6種武陵醬香型白酒中揮發性含硫化合物差異分析

李 行, 吳李玲, 裴榮紅, 朱 琳, 鄭福平,*,孫金沅, 李 凡, 李 義, 孫寶國

(1.北京工商大學 食品質量與安全北京實驗室/中國輕工業釀酒分子工程重點實驗室, 北京 100048;2.中糧生化能源(肇東)有限公司, 黑龍江 綏化 152001;3.玉米深加工國家工程研究中心 吉林中糧生化有限公司, 吉林 長春 130033)

白酒是世界六大蒸餾酒之一,是中國的國酒,在中國傳統文化中占有獨特的地位。白酒以高粱與大麥、玉米、小麥等或僅以高粱為原料,以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發酵劑,經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成[1]。2021年,中國白酒行業規模以上企業產量716萬kL,銷售收入6 033億元,累計增長18.6%,利潤1 702億元。在釀酒產業中,白酒以13.2%市場份額占據整個飲料酒69.5%銷售收入和87.3%的利潤。

醬香型白酒是中國蒸餾酒的重要香型之一,是采用獨特的“四高兩長”工藝釀造而成?！八母邇砷L”即高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒和生產周期長、貯存時間長[2]。醬香型白酒的典型風味特征是有優雅的醬香氣味,空杯留香,幽雅而持久,入口醇甜、綿柔,具有明顯的酸味,口味細膩,回味悠長,深受廣大消費者的喜愛。武陵酒是中國醬香型白酒三大代表之一,一度與茅臺、郎酒并列;因其產地在湖南省常德市,常德古稱武陵,故因地得名;其生產工藝遵循醬香型白酒的典型工藝特點:以糯紅高粱為原料,用小麥制高溫曲,以石壁泥底窖作發酵池,1年為1個生產周期,全年分2次投糧,9次蒸煮,歷經下沙,糙沙,8輪次發酵,7次取酒。酒體有“醬香突出、略帶焦香、入口綿甜、幽雅細膩”的風格特點。1989年第5屆全國評酒會上,武陵酒獲得中國國家名酒稱號[3-5]。

揮發性含硫化合物具有氣味閾值極低的特點,對各種食品的整體香氣有重要影響[6]。盡管它們以痕量水平出現,但其濃度經常超過其氣味閾值,因此會給食物帶來獨特的味道。不同的含硫化合物呈現出不同的典型風味特征,即使在低濃度時,揮發性含硫化合物對酒精飲料的整體風味也具有顯著影響,如紅葡萄酒中的二甲基硫醚,能夠賦予葡萄酒圓潤的口感,散發出果香與花香[6];老白干白酒中的芐硫醇和2-甲基-3-呋喃硫醇,濃度僅有(4.87±0.27)μg/L和(0.77±0.02)μg/L,對白酒的烤香具有重大影響[7]。因此,研究揮發性含硫化合物具有非常重要的意義,可幫助調控白酒的生產過程,提高白酒產品質量[8]。

然而大多數揮發性含硫化合物在食品中的濃度低于氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析技術的檢出限,難于被鑒定和識別[9-11]。因此,使用專一的硫元素檢測器是十分必要的。Song等[7]比較了全二維氣相色譜-硫化學發光檢測器(comprehensive two-dimensional gas chromatography-sulfur chemiluminescence detector, GC×GC-SCD)、氣相色譜-氫火焰離子檢測器(gas chromatography-flame ionization detector, GC-FID)、GC-MS、氣相色譜-火焰光度檢測器(gas chromatography-flame photometric detector, GC-FPD)和氣相色譜-硫化學發光檢測器(gas chromatography-sulfur chemiluminescence detector, GC-SCD)分析技術的靈敏度。結果表明,GC×GC-SCD的靈敏度至少比GC-FID、GC-MS、GC-FPD和GC-SCD分別高出2 769、2 350、985和11倍。硫化學發光檢測器(sulfur chemiluminescence detector,SCD)是目前公認檢測硫元素最靈敏、選擇性最強的檢測器,利用其選擇性高、分辨率高、靈敏度高、線性范圍寬的優點,可以解決白酒中含硫化合物難以準確檢測的難題,完善白酒風味物質研究的理論基礎。

本研究以6種不同類型武陵醬香型白酒為研究對象,采用頂空固相微萃取(head space solid phase micro-extraction,HS-SPME)結合GC×GC-SCD分析技術,對揮發性含硫化合物進行定性和定量分析。依據定量分析結果,采用主成分分析和正交偏最小二乘判別分析法,研究6種不同類型武陵醬香型白酒中揮發性含硫化合物的差異,探尋主要特征含硫化合物的組成。希望本研究可為醬香型白酒的調配提供數據參考,為白酒企業調控生產過程、提高產品質量提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種不同類型的武陵白酒(SJ1、SJ2、WJ、YJ、ZJ、LJ),湖南武陵酒有限公司;由不同年份、不同輪次的原漿酒調制而成,樣品于冰箱中4 ℃保存,直至分析,樣品相關信息見表1。

表1 6種武陵醬香型白酒樣品信息

超純水由GenPure UV-TOC Xcad plus超純水儀制得,并煮沸冷卻至室溫。

烯丙硫醇、正丁硫醇、3-甲基-2-丁硫醇、噻吩、硫代乙酸甲酯、甲硫醇、硫代乙酸乙酯、2-甲基噻吩、硫代丁酸甲酯、二乙基二硫醚、噻唑、烯丙基甲基二硫醚、2-甲氧基噻唑、4,5-二甲基噻唑、二甲基三硫醚、甲硫基乙酸乙酯、2-甲基四氫噻吩-3-酮、3-甲硫基丙酸乙酯、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚、3-噻吩甲醛、1,3-二噻烷、2-噻吩甲醛、硫代乙酸糠酯、2-噻吩羧酸乙酯、甲基糠基二硫醚、硫代糠酸甲酯、苯并噻唑,色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;氯化鈉,分析純,北京百靈威科技有限公司;乙醇,色譜純,上海阿拉丁試劑公司。

1.2 儀器與設備

GC×GC-SCD,美國力可公司(配備Agilent 7890B型氣相色譜儀,美國Agilent公司;SCD355型硫化學發光檢測器,美國力可公司;Pegasus Ⅲ型四噴口液氮型調制器,美國力可公司);DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,河南予華儀器有限責任公司;VORTEX2型渦旋儀,德國IKA公司;75 μm CAR/PDMS型萃取頭,美國Supelco公司;固相微萃取手動進樣器,美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1揮發性含硫化合物的萃取

參照課題組前期工作經驗,采用HS-SPME富集白酒中的揮發性含硫化合物[7]。將不同樣品用超純水稀釋至乙醇體積分數為10%;取15 mL稀釋后的酒樣置于40 mL頂空進樣瓶中,加入4.3 g氯化鈉,并加入攪拌子,用封口膜密封。

平衡和萃取溫度均為30 ℃,平衡30 min,萃取30 min,攪拌速度為400 r/min。然后,將SPME萃取頭立即插入GC×GC-SCD的進樣口,解析5 min。萃取頭在使用前在氣相色譜進樣口于250 ℃老化10 min。每組實驗均進行3次平行實驗。

1.3.2揮發性含硫化合物的檢測

采用GC×GC-SCD分析白酒中的揮發性含硫化合物。

GC×GC系統。第一維柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),第二維柱為DB-5(2 m×0.25 mm×0.1 μm),2根色譜柱以串聯方式連接。載氣為He,純度99.999%,流速1 mL/min;進樣口溫度250 ℃,壓力207 kPa,手動進樣,不分流;第一維柱溫箱升溫程序為初始溫度50 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升至150 ℃,以5 ℃/min升至230 ℃,保持10 min;第二維柱溫箱升溫程序中各階段溫度均高于第一維柱溫箱 5 ℃。調制器溫度高于第一維柱溫箱15 ℃,調制周期5 s,熱吹時間0.7 s,冷吹時間1.8 s,液氮制冷。

SCD系統。檢測器溫度為250 ℃,雙等離子體控制器溫度為800 ℃,氫氣流速為45 mL/min,空氣流速為60 mL/min,臭氧壓力為0.03 MPa,SCD的采集速率設置為50 Hz。

1.3.3揮發性含硫化合物的定性和定量

采用外標曲線法對目標化合物進行定量。以色譜級乙醇為溶劑制備含有23種目標化合物標準品的母液。在頂空進樣瓶中加入13.5 mL超純水,并加入不同體積的標準品乙醇母液,加入乙醇補充至15 mL,從而制備出不同濃度的混標樣品。加入4.3 g 氯化鈉備用。分析條件同1.3.2節。

采用標準品保留時間比對和自建譜庫進行定性分析,并用外標曲線法進行定量,根據標準化合物的峰體積和其濃度的響應比來繪制標準曲線。

1.4 數據處理

所有實驗重復操作3次,計算平均值和標準偏差。以SJ1-1、SJ1-2、SJ1-3分別表示SJ1樣品的3次平行實驗結果,其他組編號與其相似。數據用LECO Chroma TOF Pegasus 4D處理。該軟件根據組分的保留時間與各自的標準化合物比較,生成了包含保留時間、峰體積、信噪比(signal/noise,S/N)和體積百分比的數據表,并排除S/N<3的化合物。定性條件為一維保留時間偏差在30 s內,二維保留時間偏差在0.1 s內。采用Graphpad prism軟件進行方差分析,應用TBtools軟件繪制熱圖。使用SIMCA 14.0進行PCA和OPLS-DA分析。

2 結果與分析

2.1 揮發性含硫化合物的定性和定量分析結果

6種武陵醬香型白酒中含硫化合物的二維氣相色譜圖見圖1。由圖1可知,不同樣品中的揮發性含硫化合物在種類和含量上均存在差異。GC×GC-SCD對含硫化合物檢測靈敏度非常高,因此在二維分離上濃度較大含硫化合物拖尾嚴重,但對痕量含硫化合物檢測效果非常好。圖1縱坐標為第二維色譜柱的保留時間,橫坐標為第一維色譜柱的保留時間。SCD僅對含硫化合物進行響應,圖中的顏色代表峰體積大小,顏色從藍色向紅色逐步遞進,顏色越紅代表該含硫化合物的峰體積越大。由于硫化學發光檢測器是將含硫化合物燃燒轉化形成激發態SO2再衰變至基態,發出特征的藍色光譜(280～420 nm),光波通過濾光片后被光電倍增管接收,從而實現對硫的檢測。揮發性含硫化合物在SCD燃燒過程所發生的化學反應見式(1)、(2)、(3)。

(1)

圖1 6種武陵醬香型白酒全二維氣相色譜-硫化學發光檢測器檢測圖譜Fig.1 Comprehensive two-dimensional gas chromatography-sulfur chemiluminescence detector spectra of 6 kinds of Wuling soy sauce aroma-type Baijiu

(2)

(3)

由圖1可知,6種武陵醬香型白酒中揮發性含硫化合物存在顯著差異。不同樣品中揮發性含硫化合物的差異主要表現在峰的位置、數量、強度及時間上。根據揮發性物質在全二維氣相色譜的保留時間,與自建的GC×GC-SCD數據庫進行匹配從而對6種白酒中的揮發性含硫化合物進行分析,共檢出29種揮發性含硫化合物,結果見表2。編號為28和29的2種含硫組分,由于其保留時間在一維和二維時間上相近,未能準確定性。故研究共準確定性鑒定出27種含硫化合物,主要包括4種硫醇、6種硫酯、5種多硫醚、5種噻唑、6種噻吩和1種噻烷。其中,共有含硫化合物19種,非共有含硫化合物8種。

表2 6種武陵醬香型白酒揮發性含硫化合物的組成

未能準確定性出編號為28和29的2種含硫組分體現出了GC×GC-SCD方法的不足。雖然GC×GC-SCD在檢測分析白酒中的含硫化合物時具有很高的靈敏度和選擇性,但所產生的信息除了色譜保留時間之外沒有提供化合物鑒定的其他詳細信息。因此,在后續工作中可與其他色譜技術共同應用于白酒含硫化合物風味物質分析。

選取HS-SPME結合GC×GC-SCD的分析手段,采用外標曲線的定量方法對信噪比大于100的23種含硫化合物進行定量分析,定量分析結果見表2。23種含硫化合物的外標定量的線性方程、相關系數、線性范圍見表3。

表3 23種揮發性含硫化合物的外標定量的線性方程、系數和線性范圍

不同種類的含硫化合物具有不同的風味特征。如硫醚類多有蒜香味;二烯丙基二硫醚,被認為是臘八蒜的重要香氣物質;而硫酯類化合物多有令人愉快的香味,如硫代糠酸甲酯具有奶酪香、洋蔥香的香氣特征。硫代糠酸酯類還具有咖啡、堅果香氣,可用于調配蔬菜、水果、咖啡、奶制品、肉、海鮮等食用香精[12]。因此,為了進一步了解不同含硫化合物對白酒風味的影響,本研究進一步分析了6種武陵醬香型白酒中含硫化合物的含量差異。6種武陵醬香型白酒中含硫化合物的含量差異分析見圖2。

*代表在P<0.05程度上有統計學差異,**代表在P<0.01程度上有顯著統計學差異,***和****代表在P<0.001程度上有極其顯著統計學差異。

由圖2可知,6種不同類型的武陵醬香型白酒中,除噻烷類化合物在6種白酒中的含量無顯著性差異外,硫醇類、硫酯類、多硫醚類、噻唑類、噻吩類化合物在6種白酒中的含量均具有顯著性差異,但顯著程度不同。硫醇類化合物包括烯丙硫醇、正丁硫醇、3-甲基-2-丁硫醇和甲硫醇,其可能是酵母對釀酒原料中的含硫蛋白質的降解產物,如甲硫氨酸的代謝產生[13]。香氣活性值是表征某一香氣成分對整體香氣特征貢獻度的指標,為香氣成分的濃度與閾值的比值。甲硫醇的閾值為2.21 μg/L[14],6種白酒中甲硫醇的濃度在405.75～4 088.84 μg/L,OAV值范圍為183.6～1 850.15,這表明其對白酒中的煮熟的土豆味具有重要貢獻。硫酯化合物包括硫代乙酸甲酯、硫代丁酸甲酯、甲硫基乙酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、硫代乙酸糠酯和硫代糠酸甲酯。其中,硫代丁酸甲酯具有果香、奶酪香的香氣特征,可用于調制水果、奶制品等食用香精,在芝麻香型白酒中曾被檢出;3-甲硫基丙酸乙酯、甲硫基乙酸乙酯具有果香,是瓜果中常見的含硫化合物。甲基糠基二硫醚和甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚是2種具有肉香風味的硫醚化合物,2種含硫化合物均有極低的閾值,分別為0.8 μg/L和0.3 μg/L[14]。而甲基糠基二硫醚和甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚在6種白酒中的質量濃度分別為0.31～1.36 μg/L和0.25～0.6 μg/L,計算得出,除YJ、LJ外,甲基糠基二硫醚的OAV值范圍為1.05～1.7,甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚在LJ外的其余樣品的OAV值范圍為1.2～2.0。因此,甲基糠基二硫醚和甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚對白酒的整體香氣特征有重要貢獻。二甲基三硫醚與前兩種多硫醚化合物相比,質量濃度相對較高,為4.39～16.79 μg/L,其閾值為0.36 μg/L,在6種白酒中OAV值均大于1,范圍為12.19～46.64。因此,二甲基三硫醚對6種白酒中的整體香氣輪廓具有重要貢獻。

對于噻唑類含硫化合物,僅在SJ2與LJ中存在顯著性差異,其余均無顯著性差異。苯并噻唑具有肉香、堅果香,可用于調配堅果、肉、可可、咖啡等食用香精。但由于其閾值較高,為3 581 μg/L,在6種白酒中OAV值均小于1,表明它對白酒的香氣輪廓影響不大。2-甲基四氫噻吩-3-酮是一種具有烤牛肉的特征風味物質,在食用香精中調配飲料、奶制品、肉類等[15]。3-噻吩甲醛、2-噻吩甲醛具有油漆味、硫黃味,是熱反應形成肉味的主要香氣活性化合物[16-17]。噻烷類化合物在6種白酒中的含量無顯著性差異,該物質的形成被認為是烯丙基硫醚類化合物分子中的不穩定C—S鍵發生斷裂,生成了烷硫基和丙烯基自由基,其中部分自由基在發酵過程中轉化為帶有香氣的噻烷類物質,且被認為與白酒中的大蒜味有關[18]。

2.2 揮發性含硫化合物的主成分分析結果

為了更加直觀地分析6種白酒中含硫化合物的風味差異,將不同類型白酒中的揮發性含硫化合物的峰體積進行PCA分析[19]。PCA分析結果見表4,由表4可知,前7個主成分的累計貢獻率為93.38%,PC1和PC2分別解釋了總方差的44.1%和22.9%,兩者貢獻率之和為67.0%,見圖3,說明數據降維后所得綜合變量在二維空間能基本代表原始數據所反映的信息[20]。通過二維空間的數據分布差異可以直觀地觀察到組間和組內樣品間的差異性,組內各樣品相對距離較近或重疊,說明樣品的重復性較好,不同樣品各組數據的成簇區域有明顯的間距,說明不同種類的武陵醬香型白酒間的特異性較明顯,PCA模型能夠依據GC×GC-SCD測定得到的揮發性成分對樣品進行有效區分。

圖3 6種武陵醬香型白酒揮發性含硫化合物 GC×GC-SCD數據的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of GC×GC-SCD data of volatile sulfur-containing compounds in 6 kinds of Wuling soy sauce aroma-type Baijiu

表4 6種武陵醬香型白酒揮發性含硫化合物GC×GC-SCD數據的主成分累計貢獻率

2.3 揮發性含硫化合物的正交偏最小二乘判別分析結果

和PCA相似,OPLS-DA也是基于降維的多維向量分析方法。但是OPLS-DA為有監督的分析,可以預設分類,彌補了PCA方法的不足,強化組間差異,同時可以量化特征化合物造成組分差異的程度。以GC×GC-SCD鑒定的揮發性含硫化合物的峰體積為x變量,以樣品類別為y變量進行OPLS-DA分析,結果見圖4。由圖4可知,6種武陵醬香型白酒中含硫化合物的含量存在顯著性差異,OPLS-DA分析可以實現6種武陵醬香型白酒的良好分離。OPLS-DA模型解釋率參數R2Y為0.941,預測能力參數Q2為0.725,說明該模型對6種武陵醬香型白酒樣品具有良好的穩定性和較好的預測能力,相較于PCA分析結果,OPLS-DA使組間差異更明顯[21-22]。

圖4 6種武陵醬香型白酒揮發性含硫化合物GC× GC-SCD數據的正交偏最小二乘判別分析Fig.4 Orthogonal partial least squares discriminant analysis of GC×GC-SCD data of volatile sulfur-containing compounds in 6 kinds of Wuling soy sauce aroma-type Baijiu

變量投影重要性(variable importance in projection, VIP)可以進一步量化OPLS-DA的每個變量對樣品分類的貢獻。VIP值越大,變量在不同樣品間的差異越顯著,通?？梢詫IP >1表示為關鍵變量。從GC×GC-SCD分析結果中共篩選出14種VIP值大于1的潛在揮發性特征標志物,結果見表5。包括噻吩類4種(3-噻吩甲醛、2-噻吩甲醛、噻吩、2-噻吩羧酸乙酯),硫醇類3種(正丁硫醇、甲硫醇、3-甲基-2-丁硫醇),硫醚類2種[甲基糠基二硫醚、甲基(2-甲基-3-呋喃基)二硫醚],硫酯類1種(甲硫基乙酸乙酯),噻唑類2種(苯并噻唑、4,5-二甲基噻唑),還有編號28和29的2種未準確定性的含硫組分。

表5 區分6種武陵醬香型白酒風味特征的關鍵揮發性含硫化合物

依據6種武陵醬香型白酒中揮發性含硫化合物的定量分析結果,分析得到的VIP>1的化合物中,噻吩類化合物最多,可知噻吩類化合物對于不同類型的武陵醬香型白酒風味有重要影響。噻吩類化合物的生成被認為與美拉德反應有關,高粱蛋白富含賴氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等氨基酸,氨基酸是醬香白酒中重要風味物質的前體物質,在醬香型白酒生產發酵過程中,高溫發酵條件下與還原糖發生美拉德反應,形成一系列縮合、分解、脫羧、脫氨、脫氫等復雜反應,生成具有焙烤香的噻吩類化合物[23-24]。

3 結 論

為深入探究我國醬香型白酒中重要的痕量揮發性含硫化合物的組成,研究采用HS-SPME結合GC×GC-SCD技術,以6種產于湖南的不同類型武陵醬香型白酒為研究對象,對其中的含硫化合物進行了分析。共檢出29種揮發性含硫化合物,但有2種含硫組分由于其保留時間在一維和二維時間上相近,未能準確定性。因此,本研究最終共準確定性鑒定出27種揮發性含硫化合物,主要包括4種硫醇、6種硫酯、5種多硫醚、5種噻唑、6種噻吩和1種噻烷。其中共有含硫化合物19種,非共有含硫化合物8種。采用外標曲線法對鑒定出的27種揮發性含硫化合物中在GC×GC-SCD上S/N>100的23種含硫化合物進行了定量分析。對23種定量檢出的揮發性含硫化合物的峰體積進行主成分分析和正交偏最小二乘判別分析,發現6種不同類型武陵醬香型白酒中揮發性含硫化合物具有顯著性差異。研究發現,14種變量投影值大于1的含硫化合物,可作為區分6種不同類型武陵醬香型白酒風味特征的差異組分。未能準確定性出的2種含硫組分也體現出了GC×GC-SCD方法的不足,因此,在后續工作中可與其他色譜技術共同應用于白酒含硫化合物風味物質分析。希望本研究可為醬香型白酒的調配提供數據參考,為白酒企業調控生產過程、提高產品質量提供技術支持。