LuxS/AI-2群體感應系統對植物乳桿菌抵御環境脅迫的作用

馬佳歌, 譚中美, 田子豪, 吳夢果, 韋 旋, 任 潔, 姜瞻梅,于 微, 侯俊財

(東北農業大學 食品學院/乳品科學教育部重點實驗室, 黑龍江 哈爾濱 150030)

群體感應(quorum sensing,QS)是一種依賴細胞密度的細菌通信系統,通過種內或種間的信號分子調節細菌行為[1]。細菌生長階段分泌產生的可溶性自誘導因子(autoinducers,AIs)自由擴散到周圍環境內,并監控群體密度及調節細菌的生長行為和功能[2]。研究發現,哈氏弧菌(Vibrioharveyi)可分泌信號分子AI-1(autoinducer-1,AI-1)和AI-2(autoin-ducer-2,AI-2)[3]。在革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌中普遍存在的群體感應系統為信號分子AI-2介導的LuxS/AI-2群體感應系統[4-5]。

益生乳桿菌因其長期的安全使用歷史及調節腸道菌群、抑制致病菌、預防感染和腹瀉、改善炎癥性腸病和調節免疫系統等潛在功能而受到廣泛關注[6]。其中,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,L.plantarum)是農業和食品工業中常用的益生乳桿菌,其抵御加工、貯藏及胃腸道等環境脅迫的能力是其在食品工業中應用的前提條件[7]。乳桿菌可通過LuxS/AI-2群體感應系統介導其益生功效的發揮,如參與生物膜的形成、細胞黏附的調控、抑菌作用的發揮及環境脅迫耐受性存活等[8-10]。

目前關于不同種類環境脅迫下植物乳桿菌LuxS/AI-2群體感應系統全面報道的信息有限,闡明LuxS/AI-2群體感應系統在植物乳桿菌中的調控機制對開發穩定、高效的益生菌產品具有重要的理論意義和應用價值。因此,本研究擬通過解析不同初始pH值、滲透壓、溫度及營養環境脅迫下植物乳桿菌1.0328菌密度及代謝產酸情況,分析環境脅迫下LuxS/AI-2群體感應信號分子AI-2活性隨時間的變化規律,綜合考察環境脅迫下植物乳桿菌LuxS/AI-2群體感應系統關鍵基因luxS及pfs表達水平上的變化規律,探討LuxS/AI-2群體感應系統調控植物乳桿菌抵御環境脅迫的作用機制,希望為進一步改善益生乳桿菌在食品中實際應用的有效性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌KLDS 1.0328,分離篩選于黑龍江省傳統發酵泡菜中,并保藏在東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室;哈氏弧菌(Vibrioharveyi,V.harveyi)BB 170,中國農業科學院上海獸醫研究所。MRS培養基,北京奧博星生物技術有限責任公司;海生菌2216E培養基,青島海博生物技術有限公司;RNAprep Pure培養細菌總RNA試劑盒,北京天根生化科技有限公司;Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒、SYBR?PremixExTaqTM試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9082型電熱恒溫培養箱,上海一恒科技有限公司;Step One PlusTM型實時熒光定量PCR儀,美國Life Technologies公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠;H1750R型臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;SpectraMax reg iD3型多功能酶標儀,上海美谷分子儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養基配制及菌種的活化

AB培養基配制:MgSO412.3 g/L、NaCl 17.5 g/L、不含維生素的酪蛋白氨基酸2 g/L,使用KOH溶液將pH值調至7.6,121 ℃高壓滅菌15 min,冷卻至室溫后添加無菌K2HPO4(1 mol/L)10 mL、無菌L-精氨酸(0.1 mol/L)10 mL及無菌甘油(質量分數50%)20 mL。

將植物乳桿菌KLDS 1.0328以體積分數2%的接種量接種于MRS培養基中,37 ℃下培養24 h,并連續活化3次以恢復菌種活力。哈氏弧菌BB 170以體積分數2%的接種量接種到無菌海生菌2216E培養基內并以150 r/min在30 ℃條件下有氧培養16 h,活化3代后以體積分數2%的接種量接種于無菌AB液體培養基內備用。

1.3.2菌體密度的測定及無細胞發酵上清液的制備

以菌液在600 nm波長下的吸光度OD600表示菌體密度。取待測菌液于4 ℃、4 000 r/min離心10 min,采用2 mol/L NaOH將上清液的pH值調節至6.5。用0.22 μm的濾膜過濾得到排酸后的無細胞發酵上清液(cell-free supernatant,CFS)。將哈氏弧菌BB 170以2%的接種量接種到無菌AB培養基內,150 r/min、30 ℃有氧培養16 h,4 ℃、4 000 r/min離心10 min,以0.22 μm濾膜過濾所得的上清液為陽性對照;AB培養基以0.22 μm濾膜過濾為陰性對照;將MRS培養基以0.22 μm濾膜過濾為介質對照。所有樣品-80 ℃貯存備用。

1.3.3信號分子AI-2活性的測定

將已活化好的哈氏弧菌BB 170以2%的接種量接種到無菌AB培養基內,在搖床175 r/min、30 ℃條件下有氧培養16 h,以無菌AB培養基將哈氏弧菌BB 170菌液按體積比1∶5 000稀釋。將待測樣品、陽性對照樣品、陰性對照樣品以及介質對照樣品分別與經過了5 000倍稀釋的哈氏弧菌BB 170菌液,按體積比1∶100混合后于175 r/min、30 ℃下共孵育[11]。當AB培養基熒光強度最小時,于490 nm波長化學發光模式下測定熒光強度,以相對熒光強度表示信號分子AI-2的活性。

1.3.4LuxS/AI-2群體感應系統關鍵基因轉錄水平測定

通過美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)內已有的植物乳桿菌luxS、pfs基因對應的全序列,以16S rRNA基因為內參基因,Primer Premier 5.0引物設計軟件設計引物,經上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見表1。使用總RNA試劑盒提取菌體總RNA。除去基因組DNA,以總RNA為模板,使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。以逆轉錄cDNA為模板,參考SYBR?PremixExTaqTM試劑盒,配制實時熒光定量PCR反應體系20 μL。PCR反應參數:95 ℃預變性30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,共計40個循環。采用2-ΔΔCt法分析LuxS/AI-2群體感應系統關鍵基因luxS及pfs的轉錄情況。

表1 引物序列信息

1.3.5LuxS/AI-2群體感應系統對植物乳桿菌抵御環境脅迫能力的測定

1)酸減脅迫。分別使用1 mol/L HCl或NaOH將MRS培養基調整至初始pH值分別為3.5、5.0、8.0、9.0,初始pH值為6.4±0.2的原MRS培養基為對照組。2)滲透壓脅迫。配制添加質量分數1.5%、3.0%、6.0% 的NaCl及3.0% NaCl+3.0% KCl的MRS培養基,未添加鹽的MRS培養基為對照組。3)溫度脅迫。分別在25、30、37、45、50 ℃下厭氧培養24 h,培養溫度37 ℃為對照組。4)營養脅迫。以質量濃度0.85 g/100 mL的無菌生理鹽水將MRS培養基分別稀釋至體積分數為20%、40%、60%、80%,原MRS培養基為對照組。每隔4 h測定菌液在600 nm下的吸光度及可滴定酸度,并制備CFS測定AI-2信號分子活性,培養8 h時分析luxS及pfs的轉錄差異。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3次,數據以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 26.0軟件的單因素方差分析及Tukey檢驗對數據進行分析,P<0.05代表數據間存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 酸堿脅迫對菌體代謝及群體感應系統的影響

圖1顯示了酸堿脅迫對于植物乳桿菌KLDS 1.0328菌體密度、產酸、產AI-2信號分子及群體感應相關基因轉錄的影響。由圖1(a)可知,當面臨初始pH值為3.5的環境脅迫時,植物乳桿菌KLDS 1.0328可較為緩慢地生長但容易死亡,而初始pH值為8.0的實驗組在培養了16～20 h時的菌體密度顯著高于對照組及其他pH值組(P<0.05),這是由于較高的初始pH值延緩了乳酸導致的pH值降低和酸脅迫。由圖1(b)可知,pH 3.5及pH 9.0組植物乳桿菌KLDS 1.0328的生長及產酸性能均受到明顯抑制。對于初始pH值為9.0的堿脅迫,菌體的生長遭到抑制,培養4～12 h時,相同單位量的菌體信號分子AI-2的釋放相較于對照組受到明顯抑制,而12 h后相對熒光強度則迅速增高,這可能是因為菌體代謝產生的有機酸進一步中和了培養基內的堿[圖1(c)]。由圖1(d)可知,與pH值為6.4的對照組相比,pH值為3.5的酸脅迫下luxS及pfs基因的轉錄水平均達到最高(P<0.05)。此外,當初始pH值為8.0及9.0時,植物乳桿菌KLDS 1.0328luxS基因受到堿脅迫的誘導作用,其轉錄水平均顯著上調(P<0.05)。在pH值為3.5的重度酸脅迫下,信號分子AI-2誘導的相對熒光強度顯著增加,這意味著信號分子AI-2的調控可能主要受到強酸的刺激。相似地,曾有研究報道了在pH值為3.5的條件下,發酵乳桿菌易受到脅迫并通過群體感應系統以生物被膜形成率更高的形式存活[12]。

圖(a)～(c)中不同小寫字母代表同一脅迫處理組不同培養時間之間數據差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表相同培養時間不同脅迫處理組數據差異顯著(P<0.05);圖(d)中不同小寫字母代表不同脅迫處理組luxS基因轉錄水平數據差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表不同脅迫處理組pfs基因轉錄水平數據差異顯著(P<0.05)。

2.2 滲透壓脅迫對菌體代謝及群體感應系統的影響

不同滲透壓脅迫對于植物乳桿菌KLDS 1.0328菌體密度、產酸、產AI-2信號分子及群體感應相關基因轉錄的影響見圖2。由圖2(a)可知,隨著鹽的質量分數增加帶來培養基滲透壓逐漸增大,植物乳桿菌KLDS 1.0328的最大菌體密度逐漸降低,且各處理組均顯著低于未經脅迫的對照組(P<0.05)。在較高的總鹽質量分數(6.0%)下,菌體的生長緩慢。Gandhi和Shah[13]也曾揭示了,質量分數5.0%的NaCl可引起益生菌的細胞酯酶活性等代謝活性受到抑制,損傷細胞膜完整性,甚至導致細胞死亡。前期研究發現,當NaCl部分被KCl替代時,植物乳桿菌菌體的損傷及黏附能力均存在一定的改善[7]。因此,本研究采用3.0% NaCl+3.0% KCl替代6.0% NaCl,旨在進一步探索LuxS/AI-2群體感應系統在植物乳桿菌KLDS 1.0328抵御不同種類高滲透壓脅迫下的潛在作用。研究結果表明,采用KCl部分替代NaCl,與只添加NaCl的MRS培養基相比,未顯著提高可滴定酸度[圖2(b)],而在培養12～20 h時顯著提高了菌體密度(P<0.05),這表明了KCl在高滲環境中對菌體具有潛在的保護作用[14]。由圖2(c)可知,處于較強滲透壓脅迫下,信號分子AI-2的活性明顯受到抑制,且KCl替代滲透壓脅迫組中信號分子AI-2活性比未替代前更強。Lin等[15]曾證實,清酒乳桿菌及植物乳桿菌遭受發酵相關高濃度硝酸鹽脅迫時,LuxS/AI-2群體感應系統luxS基因的轉錄顯著增加,表明luxS介導的群體感應系統通過AI-2活性的變化參與了乳桿菌的脅迫應激反應,并在高滲脅迫適應及微生物演替中起重要調控作用。此外,當菌體處于質量分數3.0%的NaCl及以上的滲透壓脅迫時,基因luxS與pfs的轉錄水平均顯著上調[圖2(d)]。

圖(a)～(c)中不同小寫字母代表同一脅迫處理組不同培養時間之間數據差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表相同培養時間不同脅迫處理組數據差異顯著(P<0.05);圖(d)中不同小寫字母代表不同脅迫處理組luxS基因轉錄水平數據差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表不同脅迫處理組pfs基因轉錄水平數據差異顯著(P<0.05)。

2.3 溫度脅迫對菌體代謝及群體感應系統的影響

溫度脅迫對于植物乳桿菌KLDS 1.0328菌體密度、產酸、產AI-2信號分子及群體感應相關基因轉錄的影響見圖3。由圖3(a)可知,低于最適溫度的 25 ℃處理能夠導致菌體的生長及代謝受抑制,而45 ℃輕度高溫脅迫在培養初期可促進菌體的增殖及產酸代謝,重度高溫脅迫則會對菌體生長代謝造成不利影響。由圖3(b)可知,于37 ℃下培養植物乳桿菌KLDS 1.0328的產酸能力較強,而處于25 ℃及50 ℃時,菌體的產酸能力明顯受到抑制。輕度低溫脅迫穩定期及輕度高溫脅迫培養初期,信號分子AI-2活性顯著提高;更強程度的溫度脅迫下,信號分子AI-2活性受到顯著抑制[圖3(c)]。低溫脅迫誘導促使luxS及pfs基因的轉錄水平顯著上調,而pfs基因的轉錄受高溫脅迫的影響較小[圖3(d)]。這與Gu等[3]的研究結果相似,發酵乳桿菌2-1的群體感應系統相關基因轉錄在較低溫度(23、30 ℃)脅迫下顯著上調,而在44 ℃下基因的轉錄與未脅迫相比無顯著差異(P>0.05)。曾有研究報道了溫度脅迫適應誘發的交叉保護能夠提升菌體面臨異種環境脅迫時的存活率[16-17]。此外,Liu等[18]發現過表達luxS基因可提高類植物乳桿菌L-ZS9群體感應信號分子AI-2的產量,luxS的過表達改善了菌株的耐熱性及膽鹽耐受性。

圖(a)～(c)中不同小寫字母代表同一脅迫處理組不同培養時間之間數據差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表相同培養時間不同脅迫處理組數據差異顯著(P<0.05);圖(d)中不同小寫字母代表不同脅迫處理組luxS基因轉錄水平數據差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表不同脅迫處理組pfs基因轉錄水平數據差異顯著(P<0.05)。

2.4 營養脅迫對菌體代謝及群體感應系統的影響

圖4顯示了營養脅迫對于植物乳桿菌KLDS 1.0328菌體密度、產酸、產AI-2信號分子及群體感應相關基因轉錄的影響。隨著營養缺乏脅迫程度的提高,植物乳桿菌KLDS 1.0328的生長及產酸性能均受到明顯抑制[圖4(a)和圖4(b)]。同時,由圖4(c)可知,營養脅迫的程度越強,誘導產生的信號分子AI-2越多。此外,更為嚴酷的營養脅迫提高了luxS及pfs基因的轉錄水平[圖4(d)]。曾有研究證實了植物乳桿菌B21的菌體形態和細胞膜脂肪酸組成及含量的改變可作為其適應缺乏葡萄糖及吐溫-80營養脅迫的有效策略[19]。植物乳桿菌KLDS 1.0328信號分子AI-2的活性變化與luxS及pfs基因的轉錄水平變化并不是完全對應的,這可能是由于轉錄水平測定的為8 h的數據,所以轉錄的數據與不同培養時間下信號分子AI-2的活性不符。此外,由于luxS及pfs基因編碼的蛋白質不但能夠介入信號分子AI-2的生物合成路徑,還可能在環境脅迫下介入菌體的其他代謝通路,并以脅迫應激蛋白的形式在惡劣的環境條件下誘導表達的進化。

圖(a)～(c)中不同小寫字母代表同一脅迫處理組不同培養時間之間數據差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表相同培養時間不同脅迫處理組數據差異顯著(P<0.05);圖(d)中不同小寫字母代表不同脅迫處理組luxS基因轉錄水平數據差異顯著(P<0.05),不同大寫字母代表不同脅迫處理組pfs基因轉錄水平數據差異顯著(P<0.05)。

3 結 論

本研究對酸堿、滲透壓、溫度及營養匱乏脅迫條件下植物乳桿菌KLDS 1.0328的LuxS/AI-2群體感應系統進行了分析,信號分子AI-2分泌的抑制與初始pH值為8.0、9.0的堿脅迫,25 ℃低溫、50 ℃高溫,質量分數6.0% NaCl、3.0% NaCl+3.0% KCl的高滲透壓脅迫相關;而AI-2活性的增強可由初始pH值為3.5、5.0的酸脅迫,45 ℃高溫,營養物質稀釋至體積分數為20%、40%、60%的營養脅迫引起。經初始pH值為3.5、9.0,25、30 ℃低溫,6.0%NaCl及3.0% NaCl+3.0% KCl的高滲透壓以及20%的MRS培養基營養脅迫處理后,luxS及pfs的轉錄均達較高水平。因此,不同環境脅迫條件下LuxS/AI-2群體感應系統存在不同程度的變化,并參與了該菌株的抗逆過程。植物乳桿菌LuxS/AI-2群體感應系統的增強,可作為其抵御多種環境脅迫策略的新起點。然而,目前乳桿菌中LuxS/AI-2群體感應系統調控路徑的揭示仍是該研究領域面臨的重要挑戰。應在此基礎上采用高通量技術進一步在基因轉錄、蛋白質表達以及代謝組學等現代分子生物學層面分析及驗證環境脅迫下菌體的適應機制,系統分析菌體脅迫應答的機理。研究結果旨在為闡明LuxS/AI-2群體感應系統改善益生乳桿菌對惡劣環境脅迫的抗逆機制,并為促進益生菌產品的開發提供理論依據。