神經營養因子受體Trkb對湖羊垂體細胞增殖及促性腺激素分泌的影響

陳培勇,蔡玉,楊花,徐輝,王鋒,張艷麗

(南京農業大學動物科技學院羊業科學研究所,江蘇 南京 210095)

酪氨酸激酶B受體(tyrosine kinase B receptor,Trkb)是神經營養因子家族的一種高親和力受體。Trkb可以通過與其配體腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)結合,參與促進神經元的生長刺激、增殖和分化以及調節突觸可塑性[1-3]。研究表明,Trkb及Bdnf除了在神經組織內表達外,在包括生殖系統在內的各種非神經組織中也有廣泛表達,并發揮生理調控作用[4-5]。研究發現,Trkb在新生大鼠卵巢中原始卵泡中有表達,該結果提示Trkb可能參與卵泡生長或調節卵泡組裝[6]。Trkb敲除小鼠的顆粒細胞增殖水平降低,卵泡組織明顯丟失,并且伴隨著大量的卵母細胞死亡[7]。這些結果均表明Trkb對卵泡發生和排卵發生的重要性。值得注意的是,在卵巢功能早衰小鼠模型中激活TRKB信號能夠逆轉卵泡損失并恢復卵母細胞數量,提高卵巢功能早衰小鼠的生育能力[8]。除此之外,激活TRKB信號能夠使促性腺激素分泌恢復正常[8]。研究發現,BDNF/TRKB信號系統通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)調控牛顆粒細胞增殖和孕激素合成[9]。此外,研究發現BDNF/TRKB信號系統表達于胎盤內合胞體滋養層和滋養細胞中,并通過增加胎盤滋養層細胞生長和存活促進胎盤發育,進而促進胎兒生長[10-11]。Trkb在雄性生殖中也發揮重要作用,前期有研究發現Trkb參與調控牛精子線粒體活性和精子凋亡,進而影響其生存能力[12]。此外,Trkb的基因多態性分析表明,該基因與綿羊產羔數相關[13]。上述研究結果均表明,Trkb在動物生殖調控中發揮重要作用。目前,關于Trkb功能研究大部分集中于卵巢顆粒細胞發育,在垂體內的調控功能尚不清楚。

垂體是哺乳動物體內重要的內分泌器官,能夠通過響應下丘腦調控各種激素分泌調控應激、生長以及繁殖等各種生理功能,該器官在生殖軸調控中具有重要作用[14-15]。垂體可以通過分泌促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)和促黃體素(luteinizing hormone,LH)2種關鍵促性腺激素直接調控靶性腺發育和生殖活動[16]。在雄性中,FSH能夠與睪丸支持細胞上相應受體結合從而影響精子發生,而LH通過刺激睪丸間質細胞促進雄激素分泌[17-19]。在雌性中,FSH通過刺激顆粒細胞促進卵子發生,而發情中期的LH峰可以觸發排卵[20-21]。最近研究表明,Trkb參與調控綿羊外周血中促性腺激素濃度,推測Trkb可能調控綿羊垂體細胞狀態從而影響促性腺激素分泌[22],但尚未開展進一步的研究。

湖羊以高繁殖力著稱,是國家級綿羊資源保護品種,具有繁殖力高、四季發情、生長發育快等多種優點[23]。探究其垂體機能與調控機制對提高湖羊繁殖力有重要參考意義。據此,試驗探究Trkb組織表達差異,以湖羊垂體細胞為研究對象,探究Trkb對垂體細胞增殖及促性腺激素分泌的影響,旨在為研究Trkb調控湖羊垂體分泌促性腺激素提供重要理論參考。

1 材料與方法

1.1 湖羊不同部位組織采集以及垂體細胞分離

于江蘇省啟東市瑞鵬牧業有限公司選取不同生長階段的母羊：出生(1D)、5日齡(5D)、3月齡(3M)、6月齡(6M)和2歲齡(2Y)湖羊。分別選取不同生長階段的湖羊3只,通過頸靜脈放血方式處死后立即屠宰,采集心、肝、脾、肺、腎、下丘腦、垂體等組織存放于2 mL凍存管中,快速放入液氮中凍存,帶回實驗室,放在-80 ℃超低溫冰箱中保存。此外,采集6M湖羊垂體并用預冷杜氏磷酸緩沖液(DPBS)沖洗3次后置于DMEM/F12(Gibico)培養液中用于垂體細胞分離。

采用Zheng等[24]的方法分離垂體細胞。在超凈臺中用手術鑷剝離垂體組織中薄膜和上皮組織,分別使用1 mg·mL-1的Ⅳ型膠原酶和2.5 g·L-1胰酶(含EDTA)在37 ℃ 條件下依次消化15 min,以去除成纖維細胞并解離組織中垂體細胞。分離出的垂體原代細胞接種于含有10% 胎牛血清和1% 雙抗(青、鏈霉素100 IU·mL-1)的DMEM/F12培養基中,置于37 ℃、5% 二氧化碳培養箱中培養。后續使用腺垂體標記蛋白(FSH和LH)對分離的垂體細胞進行鑒定。

1.2 構建過表達質粒

使用Trkb-CDS引物(表1)進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳純化回收目的產物。使用BamHⅠ和NheⅠ限制性核酸內切酶在37 ℃ 條件下酶切30 min,切膠后純化。將純化產物用T4DNA連接酶連接至pcDNA3.1(+)真核表達質粒,然后轉入大腸桿菌Trans5α 感受態細胞,等待菌落長出。利用載體通用引物T7-bgh對菌液進行PCR擴增及測序,確保插入序列片段正確,然后進行質粒抽提并命名重組質粒為pcDNA-Trkb。

表1 qPCR相應目的基因的引物序列Table 1 qPCR primer sequence of corresponding target gene

1.3 總RNA提取、反轉錄及qPCR

采用Trizol 法(Invitrogen)提取湖羊各組織及垂體細胞的總RNA,按照反轉錄試劑盒(Vazyme)說明書操作合成cDNA。利用NCBI在線網站設計Trkb、卵泡刺激素β亞基(follicle stimulating hormone subunit beta,Fshβ)、促黃體素β亞基(luteinizing hormone beta,Lhβ)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,Pcna)、B細胞淋巴瘤/白血病2(B-cell CLL/lymphoma 2,Bcl2)、BCL2相關X蛋白(BCL2 associated X,Bax)以及肌動蛋白(actin beta,Actb)基因的引物(表1),由擎科生物合成引物。以反轉錄的cDNA為模板,進行熒光定量PCR檢測各目標基因相對表達量。熒光定量檢測體系為20 μL：SYBR Green Master 10 μL,上、下游引物各0.6 μL,cDNA 1 μL,補充ddH2O至20 μL。根據熒光定量試劑盒說明書(全式金)設置反應條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個循環;72 ℃ 10 min。試驗結果利用2-ΔΔCT方法計算各目的基因相對表達量。

1.4 垂體細胞轉染試驗

當6孔板中細胞密度處于50%～70%時,對照組轉染空載質粒pcDNA-3.1,試驗組轉染Trkb質粒：取2.5 μL空載質粒pcDNA-3.1和pcDNA-Trkb質粒,分別與5 μL P3000混合于125 μL Opti-MEM中構成組分1;另取6.5 μL Lipofectamine 3000轉染試劑混合于125 μL Opti-MEM中構成組分2,靜置5 min后將 2組分混勻并靜置10 min。棄去6孔板中原有培養液,用DPBS潤洗1次細胞后,添加上述混合液,最后用含有10% 胎牛血清的培養液補至2 mL。處理48 h后收集細胞總RNA、細胞蛋白及上清液分別用于后續qPCR、蛋白免疫印跡(Western blot,WB)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測。

1.5 ELISA檢測促性腺激素含量

根據綿羊FSH、LH相應的ELISA檢測試劑盒說明書(卡邁舒)檢測轉染48 h后對照組和試驗組細胞上清液中FSH和LH含量。

1.6 Western blot檢測

按照細胞蛋白說明書用RIPA蛋白裂解液提取垂體細胞蛋白,用BCA蛋白濃度檢測試劑盒(Beyotime)測定蛋白濃度。蛋白原液與蛋白變性試劑混合,在70 ℃下煮沸10 min以變性。變性后蛋白在160 V條件下電泳42 min,在120 V條件下轉膜55 min,用50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉2.5 h。在4 ℃條件下孵育一抗過夜(TRKB抗體購自ABcolonal;FSH抗體購自Abcam,LH和PCNA抗體購自AFFinity;BAX、BCL2和ACTB抗體購自Proteintech)。次日,TBST洗滌蛋白條帶5次,每次7 min。使用HRP標記山羊抗兔IgG(Proteintech)室溫孵育2 h。最后用ECL顯影液拍照,使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.7 EdU檢測轉染后垂體細胞增殖

使用EdU細胞增殖試劑盒(Beyotime)檢測垂體細胞增殖率。將垂體細胞接種于24孔板中,待細胞密度達到50%～60%進行轉染,對照組加入空載體,試驗組加入Trkb過表達質粒。在轉染24 h后用EdU工作液孵育2 h,然后按照EdU試劑盒說明書進行操作,最后在激光共聚焦顯微鏡下拍照,使用ImageJ軟件統計并分析細胞增殖情況。

1.8 細胞免疫熒光(IF)檢測

將垂體細胞平鋪至24孔培養板中,待細胞密度達到70%～80% 時用4%多聚甲醛(PFA)在室溫條件下固定10 min,再用DPBS洗滌3次;用Triton X-100通透15 min,DPBS清洗3次后用3 g·L-1胎牛血清在室溫條件固定90 min,分別孵育TRKB和FSH一抗過夜;次日用DPBS洗滌3次后在避光條件下孵育兔二抗1 h,使用共聚焦顯微鏡拍照。

1.9 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 Trkb在湖羊組織中的差異表達分析

組織表達分析結果表明,TrkbmRNA在湖羊心臟、肝、脾、肺、腎、下丘腦、垂體等組織中均有表達,在垂體中具有較高的表達水平,且顯著高于其他組織(P<0.05,圖1-A)。此外,Trkb基因在垂體組織不同發育階段差異表達,其中在6M的垂體組織中高表達,在5D和3M的垂體組織中表達水平較低(P<0.05,圖1-B)。

圖1 Trkb在湖羊不同組織(A)及不同發育階段垂體(B)中的表達水平Fig.1 Expression levels of Trkb in different tissues(A)and pituitary at different developmental stages(B)of Hu sheep1)1D：1日齡1-day-old;5D：5日齡5-day-old;3M：3月齡3-month-old;6M：6月齡6-month-old;2Y：2周歲2-year-old.2)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different small letters indicate significant difference(P<0.05).

2.2 垂體細胞鑒定和TRKB表達

將分離得到的湖羊原代垂體細胞培養于培養皿中,在顯微鏡下觀察發現細胞形態呈梭形(圖2-A)。利用細胞免疫熒光技術對體外分離的湖羊原代垂體細胞進行鑒定,結果顯示垂體標記蛋白FSH在大多數細胞中均有表達(圖2-B)。目的蛋白TRKB在垂體細胞中也有表達,并主要表達在細胞質中(圖2-C)。

圖2 免疫熒光鑒定湖羊垂體細胞及TRKB表達定位Fig.2 Identification of pituitary cells by immunofluorescence stain and TRKB expression location of Hu sheep A.顯微鏡下垂體細胞形態Morphology of Hu sheep pituitary cells under microscope;B. FSH熒光染色FSH fluorescence staining;C. TRKB熒光染色TRKB fluorescence staining.4×、10×和20×分別代表4倍、10倍和20倍物鏡倍數;Hoechst表示細胞核染色(藍色)。4×,10× and 20× represent 4,10 and 20 objective multiples,respectively;Hoechst means staining the nucleus with blue.

2.3 Trkb過表達載體構建及過表達效率驗證

如圖3所示：對湖羊Trkb基因構建的過表達質粒(pcDNA3.1-Trkb)進行鑒定,瓊脂糖凝膠電泳結果表明該質粒序列大小為2 526 bp(圖3-A)。對質粒進行測序,結果與GenBank中綿羊Trkb基因CDS序列相一致(圖3-B)。上述結果說明成功構建了湖羊Trkb基因的過表達載體pcDNA-Trkb。

圖3 pcDNA-Trkb載體構建與過表達效率驗證Fig.3 Construction of pcDNA-Trkb vector and verification of overexpression efficiency A. 限制性內切酶消化pcDNA-Trkb后的電泳圖譜Electrophoretic map of pcDNA-Trkb after digestion by restriction endonuclease;B. BamHⅠ、NheⅠ、Trkb CDS啟動子和終止子區域的序列Sequence at BamHⅠ,NheⅠ,Trkb CDS start and stop region;C、D. 轉染pcDNA-Trkb質粒后Trkb mRNA和TRKB蛋白水平的表達Expression of Trkb mRNA and TRKB protein level after transfection of pcDNA-Trkb plasmid. *P<0.05, **P<0.01. The same as follows.

對湖羊垂體細胞進行Trkb過表達質粒轉染試驗,在轉染48 h后檢測Trkb的mRNA和蛋白表達情況。圖3-C、D結果表明：與對照組相比,轉染Trkb過表達質粒后,垂體細胞中Trkb的mRNA和蛋白水平表達量均顯著提高(P<0.05)。

2.4 過表達Trkb對湖羊垂體細胞增殖的影響

如圖4所示：與對照組相比,過表達Trkb極顯著提高了垂體細胞中PcnamRNA的表達水平(P<0.01,圖4-A)。Western blot 檢測結果表明,過表達Trkb極顯著提高垂體細胞中PCNA蛋白表達量(P<0.01,圖4-B、C)。EdU試驗結果表明,過表達Trkb基因極顯著提高了垂體細胞EdU陽性率(P<0.01,圖4-D、E)。上述結果表明,過表達Trkb可促進垂體細胞增殖。

圖4 過表達Trkb對湖羊垂體細胞增殖的影響Fig.4 Effect of overexpression of Trkb on proliferation of Hu sheep pituitary cell A. 增殖標記基因Pcna mRNA相對表達量Relative expression level of proliferative marker gene Pcna;B、C. Western blot檢測增殖標記蛋白PCNA的表達量Relative expression level of proliferation marker protein PCNA detected by Western blot;D、E. EdU檢測垂體細胞增殖效率(藍色是細胞核,紅色是EdU陽性細胞,標尺為100 μm)EdU is used to detect the proliferative efficiency of pituitary cells(The blue is the nucleus and the red is EdU-positive cells. The scale is 100 μm.).

2.5 過表達Trkb對湖羊垂體細胞凋亡的影響

如圖5所示：與對照相比,過表達Trkb顯著增加了Bcl2在轉錄水平的表達量(P<0.01),并且顯著提高了Bcl2/Bax比值(P<0.01,圖5-A)。在蛋白水平上,Western blot試驗結果表明,過表達Trkb極顯著提高了BCL2的蛋白相對表達含量(P<0.01,圖5-B)。過表達Trkb組細胞中BCL2/BAX蛋白相對表達水平的比值極顯著高于對照組(P<0.01)。上述結果表明過表達Trkb可抑制垂體細胞凋亡。

圖5 過表達Trkb對湖羊垂體細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of overexpression of Trkb on cell apoptosis of Hu sheep pituitary cell A. 細胞凋亡相關基因Bax與Bcl2相對表達水平Relative expression levels of apoptosis-related gene Bax and Bcl2;B. Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白BAX與BCL2表達Expression of apoptosis related protein BAX and BCL2 detected by Western blot.

2.6 過表達Trkb對湖羊垂體細胞促性腺激素分泌的影響

由圖6-A可見：與對照組相比,轉染Trkb過表達質粒極顯著提高了Fshβ和Lhβ的mRNA表達水平(P<0.01)。ELISA檢測結果表明,過表達Trkb后培養液中FSH含量極顯著提高(P<0.01),促進垂體細胞分泌FSH,但是對垂體細胞分泌LH沒有顯著影響(圖6-B)。上述結果表明過表達Trkb可刺激湖羊垂體細胞促性腺激素FSH的分泌。

圖6 過表達Trkb對湖羊垂體細胞促性腺激素分泌的影響Fig.6 Effect of overexpression of Trkb on gonadotropin secretion of Hu sheep pituitary cells A.促性腺激素相關基因Fshβ和Lhβ相對表達量Relative expression levels of gonadotropin-related genes Fshβ and Lhβ;B. ELISA檢測促性腺激素FSH和LH分泌水平The secretion levels of gonadotropin FSH and LH detected by ELISA.

3 討論

湖羊是我國著名的高繁殖率綿羊品種,是研究繁殖育種與肉羊多胎機制的理想對象。垂體作為下丘腦-垂體-性腺軸的中樞器官,能夠感受下丘腦狀態調控各種激素分泌并作用于下游靶腺,從而發揮調控機體生長、繁殖以及新陳代謝等生理功能[14]。因此,發掘湖羊垂體功能調控基因,探索湖羊垂體功能調控機制具有重要作用。目前,湖羊垂體功能基因的相關研究多集中于BMP家族及TGFβ信號通路。本課題組前期測序結果表明,Trkb基因在高繁殖力湖羊垂體中高度表達。本研究發現Trkb基因在湖羊不同組織中差異表達,在湖羊各組織中均有表達并且在垂體中高表達。此外,Trkb在不同日齡階段的湖羊垂體中差異表達。這些結果提示,Trkb基因在湖羊垂體功能調控中發揮重要作用。因此,本試驗以Trkb基因為研究對象,探究其潛在的調控功能,為探索湖羊垂體功能的調控機制提供理論支撐。

研究表明,Trkb能夠與上游特異性配體結合并磷酸化胞內酪氨酸殘基,進而激活下游信號通路,改變基因表達,最終影響細胞增殖、分化等生理功能[25]。前期在牛顆粒細胞中的研究表明,Trkb能夠介導BDNF激活下游PI3K/AKT通路,促進牛顆粒細胞增殖和細胞活性[9]。此外,有研究表明Trkb能夠與其高親和力配體BDNF結合激活ERK通路促進子宮內膜Ishikawa細胞增殖[26]。另有研究報道,Trkb抑制劑K252能夠阻斷BDNF促進著床前胚胎由二細胞向囊胚階段發育進程,降低細胞增殖,促進凋亡[27]。此外,研究發現激活BDNF/TRKB信號系統能夠引起MAPK和PI3K信號級聯,抑制內質網應激,從而誘導豬子宮內膜上皮細胞的增殖,抑制其凋亡[28]。上述研究結果均表明Trkb能夠作為細胞信號通路關鍵環節調控生殖細胞增殖。本試驗中,在湖羊垂體細胞中過表達Trkb基因后,湖羊垂體細胞增殖能力顯著提高,并且細胞增殖標記基因Pcna在轉錄和蛋白水平表達量上調。此外,我們觀察到過表達Trkb在轉錄和蛋白水平提高了BCL2蛋白表達水平以及BCL2/BAX比值,表明Trkb對湖羊垂體細胞具有抗凋亡的作用。

過表達Trkb對垂體細胞增殖的積極影響可能影響垂體細胞促性腺激素分泌水平,本研究進一步檢測了過表達Trkb對促性腺激素分泌的影響。FSH和LH是由垂體前葉分泌的促性腺激素,能夠直接作用于下游靶腺來影響類固醇激素分泌,在哺乳動物的生殖發育中起著至關重要的作用。對牛卵丘-卵母細胞復合物的研究結果表明,FSH能夠促進COC中合成孕激素和雌激素。FSH在促性腺激素中的濃度比例可能會影響機體性器官發育[29]。此外,當FSH含量比例高于LH時,會導致卵巢發育受限[30]。調節促性腺激素分泌的網絡機制是十分復雜的。一方面,垂體接收下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素的刺激,調控FSH和LH分泌并作用于下游靶腺;另一方面,性腺分泌的性激素又負反饋作用于垂體,進而影響FSH和LH分泌。此外,某些營養因子和非編碼RNA也能作用于垂體調控促性腺激素分泌。在綿羊垂體的研究表明,連續3 d 腦室注射BDNF能夠顯著提高綿羊外周血中FSH濃度,這表明BDNF/TRKB可能參與調控綿羊垂體促性激素的合成與釋放[22]。本試驗中,體外過表達Trkb提高了垂體細胞中促性腺激素相關基因表達,這與上述研究結果相似。ELISA結果顯示過表達Trkb顯著提高FSH分泌水平,這進一步證實Trkb密切參與促性腺激素合成與分泌。

綜上,本研究以湖羊垂體細胞為研究對象,通過體外過表達Trkb,初步驗證Trkb可通過影響細胞增殖和凋亡來調節湖羊垂體細胞促性腺激素的分泌,這為深入探究Trkb調控垂體功能的分子機制提供了理論基礎。

致謝：江蘇省羊業科學研究所的全體師生在本試驗樣品采集、技術支持以及論文寫作等方面給予指導與幫助,以致謝意。