副干酪乳桿菌ET-22及其后生元組分對白念珠菌的抑制作用

趙 智, 孫 哲, 劉福東, 洪維鍊, 高海娜,趙 雯, 張 明,*, 范金波,*

(1.渤海大學 食品科學與工程學院, 遼寧 錦州 121013; 2.北京工商大學 食品與健康學院, 北京 100048;3.內蒙古乳業技術研究院有限責任公司/內蒙古伊利實業集團股份有限公司, 內蒙古 呼和浩特 010110)

白念珠菌是引發口腔念珠菌病的主要致病菌,其作為一種條件致病菌存在于75%健康人口腔中,當宿主防御機制和真菌定植平衡失調導致唾液中白念珠菌含量超過400 CFU/mL時就會引起口腔念珠菌病[1-2]。目前治療口腔念珠菌病的主要治療手段為使用抗真菌藥物,主要包括咪唑類、多烯類和棘白菌素等,這些藥物的廣泛使用可能會導致真菌耐藥性惡化,藥物療效顯著性降低,從而產生嚴重的副作用和高昂的治療成本[3]。

隨著社會的發展,益生菌作為功能食品中的一項重要功能因子,備受消費者關注[4]。益生菌是指通過攝入足夠的數量,能對宿主發揮有益作用的一種微生物制劑,因具有抑制病原菌生長繁殖,優化腸道菌群結構;提高機體免疫力[5];清除機體自由基;改善機體的血脂情況,降低膽固醇含量[6]等多種生理功能,故含益生菌的食品在市場上廣受關注。目前研究表明,益生菌主要是通過抑制致病微生物和調節口腔菌群對口腔疾病如齲齒、牙周炎起到預防和治療的作用[7-8]。研究發現,口服含羅伊氏乳桿菌DSM17938(LactobacillusreuteriDSM17938)和羅伊氏乳桿菌ATCC PTA 5289(LactobacillusreuteriATCC PTA 5289)的益生菌菌片12周后,老年人唾液中白念珠菌濃度和口腔念珠菌病的患病率降低[9]。近期研究發現,被稱為后生元組分的熱滅活菌及活菌代謝物對白念珠菌的繁殖及生物膜生成同樣具有顯著抑制效果[10-11]。與活菌相比,后生元組分在食品中發揮的功效可能更穩定和優越。目前研究表明,活菌在動物體內對白念珠菌的侵染具有預防功效,但其后生元組分(熱滅活菌和分泌物)是否具有類似的功效尚不明確。

本研究以具有預防齲齒和牙周炎功效的副干酪乳桿菌ET-22為實驗菌株[12],擬通過檢測抑制白念珠菌體外出芽及菌絲轉化的能力以及在動物模型中調節免疫系統和舌苔菌群變化的能力,探究副干酪乳桿菌ET-22活菌及其后生元組分對白念珠菌的抑制作用,旨在為研發具有口腔保健功能的后生元功能食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株與實驗動物

副干酪乳桿菌ET-22,內蒙古伊利實業集團股份有限公司;白念珠菌CGMCC 2.4122(CandidaalbicansCGMCC 2.4122),中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。6周齡SPF級ICR雌性小鼠,50只,北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號為SCXK(京)2019-0008,飼養條件為每天光照12 h,溫度為(20±2) ℃,濕度45%～60%,本實驗已通過譜尼測試科技有限公司動物實驗倫理審查同意,批準號為PONY-2021-FL-43。

1.1.2實驗試劑

MRS固體培養基、MRS培養基,北京陸橋技術股份有限公司;酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養基,北京奧博星生物技術有限責任公司;MP Fast DNATMSPIN Kit for soil DNA提取試劑盒,美國MP Biomedicals公司;Beadstar-mPlex小鼠多細胞因子檢測試劑盒,碧芯生物科技(海南省)有限公司;BCA蛋白定量試劑盒,美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器設備

MS 3 basic型渦旋振蕩器,德國IKA公司;DPH-9272型恒溫培養箱,上海瑞穩儀器設備廠;DM6B型熒光顯微鏡,徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司;Legend Micro 17R型冷凍高速離心機,德國賽默飛世爾科技公司;UV-2800A型紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1菌株活化及樣品制備

1)白念珠菌菌懸液制備。用生理鹽水制備109cell/mL的白念珠菌菌懸液,用于建造小鼠口腔念珠菌病模型[13]。

2)副干酪乳桿菌ET-22活菌制備。將10 mL過夜培養的菌懸液離心,用PBS緩沖液洗滌3次,并懸浮在1 mL的PBS中。用2倍稀釋法稀釋重懸液,用分光光度計測定不同稀釋倍數的OD600,同時用活菌計數法測定活菌數。確定1010CFU/mL對應的OD600,并每次以OD600為標準,調整重懸液的濃度,現用現制。ET-22活菌干預濃度參考文獻中唾液鏈球菌K12的干預濃度(109CFU/mL)[14]。

3)副干酪乳桿菌ET-22熱滅活菌制備。通過在70 ℃水浴中放置1 h,對濃度調整后的109CFU/mL活菌進行熱滅活,4 ℃儲存備用。

4)副干酪乳桿菌ET-22分泌物制備[15]。將109CFU/mL活菌用PBS緩沖液洗滌并加入無菌水中[m(菌泥)∶V(水)=1∶3],室溫800 r/min下攪拌2 h,然后離心(4 500 r/min,10 min)取上清液,并用0.22 μm無菌濾膜過濾,4 ℃儲存備用。

1.3.2白念珠菌芽胚管及菌絲轉化的測定

將1 mL白念珠菌細胞等分到48孔細胞培養板中(每孔含有2×108CFU),加入含1 mL ET-22活菌(109CFU/mL)或后生元組分的RPMI-1640培養基,37 ℃孵育6 h。含有白念珠菌的48孔細胞培養板中加入1 mL RPMI-1640培養基作為對照組。用血細胞計數板計算胚芽管形成率[16]。將孵育時間延長至16 h,離心后用體積分數為50%的乳酸酚棉藍染色液染色,并通過熒光顯微鏡觀察菌絲生長狀態[17]。

1.3.3ET-22活菌及后生元組分抗氧化能力測定

109CFU/mL的ET-22活菌及后生元組分的DPPH自由基和羥自由基清除率測定參考文獻[18-19]。

1.3.4小鼠口腔念珠菌病模型的建立

1.3.4.1 動物模型構建方法

參考文獻[20]并稍加修改,建立口腔念珠菌病模型。將小鼠分為空白組(正常飲食)、模型組(正常飲食+白念珠菌)、實驗組[活菌組(正常飲食+白念珠菌+副干酪乳桿菌ET-22活菌)、熱滅活菌組(正常飲食+白念珠菌+副干酪乳桿菌ET-22熱滅活菌)、分泌物組(正常飲食+白念珠菌+副干酪乳桿菌ET-22分泌物)]。每組小鼠分為2籠,每籠5只。將ET-22活菌及后生元組分分別加入到30 mL的無菌水中,菌濃度為109CFU/mL,每12 h更換1次。實驗組進行18 d的益生菌干預。15 d通過飲用水給小鼠服用15 mg/mL四環素鹽酸鹽,并進行潑尼松龍(100 mg/kg)皮下注射。16 d對模型組和實驗組進行白念珠菌感染,將白念珠菌浸漬的棉簽放置在舌背上15 min。小鼠感染白念珠菌48 h后進行安樂死。

1.3.4.2 口腔病癥感染程度評估

小鼠被處死后,進行舌病變嚴重程度的評估觀察。根據舌面白色凝乳樣斑塊的范圍和嚴重程度,進行0至4分的病變評分[21]。

1.3.4.3 組織學評估

取二分之一的小鼠舌部組織,用體積分數為4%的多聚甲醛固定48h[22]。委托武漢塞維爾生物科技有限公司進行各組小鼠的舌部組織病理切片處理及HE染色。

1.3.4.4 炎癥因子含量測定

1)小鼠血清樣本蛋白質水平分析。將血液樣本靜置30 min后離心(10 000 r/min,15 min),取上清使用小鼠多細胞因子檢測試劑盒測定血液上清液中 IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-17的蛋白質水平。

2)小鼠舌部組織樣本蛋白質水平分析。取小鼠剩余的舌頭,在液氮存在下進行組織勻漿,取上清液用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量,對不同小鼠舌部組織總蛋白含量進行均一化。使用小鼠多細胞因子檢測試劑盒測定舌組織上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17和趨化因子CCL20的蛋白質水平。

1.3.4.5 口腔微生物菌群結構測定

1)樣品采集及總DNA提取。無菌口腔棉拭子刮取小鼠口腔舌苔微生物,剪下無菌棉拭子頭于0.5 mL的核酸保護液中,-80 ℃儲存。干冰低溫寄至上海美吉生物醫藥科技有限公司,-80 ℃保存備用,直至進行DNA提取。依據細菌DNA試劑盒標準流程從口腔菌群樣本中提取DNA。對舌苔菌群樣本DNA的完整度、純度以及濃度進行檢驗,經檢驗合格的DNA用于后續實驗。

2)菌群Illumina Miseq測序。利用Illumina測序方法及引物(27F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,1492R 5′-ACCTTGTTACGACTT-3′)對標準細菌的16S rRNA V3～V4區域進行聚合酶鏈反應擴增。使用PacBio官方推薦的Iso-seq建庫方法,使用建庫試劑SMRTbellTM Template prep kit 1.0-SPv3完成該樣本標準兩文庫(<4 kb,>4 kb)的構建工作。文庫構建完成后,使用測序試劑DNA/Polymerase Binging Kit 3.0進行測序。

3)生物信息學分析。使用QIIME分析平臺對初始數據進行整合、拼接、質控后,得到高質量的測序數據。PyNAST校準排齊序列,以100%相似性進行UCLUST歸并從而建立無重復的926R→515F序列集。采用兩步UCLUST歸并,在100%相似性歸并的基礎上進一步進行97%相似性的歸并,從而建立操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)。將OTU代表性序列通過RDP與Greengenes數據庫進行(Release13.8)比對及物種注釋,比較不同分組在不同分類水平上的組成和豐度分布。利用Beta多樣性分析對樣品進行主成分分析(PCA),比較樣本間的菌群結構差異。

1.4 數據處理

所有數據以平均值±標準偏差表示。每組實驗設置3個平行,進行3次重復,使用單向方差分析(ANOVA)和GraphPad Prism 8軟件中的Dunnett檢驗對實驗結果進行分析。P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2 結果與分析

2.1 副干酪乳桿菌ET-22活菌及其后生元組分對白念珠菌芽胚管形成及菌絲生長能力的影響

采用血細胞計數方法研究副干酪乳桿菌ET-22活菌及其后生元組分對白念珠菌的芽胚管形成能力的影響,結果如圖1。培養6 h后,活菌組、熱滅活菌組、分泌物組及對照組的出芽率分別為(13.33±2.03)%、(33.67±4.05)%、(23.17±2.30)%和(51.17±3.41)%。與對照組相比,ET-22活菌組和后生元組的芽胚管形成能力極顯著降低(P<0.01)?；罹?、熱滅活菌及分泌物對白念珠菌芽胚管形成的抑制率分別為38.84%、17.50%和28.00%。同等培養條件下,對照組的芽胚管形成能力低于He等[23]的研究(80.70%)。這可能是因為不同菌株的白念珠菌的芽胚管形成能力不一樣。

采用乳酸酚棉藍染色方法研究副干酪乳桿菌ET-22及其后生元組分對白念珠菌的菌絲生長能力,結果如圖2。ET-22活菌組以浮游單個酵母菌形態和少量出芽狀態為主,ET-22死菌組和分泌物組以少量菌絲聚集為主,未形成穩定單層生物膜,而對照組菌絲聚集形成了一層穩定的生物膜結構。白念珠菌的菌絲生長被認為是導致口腔念珠菌病發病的原因之一[24]。結果表明,副干酪乳桿菌ET-22活菌及其后生元組分對白念珠菌菌絲的轉化具有一定的抑制效果。

2.2 副干酪乳桿菌ET-22活菌及其后生元組分的抗氧化能力分析

副干酪乳桿菌ET-22及其后生元組分的抗氧化能力見圖3。由圖3可知,副干酪乳桿菌ET-22活菌及其后生元組分對DPPH和羥自由基均具有清除能力,但清除能力差異較大。ET-22活菌對DPPH清除率極顯著高于熱滅活菌和分泌物(P<0.01),清除率分別為(92.96±1.00)%、(65.21±8.86)%和(11.86±2.64)%。ET-22活菌和熱滅活菌的DPPH自由基清除能力可能與菌體表面的化學物質,如表面蛋白或多糖有關,ET-22分泌物的清除能力可能與菌株分泌的胞外多糖等胞外代謝產物有關[25]。ET-22熱滅活菌體的羥自由基清除率極顯著高于ET-22活菌和分泌物(P<0.01),清除率可達(52.59±4.43)%;ET-22活菌與分泌物的清除率無顯著差異,分別為(29.31±3.43)%和(29.64±2.90)%。與關于完整活菌細胞對羥自由基的最高清除率為37.61%的研究報道基本一致[19]。結果表明,副干酪乳桿菌ET-22的菌體表面、胞內成分和胞外分泌物組分中均含有較多清除DPPH和羥自由基的活性物質。

**表示數據差異極顯著(P<0.01)。

2.3 白念珠菌誘導的小鼠舌部組織損傷分析

各組舌部組織狀態見圖4。由圖4可知,空白組舌部表面光滑、圓潤,為淡粉色,呈現正常形態;模型組舌部厚白色斑塊狀假膜覆蓋度大于91%,舌根部厚白色斑塊狀假膜明顯且有輕微脫落現象;ET-22活菌組舌部白色斑塊呈現點狀,覆蓋度小于20%,輕微腫大;ET-22熱滅活菌組和分泌物組舌部均出現了不同程度的白色斑塊。與空白組相比,模型組、熱滅活菌組和分泌物組舌部均出現了明顯腫大。各組舌部組織病變損傷評分見圖5。由圖5可知,模型組和3個實驗組(活菌、熱滅活菌和分泌物)的損傷評分分別為(3.10±0.88)、(1.67±0.87)、(2.60±1.17)、(2.11±0.93)分。與模型組損傷評分相比,所有益生菌干預組的損傷評分均呈現降低趨勢,ET-22熱滅活菌組和分泌物組與模型組相比分別降低了16.13%、31.94%;其中ET-22活菌組損傷評分顯著降低了46.13%(P<0.05)。結果表明:副干酪乳桿菌ET-22活菌及后生元組分對口腔念珠菌病均具有緩解效果,其中以ET-22活菌的效果最為顯著,活菌組舌部狀態與空白組最為接近。

圖4 白念珠菌誘導的小鼠舌部組織代表性病變分析Fig.4 Analysis of representative lesions of mouse tongue tissue induced by Candida albicans

*表示數據差異顯著(P<0.05)。

2.4 白念珠菌誘導的小鼠舌部組織狀態分析

采用組織學分析小鼠的舌部組織狀態,結果如圖6?？瞻捉M小鼠呈現正常的舌組織,而模型組小鼠表現出乳頭缺失、上皮脫屑、棘層松懈、組織增生及上皮內微膿腫等多種上皮病變及強烈的炎癥浸潤。ET-22活菌干預后,舌部組織棘層松懈和炎癥浸潤均減輕,上皮組織的保留程度與空白組接近;ET-22熱滅活菌組除乳頭缺失和上皮脫屑病變有輕微緩解外,其余病變及炎癥浸潤與模型組基本一致;ET-22分泌物干預后,舌部組織上皮脫屑病變消失,炎癥浸潤減輕。結果表明,副干酪乳桿菌ET-22活菌及其后生元組分可不同程度地緩解口腔念珠菌病的病變。此結果與副干酪乳桿菌28.4活菌緩解小鼠的口腔念珠菌病的結果一致[22]。

黑色圓圈為舌背部上皮細胞乳頭狀突起,紅色圓圈為組織增生,黑色箭頭為炎癥細胞浸潤部位,紅色箭頭為上皮脫落、損傷部位。

2.5 白念珠菌誘導的小鼠舌部組織細胞因子及趨化因子含量變化

采用小鼠多細胞因子檢測試劑盒對小鼠舌部組織中細胞因子及趨化因子的含量進行測定,結果見圖7。與模型組相比,ET-22活菌及其后生元組分干預后,促炎細胞因子IFN-γ和TNF-α含量均出現下降趨勢,其中ET-22分泌物干預后IFN-γ和TNF-α含量極顯著降低(P<0.01);ET-22活菌干預后TNF-α含量顯著降低(P<0.05);其余組則無顯著差異。研究發現,鼠李糖乳桿菌在提前飼喂21 d后,用白念珠菌進行侵染,同樣降低了組織中IFN-γ和IFN-γ細胞因子的含量[26]。與模型組和空白組相比,益生菌組的細胞因子IL-10和IL-6含量均無顯著差異。白念珠菌細胞膜部分蛋白質有效誘導CD4+T細胞分化為產生IL-17A的Th17細胞,繼而誘導EGFR和EphA2磷酸化,從而誘導上皮細胞分泌趨化因子CCL20刺激巨噬細胞遷移至病變部位[27-28]。與模型組相比,ET-22分泌物組趨化因子CCL20的含量無顯著差異,可能是由于上游的IL-17A含量偏低導致。ET-22活菌組和熱滅活菌組的IL-17A的含量均高于模型組,從而引起趨化因子CCL20的含量極顯著高于模型組(P<0.01)。結果表明,ET-22活菌和熱滅活菌可能在病變部位,通過激活Th17細胞分泌IL-17A,誘導上皮細胞分泌趨化因子CCL20,CCL20募集巨噬細胞吞噬白念珠菌,從而起到緩解口腔念珠菌病的作用。

*、#分別表示與空白組、模型組之間差異顯著(P<0.05),**、##分別表示與空白組、模型組之間差異極顯著(P<0.01)。

2.6 白念珠菌誘導的小鼠血清細胞因子含量變化

采用小鼠多細胞因子檢測試劑盒對小鼠血清中細胞因子的含量進行測定,結果見圖8。與模型組相比,益生菌干預后IFN-γ、IL-10和IL-17A含量均呈現下降趨勢,其中IFN-γ含量均極顯著降低(P<0.01),IL-10、IL-17A含量無顯著差異。與空白組相比,ET-22分泌物干預后IL-10含量顯著降低(P<0.05)。所有組別之間IL-4含量均無顯著差異。結果表明,副干酪乳桿菌ET-22活菌及其后生元組分對血清中IFN-γ細胞因子具有調節作用。

*、#分別表示與空白組、模型組之間差異顯著(P<0.05),**、##分別表示與空白組、模型組之間差異極顯著(P<0.01)。

2.7 小鼠舌苔表面菌株變化分析

采用16S rDNA對小鼠舌苔表面菌株進行分析,結果見圖9。比色卡的顏色梯度展示的是樣本中不同物種的豐度變化情況,可以得出模型組中腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、腸桿菌屬(Enterobacter)和變形桿菌屬(Proteus)豐度顯著高于空白組。ET-22熱滅活菌組中,與模型組相比,腸桿菌屬和腸桿菌科水平顯著上升;在ET-22活菌組顯著降低。研究發現,腸桿菌科的豐度上升與口腔念珠菌病的發生具有相關性,如腸桿菌科豐度的上升與復發性阿弗他口炎患者潰瘍的發生呈正相關[29]。

圖9 小鼠舌苔科水平和屬水平菌群組成Fig.9 Microbiota composition at family and genus level of mouse coated tongue

與空白組相比,模型組、ET-22活菌和分泌物組的擬桿菌科(Bacteroidaceae)和擬桿菌屬(Bacteroides)相對豐度顯著增加。研究發現,復發性阿弗他口炎患者黏膜菌群中擬桿菌屬的豐度顯著高于健康人群[30]。結果表明,副干酪乳桿菌ET-22活菌組對口腔念珠菌病引起的菌落變化具有調節能力。

基于bray-curtis在科、屬水平進行PCA分析,結果如圖10?？瞻捉M和ET-22活菌組的科水平在PC1(36.91%)軸上[圖10(a)],屬水平在PC2(31.43%)軸上[圖10(b)],與模型組存在顯著分離。ET-22分泌物組在科、屬水平組成與模型組完全重疊。結果表明,口腔念珠菌病與健康小鼠的舌苔菌群結構組成存在顯著差異;ET-22活菌可通過改善模型組舌苔菌群結構對口腔念珠菌病有預防作用。

圖10 小鼠舌苔微生物科水平和屬水平主成分分析Fig.10 PCA of mouse coated tongue microorganism at family and genus level

種水平的組間差異性分析結果見圖11。與空白組相比,模型組中奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、氣球菌(Aerococcusurinaeequi)、盲腸類桿菌(Bacteroidescaecimuris)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的相對豐度極顯著增加(P<0.01)。與模型組相比, ET-22熱滅活菌組顯著增加了乳酸乳球菌(Lactococcus)的相對豐度(P<0.05);ET-22活菌組顯著增加了副干酪乳桿菌的相對豐度(P<0.05),表明副干酪乳桿菌ET-22定植黏附在小鼠舌苔表面; ET-22活菌的加入明顯減少了克雷伯菌屬(Klebsiella)的相對豐度,而ET-22熱滅活菌則顯著增加了克雷伯菌屬的相對豐度。乳酸乳球菌可以通過分泌天然抗菌劑乳酸鏈球菌素抑制白念珠菌菌絲轉化和生物膜的形成[31];變形桿菌、氣球菌、糞腸球菌的檢出率及豐度在齲齒、牙周炎及其他口腔疾病中均顯著高于健康人群[32-33]。研究發現,克雷伯菌屬在牙周炎患者齦下菌群中豐度顯著上升,同時腸球菌屬和念珠菌屬豐度高于健康人群[34]。結果表明:ET-22活菌可通過在小鼠舌苔表面定植降低致病菌的豐度,ET-22熱滅活菌可通過增加有益菌豐度對小鼠舌苔菌群進行調節。

圖11 小鼠舌苔微生物種水平差異分析Fig.11 Difference analysis of mouse coated tongue microbiota at species levels

3 結 論

在體外共培養體系中,109CFU/mL的ET-22活菌及其后生元組分均能降低白念珠菌的出芽率和菌絲轉化能力,從而降低了白念珠菌的侵染能力,其中以ET-22活菌的抑制效果最佳。體外抗氧化結果中,ET-22活菌的DPPH自由基清除能力最強,熱滅活菌的羥自由基清除能力最強。

動物模型研究結果表明,副干酪乳桿菌ET- 22活菌、熱滅活菌及其分泌物均可以通過抑制白念珠菌,預防口腔念珠菌病的發生,尤其是ET- 22活菌的效果最好。ET-22活菌顯著降低了白念珠菌誘導的小鼠舌部組織中促炎因子IFN-γ和TNF-α的含量,并提高了趨化因子CCL20含量,同時調節小鼠舌苔菌群多樣性和豐富度,起到減輕舌部組織炎性浸潤和黏膜組織損傷的作用。ET- 22熱滅活菌和分泌物在抑制白念珠菌、預防口腔念珠菌病方面也具有一定的積極作用。ET-22熱滅活菌主要是通過提高趨化因子CCL20含量及調節小鼠舌苔菌群變化,而ET-22分泌物主要是通過降低了小鼠舌部組織及血液中促炎因子IFN-γ和TNF-α的含量起到一定的預防效果。目前應用于口腔健康的功能性食品還處于發展期,副干酪乳桿菌ET-22作為一株優良的口腔益生菌,其活菌和后生元成分的功能研究可為將來開發特異性功能食品配料或開發預防口腔疾病的功能性食品奠定一定的理論基礎。