1可知：CON組和BBS組分別有1 445和549個特異OTU,其中417個為共同OTU。不同分組腸道菌群組成的OUT指數存在顯著差異?？漳c食糜細菌的主成分分析結果如圖2,主成分1和2的貢獻率分別為87.08%和5.79%。同一組別內樣品間距離較近,不同組別樣品間的距離也較近,說明2組湖羊空腸食糜菌群結構相似。由表5可知：CON的Shannon、Chao1和Observed_otus指數顯著高于BBS組(P<0.05),2組覆蓋率均在99%以上。

圖1 食糜微生物韋恩圖Fig.1 Venn diagram of chyme

圖2 主成分分析圖Fig.2 Principal components analysis(PCA)diagram

表5 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸食糜微生物α多樣性的影響Table 5 Effects of dietary BBS on the microbial alpha diversity of jejunum chyme in Hu sheep

2.4 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸食糜微生物菌群結構和功能的影響

2.4.1 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸食糜微生物菌群結構的影響有效序列不同分類水平的物種注釋統計結果如表6,以相對豐度≥1%為準,低于1%的菌門歸為其他。由表6可知：CON組的優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria),BBS組的優勢菌門除上述菌門之外還有軟壁菌門(Tenericutes)。相比對照組,BBS組變形菌門的相對豐度較顯著增加(P<0.05),厚壁菌門和髕骨細菌門的相對豐度顯著降低(P<0.05)。

表6 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸食糜細菌門水平豐度的影響Table 6 Effects of dietary BBS on the abundance of jejunum chyme bacteria in Hu sheep at the phylum level %

在屬水平上,對相對豐度在前30的菌屬進行統計,其中相對豐度在1%左右的有14個菌屬。如表7所示：BBS組的克里斯滕森氏菌R7菌群(Christensenellaceae_R-7_group)、未分類厚壁菌屬(Firmicutes_unclassified)、糖單胞菌屬(Candidatus_Saccharimonas)、糖酵解菌屬(Saccharofermentans)、毛螺菌NK3A20菌群(Lachnospiraceae_NK3A20_group)和聚乙酸菌屬(Acetitomaculum)的相對豐度顯著降低(P<0.05)。

表7 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸食糜細菌屬水平豐度的影響Table 7 Effects of dietary BBS on the abundance of jejunum chyme bacteria in Hu sheep at the genus level%

2.4.2 菌群功能預測分析利用16S rDNA預測工具PICRUSt 2軟件對這2組樣品的微生物進行功能預測,參考KO數據庫并對預測的功能類別進行注釋,結果如圖3所示,2組湖羊空腸細菌注釋到的KO分析隸屬于30個功能類別,豐度較高的功能預測為脂肪酸β氧化、原兒茶素降解Ⅱ、三羧酸循環Ⅴ、L-亮氨酸降解Ⅰ、脂肪酸回收、三羧酸循環Ⅰ,且BBS組顯著高于對照組(P<0.05)。

圖3 KEGG功能注釋Fig.3 KEGG functional note

3 討論

3.1 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸黏膜屏障相關基因表達量的影響

腸道屏障是機體一道重要的屏障,可以幫助機體抵御外界的有害物質。環境的更換以及飼養管理的轉變,可能影響腸道功能,使腸道屏障受損。緊密連接蛋白如Claudin-1、Occludin、ZO-1等具有調節腸道通透性的作用,蛋白表達上調時,可降低腸道通透性,防止細菌移位,增強腸道屏障功能[10]。分泌型黏蛋白MUC2是腸上皮細胞分泌的一種高分子質量糖蛋白,腸道黏膜屏障受損會導致MUC2表達量下調。山羊運輸應激2和6 h后空腸Claudin-1、Occludin和ZO-1基因表達量極顯著上升[11]。日糧添加鉬降低了小尾寒羊空腸Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達量[12]。IL-1β、TNF-α和IL-6是介導炎癥反應的關鍵細胞因子,三者會使腸黏膜緊密連接蛋白表達和分布發生變化,表達量升高引起腸道通透性增加,因此,降低這些因子的含量可提高腸道屏障功能。而IL-10是由各種細胞分泌的重要抗炎細胞因子,可抑制TNF-α的釋放,對維持腸道免疫穩態至關重要[13],在控制和消除炎癥中起重要作用[14]。蠶豆皮富含原花青素,原花青素具有抗炎和抗菌的作用,能調節機體免疫反應[15],降低氧化應激導致的腸黏膜損傷[16],從而改善動物健康狀況,促進生長。當面臨飲食結構改變的壓力時,動物腸道容易受到刺激,導致緊密連接蛋白的分解或降低,從而增加上皮通透性,引起局部炎癥[17]。本試驗中,日糧添加30%蠶豆皮并未顯著改變Claudin-1、Occludin、ZO-1、MUC-2的mRNA水平,說明湖羊對添加蠶豆皮日糧的適應效果較好,并未因飼料結構的改變而產生不良反應,未對腸道造成生理損傷。湖羊采食添加蠶豆皮日糧后空腸黏膜IL-1β表達量降低,可能蠶豆皮中原花青素具有抗炎作用,保護機體腸道的免疫功能,具體機制有待進一步研究。

3.2 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸消化酶活性的影響

腸道消化酶活性的高低可反映反芻動物采食性能,同時還能直接決定腸道對營養物質吸收和利用的程度。機體的消化功能與其胃腸道所產生的消化酶活性及其分泌量呈正相關,繼而影響動物的生長發育。動物自身能夠合成淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等消化酶,且不同腸段消化酶活性不同。小腸內消化酶活性受日糧淀粉、脂肪和蛋白質進食量的影響[18]。周力等[19]使用不同比例棕櫚粕替代玉米飼喂藏羊,結果表明0%組空腸食糜的α-淀粉酶和脂肪酶活性顯著或極顯著小于15%組,提示日糧脂肪含量的高低影響脂肪酶的活性。此外,在小麥飼料中添加0.2%木聚糖酶可提高高原型藏羊的空腸α-淀粉酶活性[20]。研究表明,當精粗比和營養成分含量達到一定水平后,改變日糧結構不會提高胰蛋白酶和脂肪酶活性[21]。曲星梅等[22]研究表明,6月齡絨羊空腸胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活性隨日糧能量和蛋白水平變化,當升高到一定營養水平,腸道消化酶活性不再上升。本試驗中,2種日糧的粗蛋白、能量和脂肪含量水平在湖羊需要范圍內,且含量接近,這可以解釋日糧添加30%蠶豆皮不影響空腸段淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性的結果。

3.3 日糧添加蠶豆皮對湖羊空腸微生物菌群結構和功能的影響

腸道菌群在促進腸道形態結構發育、維持正常免疫功能及抵御外源致病因子侵襲方面發揮重要作用[23]。Shannon、Simpson、Chao1和Observed_otus指數反映樣本中物種豐富度和均勻度,Goods coverage反映微生物覆蓋率,其數值越高,則樣本中新物種沒有被測出的概率越低。本試驗中測序覆蓋率接近100%,說明測序樣品取樣較準確,可以真實地反映湖羊空腸微生物多樣性和群落結構[24]。本研究發現CON組微生物多樣性和數量高于BBS組,表明日糧添加蠶豆皮后降低了腸道微生物多樣性。湖羊正常腸道菌群在生長過程中與宿主和環境相互適應,容易受到飲食和環境的影響,BBS組較對照組腸道菌群OUT數量顯著降低,這可能與添加蠶豆皮后日糧營養結構發生改變,營養成分豐富度降低有關。

研究表明,牛羊小腸中的變形菌門豐度較高。Zhang等[25]對小尾寒羊腸道微生物研究后發現,空腸中存在豐度較高的厚壁菌門和藍藻菌門,在屬水平上乳酸菌、瘤胃球菌和聚乙酸菌的豐度較高。變形菌門包括許多腸道致病菌類別[26],如大腸桿菌等;但變形菌門下的菌群種屬并非都是致病菌類,部分也可對有關糖類代謝和蛋白表達的基因進行編碼,從而確保腸道的正常厭氧狀態[27]。姜碧薇等[28]研究表明酶菌混合處理雖提高瘤胃變形菌門的相對豐度,但并未對灘羊腸道產生不良影響。厚壁菌門是反芻動物胃腸道細菌的重要組成部分,能夠分解飼糧中的纖維物質,其優勢地位受日糧中纖維物質的影響[29],本試驗結果與之相似,湖羊采食添加蠶豆皮日糧后,厚壁菌門豐度隨總體纖維含量降低而變化。本試驗中,蠶豆皮組擬桿菌門相對豐度有所提高,厚壁菌門的相對豐度降低。厚壁菌門和擬桿菌門協作消化一些動物自身無法利用的物質。潘鋒等[30]試驗結果表明,飼糧中添加酵母培養物和糖蜜及兩者混合物降低了糞便厚壁菌門相對豐度,提高擬桿菌門相對豐度,提高肉牛的纖維降解率。髕骨細菌門、糖單胞菌屬和糖酵解菌屬被認為在正常腸道功能中發揮重要作用[31],其相對豐度與炎癥反應呈正相關。本試驗中,髕骨細菌門、糖單胞菌屬和IL-1β結果變化趨勢表明日糧添加蠶豆皮對腸道正常功能發揮有一定的促進作用。聚乙酸菌屬能夠利用瘤胃中產生的氫和單糖生成乙酸[32],沈子亮等[33]研究發現瘤胃內聚乙酸菌屬相對豐度的增加改變了瘤胃發酵模式,從而影響動物的生產性能,降低乳脂率。本試驗結果顯示,添加蠶豆皮后降低了腸道產酸菌的相對豐度,結合本課題組前期試驗中生產性能提高這一結果,日糧添加蠶豆皮可能通過影響產酸菌在瘤胃內的定殖,進而影響腸道中產酸菌的相對豐度。綜上,日糧添加30%蠶豆皮制作全價配合飼料飼喂湖羊可改變空腸食糜微生物菌群組成和相對豐度。

腸道菌群可以調節腸道微生態,促進腸道營養物質的消化吸收,提高機體免疫力。本研究中功能預測到的差異菌群主要富集在三羧酸循環、脂肪酸β氧化、原兒茶酸降解和L-亮氨酸降解通路。脂肪酸是脂肪分解后的產物,經β-氧化后產生乙酰CoA和甘油,為三羧酸循環提供原料,葡萄糖和脂質的代謝是三羧酸循環中產生和轉化其他化合物的重要階段,不斷為機體提供能量。原兒茶酸作為原花青素的次級代謝物,是原花青素在體內發揮生理功能的主要活性物質,具有抗炎、抗氧化和抑菌的作用[34]。L-亮氨酸對肌肉中葡萄糖攝取和脂質代謝起調節作用,防止肌肉收縮[35]。本研究結果提示,日糧中添加蠶豆皮飼喂湖羊后空腸菌群主要富集在碳水化合物代謝、能量代謝和氨基酸代謝等新陳代謝功能,表明腸道菌群對湖羊日糧營養物質代謝活動有促進作用,然而對相關通路中成員的影響程度有待進一步研究。

綜上,本研究表明,日糧添加30%蠶豆皮可降低空腸黏膜炎癥因子IL-1βmRNA表達水平,改變空腸食糜微生物菌群多樣性和相對豐度,調節腸道發酵環境,為蠶豆皮在養羊業中的應用提供參考。