電針“天樞”與“天樞”配伍“上巨虛”對腸易激綜合征大鼠行為學和結腸功能的影響*

劉婷婷,張擎宇,趙香順,石運來,于燕南,王正文,陳少宗△,楊添淞,5,6△

(1.黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 150040;2.濟南醫院,濟南 250013;3.山東中醫藥大學針灸推拿學院,濟南 250355;4.山東中醫藥大學針灸研究院,濟南 250355;5.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,哈爾濱 150040;6.黑龍江省中醫藥信息學重點實驗室,哈爾濱 150040)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是臨床常見慢性胃腸道功能紊亂疾病,發病病因可能與胃腸道功能異常、精神心理刺激等有關[1]。臨床癥狀主要表現為腹痛、腹部不適、大便性狀以及排便習慣改變等腸道癥狀,并伴有心悸、抑郁、焦慮等腸外表現和精神癥狀[2-3]。IBS發病率呈逐年上升趨勢且病程纏綿難愈[4],病因及發病機制尚未完全闡明,目前現代醫學根據主要癥狀進行藥物干預治療,但治療效果不佳[5-6]。近年來,越來越多的臨床研究表明,針灸治療IBS療效顯著[7],并且優于常規藥物[8]。根據課題組前期經驗和結果,本實驗運用急慢性應激聯合方法制備IBS動物模型,以高架十字迷宮、結腸痛敏閾值、血清5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、結腸5-羥色胺4受體(5-hydroxytryptamine 4 receptor,5-HT4R)蛋白表達為指標,初步探討電針“天樞”配伍“上巨虛”對IBS大鼠模型行為學和結腸功能調節的影響是否具有協同或疊加效應。本實驗獲得實驗動物福利倫理審查委員會的批準,批件編號:SDUTCM20200620001。

1 材料

1.1 動物

選用體質量(200±20)g的雄性清潔級Wistar大鼠,購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物許可證號:SCXK(魯)20190003。所有大鼠于山東中醫藥大學實驗中心飼養,保持室內安靜,12 h/12 h晝夜節律循環,水和食物均可自由攝取。

1.2 主要試劑

蛋白預制膠(貨號:Gel41212),南京艾思易生物科技有限公司;兔抗GAPDH單克隆抗體(貨號:10494-1-AP),美國Proteintech公司;5-HT4R多克隆抗體(貨號:ab60359),英國Abcam公司;山羊抗兔二抗(貨號:SA00001-2),美國Proteintech公司;5-HT 試劑盒(貨號:JYM0326Ra),武漢基因美生物科技有限公司。

1.3 主要器材

華佗牌針灸針,0.25 mm×13 mm型,蘇州醫療用品廠有限公司;華佗牌電針儀,SDZ-Ⅱ型,蘇州醫療用品廠有限公司;冷凍型高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司;Eppendorf5425型高速離心機,山東奧恒生物科技有限公司;Multiskan FC型全自動酶標儀,美國Thermofisher公司;Fusion solos S系列化學發光成像系統,德國VILBER LOURMAT公司;伯樂PowerPac Basi型電泳儀,美國Bio-Rad公司;XR-XG201型高架十字迷宮,上海欣軟信息科技有限公司;30系列Powerlab實驗數據采集分析系統,澳大利亞AD Instruments公司。

2 方法

2.1 模型制備

實驗按照隨機原則,將大鼠分為空白組(10只)和造模組(45只),造模組大鼠采用慢性應激和急性應激聯合法制備IBS模型。參照文獻方法[9-10],將大鼠暴露于不同的應激因素:①斷食24 h、②晝夜顛倒12 h、③斷水24 h、④夾尾5 min、⑤冰水游泳5 min、⑥鼠籠45°傾斜、⑦慢性避水應激1 h,連續干預造模10 d。

2.2 模型評價及分組

造模10 d結束后,運用腹壁撤回反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)半定量評分對造模組大鼠進行模型評價[11-12]。將自制的球囊經導管置入大鼠直腸,深度大約6～7 cm;導管另一端用三通管分別連接血壓計和注射器,待大鼠情緒穩定后,進行結直腸擴張刺激和AWR評分。通過注射器緩慢向氣囊注入空氣,當血壓計顯示為40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)時停止注入空氣,觀察大鼠行為反應情況。AWR評分標準[13]:對結腸擴張刺激無行為反應,評為0分;給予刺激大鼠有動作停頓后并見短暫的頭部運動行為,評為1分;刺激期間見有腹部肌肉的收縮,評為2分;如有腹部抬起行為,評為3分;身體拱起,并抬起盆腔和陰囊者,評為4分。AWR半定量評分大于等于3分,即判定大鼠造模成功。經過AWR評估其造模成功率可達到55%,將確定制備成功的大鼠隨機分為模型組(8只)、天樞組(8只)、天樞配伍上巨虛組(8只)。

2.3 電針干預

穴位定位參考《實驗針灸學實驗指導》:“天樞”位于神闕穴(劍突與恥骨聯合的上2/3與下1/3交點處)旁開 5 mm 處;“上巨虛”位于膝關節后外側,腓骨小頭下約10 mm處[14]。

按照針刺穴位需求的體位(仰臥位)將電針組大鼠固定在自制平臺上,選用0.25 mm×13 mm針灸針分別對“天樞”“上巨虛”進行針刺,深度分別為3 mm和5 mm,電針參數設置為2 Hz、1 mA,連續波,1次/d,20 min/次,針刺14 d?？瞻捉M大鼠正常喂養,不做任何處理,模型組大鼠僅每天與電針組大鼠使用相同方法進行抓取-捆綁,但不給予電針干預。

2.4 高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)實驗

每只Wistar大鼠需要進行3次行為學的檢測,即造模前、造模10 d后、14 d電針干預治療后。實驗開始前,減少抓握帶來的應激對實驗結果產生影響,抓握大鼠實驗人員對大鼠撫摸2～3 min,實驗開始時,一名實驗人員放置好大鼠后迅速遠離,大鼠進入高架十字迷宮的同時,另一名實驗人員觀察視頻,記錄5 min內大鼠在高架十字迷宮內進入開臂(open arm entry,OE)次數和開臂時間(open arm time,OT),進入閉臂(close arm entry,CE)次數和時間(close arm time,CT)。

依據上述指標并參照相關文獻[15],計算開臂進入次數百分比[OE%=OE/(OE+CE)×100%]和開臂停留時間百分比[OT%=OT/(OT+CT)×100%],OE%<20%、OT<25%即判定為大鼠焦慮狀態。

2.5 結直腸痛敏閾值測定

第3次行為學實驗檢測后,對各組大鼠進行結直腸痛敏閾值的檢測。此實驗開始前,所有大鼠禁食不禁水,以此減少大便的形成。待大鼠腹腔注射麻醉后將其取仰臥位,暴露腹直肌,兩根電極絲植入到距腹正中線1.5 cm處;再將自制氣囊經大鼠肛門插入6～7 cm處;給氣囊緩慢注氣后,通過置于腹直肌的兩根電極引出肌電信號。運用Powerlab數據采集分析系統,觀察并記錄兩組大鼠在不同擴張壓力下腹直肌放電活動。

結直腸痛敏測定[16]:設定結直腸擴張時, 腹直肌放電超過基礎放電的10%為有顯著反應, 放電明顯增加時的結直腸擴張最小壓力值即為結直腸痛敏值。

2.6 處死與取材

待大鼠腹外斜肌放電測定后,迅速剪開大鼠胸腔,抽取血液后靜置進行離心,-80 ℃冰箱保存備用。待大鼠取血在室溫靜置過程中,0.9%氯化鈉溶液進行灌注,直至大鼠四肢發白,取出結腸并沖凈腸容物,-80 ℃冰箱中保存備用。

2.7 ELISA檢測血清5-HT含量

測定前使血清樣本置于室溫中復溶并平衡15～30 min后方可進行實驗,每組選取6個血清樣本,具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.8 Western blot檢測結腸組織5-HT4R蛋白表達

采用免疫蛋白印跡法檢測各組樣本的蛋白表達,每組選取4個結腸組織樣本,將各組蛋白上樣,電泳60 min,轉膜70 min,5%奶粉封閉2 h,清洗3次×10 min,孵育5-HT4R(稀釋濃度1∶800)一抗,4 ℃過夜;清洗3次×10 min,孵育二抗(稀釋濃度1∶10 000),室溫2 h,洗凈未結合二抗。ECL試劑盒顯影,用凝膠成像系統自動曝光顯影。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠EPM測試行為變化比較

與空白組比較,模型組大鼠開臂進入次數百分比(OE%)和開臂停留時間百分比(OT%)明顯降低(OE%<20%,OT%<20%,P<0.01),大鼠活動減少,對新環境好奇度降低,出現焦慮癥狀。與模型組比較,電針天樞組、天樞+上巨虛組大鼠進入開臂時間和次數升高(P<0.01),大鼠焦慮行為明顯得到改善。兩電針組比較,差異無統計學意義。見圖1、圖2。

注:橫向黑框表示大鼠進入閉臂軌跡;縱向紅框表示大鼠進入開臂軌跡圖1 各組大鼠高架十字迷宮軌跡圖

3.2 各組大鼠結直腸痛敏閾值比較

與空白組比較,模型組大鼠的結腸疼痛閾值(mmHg)明顯降低(P<0.01);與模型組比較,天樞組、天樞+上巨虛組大鼠結腸疼痛閾值均明顯升高(P<0.01);兩電針組比較,差異無統計學意義。見圖3。

3.3 各組大鼠血清5-HT含量以及結腸5-HT4R蛋白表達比較

與空白組比較,模型組大鼠血清5-HT含量以及結腸5-HT4R蛋白表達含量分別升高和降低(P<0.05);與模型組比較,天樞組、天樞+上巨虛組大鼠血清5-HT的含量和結腸5-HT4R蛋白含量均得到恢復(P<0.05);兩電針組比較,差異無統計學意義。見圖4、圖5。

注:與空白組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;5-羥色胺(5-HT)圖4 各組大鼠血清5-HT含量測定(n=6)

注:與空白組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;5-羥色胺4受體(5-HT4R)圖5 各組大鼠結腸5-HT4R蛋白免疫印跡圖及蛋白含量比較(n=4)

4 討論

根據臨床癥狀,中醫學將IBS歸屬于“泄瀉”“便秘”“郁證”等范疇;《靈樞·邪氣藏府病形》曰“飧泄,大腸痛,巨虛上廉主之”;《針灸大全》云“腹中寒痛,泄瀉不止,里急后重,天樞二穴”。天樞穴(ST25)與上巨虛穴(ST37)分別是大腸募穴和下合穴,是臨床治腸易激綜合征的重要選穴以及臨床治療腸腑疾病的經典合募配穴[17-18]?，F代醫學依據神經節段分析,腸道平滑肌活動是受交感神經(T10～L3)和副交感神經(S2～4)的雙重支配[17,19-20],支配天樞穴的神經節段在T9～11,上巨虛穴神經支配主要來源于T12～L2神經節段[21],天樞穴和上巨虛穴神經支配與胃腸道的神經支配在脊髓水平有高度重疊性,因此,針灸“天樞”“上巨虛”可將刺激引起的信號投射到支配相應神經節段,實現調理結腸功能的作用。

目前越來越多的臨床研究雖顯示針灸對IBS身心同調的治療效果[22-23],但多種因素同時影響針灸干預治療IBS臨床療效,在多種影響療效因素中腧穴配伍是關鍵共性因素之一。課題組前期研究結果顯示,單獨電針“天樞”對IBS模型大鼠的結腸功能有積極調節作用[24],但關于電針“天樞”配伍“上巨虛”是否有協同或疊加效應的研究較少。

本實驗通過急慢性應激聯合制備IBS 模型大鼠,利用高架十字迷宮檢測IBS大鼠情緒及行為學,腹直肌肌電測定內臟痛敏閾值,ELISA檢測血清中5-HT含量以及Western blot法檢測結腸組織中5-HT4R蛋白表達,初步探討電針“天樞”配伍“上巨虛”是否有協同或疊加效應。高架十字迷宮是國際公認的用來測試動物焦慮行為的首選裝置[25],用于評估動物行為和心理情緒的實驗方法。其原理是利用動物對新環境探究的特性以及嗜暗的天性,當大鼠處在開臂時,相當于人類站在懸崖邊上會產生恐懼心理狀態[26],同時出于好奇而探究開臂,但又因恐懼心理或者嗜暗本能待在閉臂中,這種相沖突的心理狀態造成“探究-回避”行為,大鼠進入開臂次數和開臂時間百分比則反映大鼠焦慮情緒[27]。目前認為IBS病理和生理過程包括腸道分泌、感覺以及動力異常,臨床研究發現,IBS患者腸道功能紊亂與5-HT異常有關[28]。5-HT,又名血清素,是一種腦腸肽神經遞質,大部分的5-HT產生并貯存于腸嗜鉻細胞 (enterochromaffin cell,EC)中,少部分在中樞神經系統合成,EC釋放的5-HT既可通過刺激腸肌間神經叢或黏膜下層的不同受體(5-HT3、5-HT4)調節胃腸道的蠕動和分泌,影響胃腸動力和增加內臟敏感性[29],同時參與中樞神經系統中對精神情志的調控[30-32]。5-HT4R蛋白通過刺激神經末梢使運動神經元釋放乙酰膽堿以及其他神經遞質,從而影響結腸感覺和運動功能[31],形成一系列排便異常、腹部不適等IBS臨床癥狀。

各組大鼠高架十字迷宮實驗結果顯示:與空白組相比,模型組大鼠OE%和OT%明顯減少,與模型組相比,兩電針組OE%和OT%升高,說明電針可緩解IBS大鼠模型焦慮的情緒心理行為,與臨床和基礎究結果相一致[32-33]。腹直肌肌電檢測結腸痛敏閾值的結果、血清5-HT含量、5-HT4R蛋白表達實驗結果顯示:與模型組比較,電針“天樞”與“天樞”配伍“上巨虛”均能提升大鼠內臟痛敏閾值,減少血清5-HT含量,增加5-HT4R蛋白含量表達,說明電針可調節IBS大鼠結腸功能紊亂癥狀,與同類研究的結果相一致[34-35]。但以上實驗結果還顯示,與電針“天樞”相比,電針“天樞”配伍“上巨虛”并未顯示腧穴配伍優勢,差異無統計學意義。

綜上所述,電針“天樞”與“天樞”配伍“上巨虛”對IBS模型大鼠行為學以及結腸功能異常癥狀均有調節作用,但電針“天樞”配伍“上巨虛”未表現明顯治療優勢,因而就本實驗結果而言從側面顯示出電針對IBS模型大鼠精神心理行為以及結腸功能的調節作用與腧穴數量多少無關。產生此結果的原因可能是由于IBS病因病機涉及眾多的病理和生理環節,而本實驗只是觀察電針“天樞”與“天樞”配伍“上巨虛”對IBS模型大鼠精神心理行為、血清5-HT以及結腸5-HT4R蛋白含量等指標的影響,并未涉及其他的發病機制中相關指標的研究。除此之外,由于針刺的效應機制涉及多個途徑和作用靶點[36],“天樞”配伍“上巨虛”可能通過各自不同的作用靶點產生疊加效應。因此,穴位之間的協同或疊加效應不是腧穴之間簡單相加[37],腧穴配伍協同作用或者腧穴組方規律有待進一步研究。