基于氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料的無酶型電化學免疫傳感器的構建及應用

趙麗芳,于曉菲,滕龍,齊云,劉鵬飛,侯斌,張娟*

(1.山東省產品質量檢驗研究院,山東 濟南 250100; 2.山東省環科院環境工程有限公司,山東 濟南 250109;3.濱州市檢驗檢測中心,山東 濱州 256600)

對腫瘤標志物的高靈敏度、高準確度的檢測是目前癌癥診斷的重要課題。該領域采用各種技術和檢測方法來實現腫瘤標志物的快速、靈敏、準確的檢測,包括酶聯免疫吸附試驗法、表面等離子體共振法、石英晶體微平衡法、各種發光和熒光技術等。然而,這些技術和方法通常需要復雜的樣品處理過程,耗時長,不能滿足日益增長的快速檢測的需求。因此,亟需開發一個簡單、可靠的技術和方法。這一需求在超低濃度的生物標志物檢測方面尤為明顯,如甲胎蛋白的檢測。

免疫傳感器以抗原或抗體作為敏感元件,能夠實現傳感與換能的同步進行,可以達到定量的監測,也能夠實現對傳感器界面反應的實時監測。免疫傳感器的結構與其他生物傳感器相類似,主要是由接收器、轉換器和電子放大器三部分組成的[1]。免疫傳感器的敏感元件是抗原、抗體,將抗原或抗體固定在載體表面用以構建敏感膜,即傳感器的敏感膜[2]?？乖c抗體在敏感膜上特異性結合產生信號,這些信號被傳送到轉換器。通過轉換器的轉化將接收到的信號轉化為電信號,同時進行信號的放大和數字化[3]。免疫傳感器是可以將輸出結果數字化的精密換能器,它在達到定量檢測的同時,也能夠實現傳感器表面抗原-抗體反應的實時監測,這對免疫反應動力學分析是非常有利的[4]。

電化學免疫傳感器則是指由抗原或抗體為敏感元件,電極作為轉換元件,以電勢或電流為特征檢測信號的傳感器[5]。目前大量的電化學免疫傳感已應用在生物技術、食品工業、臨床檢測、醫藥工業、生物醫學、環境分析等領域[6-10]。

為了構建免疫傳感器,酶通常被固定在電極表面,作為催化活性位點以產生信號,在使用免疫傳感器時,必須考慮到酶的實際穩定性和復雜的預處理過程。而酶的穩定性受環境影響較大,因此無酶型免疫傳感器越來越受到人們的關注。

本文構建了一種新的電化學免疫傳感器,能夠無酶檢測甲胎蛋白(AFP)。利用金@鉑納米粒子和氨基化石墨烯的作用替代傳統的過氧化氫酶,進行無酶檢測。本方案中,以氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子修飾電極表面,氨基化石墨烯具有良好的導電性和電催化活性,能夠促進材料與電極間的電子轉移,改善電極的性能;金@鉑納米粒子對過氧化氫具有高催化性能,可以實現對甲胎蛋白(AFP)的快速檢測。本研究的目的是證明利用這種新穎、簡單的設計,可以開發出無酶、快速、可靠的電化學免疫傳感器。

1 試驗部分

1.1 試劑和儀器

氯金酸(HAuCl4)、氯鉑酸(H2PtCl6),均購于國藥集團化學試劑(北京)有限公司。石墨粉于飛世爾科學公司購買。其他化學試劑均為分析純或更高質量等級,均購于國藥集團化學試劑(北京)有限公司。

所有電化學測量均在CHI760D電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)上進行。透射電鏡(TEM)由H-800透射掃描電鏡(日本)獲得。

1.2 氨基化石墨烯的合成

該方法采用Hummers法[11]制備氧化石墨烯(GO),然后用三聚氰胺對氧化石墨烯進行還原處理[12]。

將0.6 g的石墨粉和3.6 g高錳酸鉀混合,放入帶有磁子的500 mL的三口瓶中,將360 mL∶40 mL(9∶1,體積比)濃硫酸和磷酸的混合液加入以上三口瓶中,冷卻至30～40 ℃,將三口瓶放入油浴,加熱到50 ℃,反應12 h。反應結束,將樣品倒入到40 mL的冰上,將磁子放入冰水混合物上,加入300 μL的過氧化氫,磁力攪拌0.5 h。反應結束后,得到的混合物在8 000 r·min-1的轉速下離心0.5 h,然后分別用30 mL 0.2 mol·L-1的鹽酸、乙醇分別離心洗滌三次,棄去上清液。最后用乙醚離心洗滌,干燥24 h,制得棕黃色固體粉末為氧化石墨烯。

稱取0.15 g氧化石墨烯,加水50 mL,超聲20 min得到均勻氧化石墨烯水溶液(3 mg/mL),將25 mg三聚氰胺加入至水溶液中,60 ℃油浴,攪拌反應1 h。反應結束將反應液轉移至聚四氟乙烯反應釜中,200 ℃反應5 h。將反應釜冷卻至室溫,離心洗滌黑色反應物三次。在氬氣氛圍中850 ℃煅燒3 h,制得氨基化石墨烯納米材料。

1.3 金@鉑納米粒子的制備

將1 mL 10 mg/mL PVA溶液與190 mL 0.25 mmol/L HAuCl4溶液混合,劇烈攪拌2 h后,滴加11 mL 0.1 mol/L新配制得檸檬酸三鈉溶液,攪拌反應2 h,生成金膠體[13]。

將1.5 mL 20 mmol/L H2PtCl6逐滴加入到制得的金膠體溶液中,并攪拌。將10 mmol/L的抗壞血酸溶液在4 ℃條件下緩慢加入上述溶液中,混合物的顏色在幾分鐘內會變成黑色。加入抗壞血酸溶液后,連續攪拌30 min。將得到的溶液離心并用水洗滌三次[14]。將制備的金@鉑納米粒子分散至10 mL超純水中,超聲30 min,備用。

1.4 氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料的制備

稱取3.6 mg制備的氨基化石墨烯,溶于5 mL超純水中超聲60 min后,加入2 mL金@鉑納米粒子溶液,振蕩3 h,使氨基化石墨烯表面固載金@鉑納米粒子,將得到的溶液離心并用水洗滌三次。最后將氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料分散至2 mL超純水中,超聲30 min,備用。

1.5 電化學免疫傳感器的制備

用Al2O3粉末拋光直徑為4 mm玻碳電極,用超純水沖洗干凈電極表面。將6 μL氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料溶液滴涂在電極表面,在4 ℃條件下晾干。然后依次在電極上滴加甲胎蛋白抗體(Ab1)溶液、牛血清白蛋白(BSA)溶液、甲胎蛋白抗原(Ag)溶液,孵化4 h,并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈,即制得一種用于甲胎蛋白檢測的無酶型電化學免疫傳感器。

1.6 腫瘤標志物甲胎蛋白的測定

使用的電化學工作站為三電極體系,即參比電極、對電極和工作電極。在電解池中加入10 mL的磷酸鹽緩沖溶液(含H2O25 mmol/L),采循環伏安法或差分脈沖法測定。

設定電位范圍為-0.2～0.6 V,采用差分脈沖法測定工作電極對不同濃度的甲胎蛋白的電流響應;根據所得電流響應與甲胎蛋白溶液濃度的關系,繪制工作曲線。

2 結果與討論

2.1 材料的表征

圖1氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料的透射電鏡圖像,顯示制備的氨基化石墨烯片為單層薄片狀,表面有大量的褶皺,使其比表面積增大;金@鉑納米粒子直徑約為10 nm,尺寸均勻,且均勻地分散在氨基化石墨烯表面。

圖1 氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料的透射電鏡圖

2.2 電化學免疫傳感器條件的優化

在該無酶型電化學免疫傳感器的構建和工作過程中,為了測試構建的無酶型電化學免疫傳感器的性能,對傳感器的實驗條件進行優化。對于催化過程,緩沖溶液的pH值和基底材料氨基化石墨烯的濃度對檢測結果都有很大的影響,其實驗結果如圖2所示。圖2(A)中曲線表示的是在不同pH值條件下,構建的無酶型電化學免疫傳感器對同一濃度的甲胎蛋白測定的結果,顯示7.0為最優pH值條件;圖2(B)為使用不同濃度氨基化石墨烯構建的無酶型電化學免疫傳感器對同一濃度的甲胎蛋白測定的結果,氨基化石墨烯溶液質量濃度為1.8 mg/mL時,反應最為靈敏。當氨基化石墨烯濃度過低時,電子傳輸能力不夠,同時金@鉑納米粒子負載量少,導致催化性能低,電信號放大效應不明顯;氨基化石墨烯濃度過高時,在電極表面構成的導電膜過厚,阻礙電子傳遞,導致信號降低。

圖2 (A)緩沖溶液pH值和(B)氨基化石墨烯溶液濃度對檢測結果的影響

2.3 電化學免疫傳感器的電化學表征

為了驗證電化學免疫傳感器的構建過程,使用循環伏安曲線對構建傳感器過程中電極的界面結構信息進行表征,進一步說明修飾過程。圖3為把不同材料滴加在玻碳電極上進行免疫傳感器構建,測定各修飾過程的循環伏安曲線圖,所用電解液為pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液(含H2O25 mmol/L)的溶液。

(a)氨基化石墨烯;(b)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料;(c)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料+Ab1;(d)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料+Ab1+BSA;(e)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料+Ab1+BSA+Ag。

從圖中各曲線可以看出,隨著電極表面的層層修飾,H2O2的氧化還原電流值相應發生變化。圖中a曲線表示的是裸玻碳電極的循環伏安曲線。圖中b曲線為修飾上一層氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料的循環伏安曲線,由于氨基化石墨烯具有良好的電子傳遞能力,金@鉑納米粒子對H2O2具有較強的催化性能,因此氧化還原峰值電流增大。圖中c曲線為修飾上一層Ab1以后的循環伏安曲線,氧化還原峰值電流較b曲線減小,原因是抗體不具有電化學活性,在一定程度上阻礙了電子的傳遞。接著,在已經修飾的電極表面加入BSA,封閉電極上的非特異性結合位點,圖中d曲線氧化還原峰值電流值明顯減小。當將甲胎蛋白抗原(AFP)固定到電極表面后的氧化還原峰值電流值(e曲線)進一步減小,這說明蛋白類阻礙電子的傳遞,也進一步驗證了該傳感器構建成功。

2.4 甲胎蛋白的電化學免疫分

在最佳條件下,隨著甲胎蛋白(AFP)濃度的增加,催化電流值減小,由電流值對AFP的濃度作圖,發現AFP質量濃度在0.000 1～10 pg·mL-1范圍內都能呈現出良好的線性關系(圖4),檢出限為0.000 03 pg·mL-1(S/N=3),相關數據列于表1。

表1 工作曲線數據

圖4 (A)不同濃度甲胎蛋白的檢測曲線圖和(B)電化學免疫傳感器的工作標準曲線

2.5 甲胎蛋白電化學免疫傳感器的重現性

利用無酶型電化學免疫傳感器對質量濃度0.001 pg·mL的AFP進行測試,平行做5個相同濃度的同時檢測,研究了構建的無酶型電化學免疫傳感器的重現性(圖5)。對所得數據進行計算,通過計算得到5次平行測定的相對標準偏差為3.6%,在5%以內,說明該傳感器具有良好的重現性。

圖5 無酶型電化學免疫傳感器的重現性研究

3 結論

以氨基化石墨烯作為電極基底材料,金@鉑納米粒子替代傳統的過氧化氫酶為催化因子,利用抗原-抗體的特異性免疫反應構建了無酶型電化學免疫傳感器,并對其性能進行了詳細研究。選用常見腫瘤標志物甲胎蛋白的模型,驗證了構建的無酶型電化學免疫傳感器的應用性能。該傳感器具有對甲胎蛋白響應迅速、檢測限較低、靈敏度高、重現性好等優點,為設計其他腫瘤標志物的無酶檢測提供了一種思路。