雙峰駝感染魏氏梭菌與溶血性曼氏桿菌的防治

張學虎，宋福超，蘭 喜，張 勇

（1.張掖市動物衛生監督所，張掖 734000；2.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；3.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原學國家重點實驗室，蘭州 730046）

魏氏梭菌（Clostridium welchii）又稱產氣莢膜桿菌，可在一定條件下感染牛、綿羊、山羊、豬等多種家畜，引發腸毒血癥和壞死性腸炎［1］，臨床上常呈現發病較快、病程較短、死亡率高等特點［2］。溶血性曼氏桿菌（Mannheimia hoemolytic）舊名為溶血性巴氏桿菌，是引起牛、綿羊等反芻動物發生肺炎及急性敗血癥的重要病原［1］，常與支原體、巴氏桿菌等病原共同感染而引發犢牛、綿羊的支氣管肺炎，或羔羊的急性敗血癥，嚴重時可引起動物死亡，死亡率較高，在牛呼吸道綜合征中占30.5%［3］。

近年來，隨著國內畜禽市場經濟的日益繁榮和規模養殖的快速發展，該類病在消化系統類疾病和呼吸道類疾病中變得常見和多發，給養殖業健康持續發展造成了嚴重威脅。2017 年，甘肅酒泉地區報道了駱駝感染魏氏梭菌的病例［4］，但尚未見有駱駝感染曼氏桿菌的報道。本文以2022 年發生在甘肅省張掖市某養駝場的一起雙峰駝感染魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌為例，歸納整理了其發病過程、病原診斷及綜合防控等內容，旨在為養駝同行及畜牧獸醫工作者提供參考。

1 發病情況

2022 年5—7 月份，甘肅省張掖市某養駝場，陸續出現駝羔死亡的病例。經調查，該養駝場以駝羔繁育及駝奶生產為主，存欄雙峰駝440 峰，其中成年駝310峰，駝羔130 峰。發病及死亡病例均為2～3 月齡駝羔，先后死亡駝羔7 峰，其中5 月27 日、5 月28 日及6 月13日各死亡2 峰，7 月5 日死亡1 峰。發病及死亡病例以消化道和呼吸道癥狀為主，多表現為突然發病，8～10 h后死亡。

2 臨床癥狀及剖檢觀察

發病初期駝羔行走步態呈搖擺狀，后期臥地不起，多表現為精神不振、食欲減退，同時伴有干咳和腹瀉癥狀；病死時多表現為“醉酒”狀態。剖檢顯示，胃腸道及肺臟組織病變較為明顯，其中，皺胃有明顯潰瘍、胃黏膜脫落（圖1A），小腸有明顯的臌氣，腸壁菲薄且有出血（圖1B），腸系膜淋巴結有腫大可見（圖1C）；肺臟呈“大理石樣”病變（圖1D），剖面有膿性出血（圖1E）。胸腔及腹腔有少量積液可見，肝臟有輕微淤血，腎臟軟化且被膜易剝離（圖1F），剖面有輕微出血；心臟及脾臟未見明顯病變。

圖1 病死駝羔內臟剖檢病變觀察

3 實驗室診斷

3.1 血常規檢測

采集癥狀明顯駝羔的血液，使用動物生化分析儀（上海玉研科學儀器有限公司）進行血常規檢測。結果顯示，除血小板數量降低、中性粒細胞百分比升高、淋巴細胞百分比下降及白細胞總數略微升高外，其余指標均表現基本正常。初步懷疑為細菌性病原感染。

表1 發病駝羔血常規檢查結果

3.2 可疑菌染色鏡檢

將無菌采集的鼻拭子、內臟組織及腸內容物在超凈工作臺上進行預處理，使用劉心等［6］和楊志剛等［7］報道的方法進行細菌分離培養。將預處理后的病料分別涂抹于普通瓊脂平板和血瓊脂平板（購自青島海博生物技術有限公司），分別置于有氧和厭氧條件下37 ℃培養24 h。結果顯示，厭氧條件下血瓊脂平板上的菌落生長良好，可見半透明、表面光滑、中間凸起的菌落，且有溶血環；在有氧條件下，在兩種平板上均有菌落生長，多數為表面光滑的露珠狀菌落。挑取生長良好的菌落涂片，分別進行瑞氏染色、革蘭染色。鏡檢觀察發現，瑞氏染色后可見藍紫色球桿菌，革蘭染色后可見部分藍紫色粗大短桿菌，無芽孢。

3.3 病原核酸檢測

挑取3.2中的可疑菌斑，接種于液體培養基進行增菌培養，收集菌體使用核酸提取試劑盒（購自天根生物科技（北京）有限公司）提取全基因組DNA，以16S RNA為目的基因，參照石遠菊等［8］和王晨驍等［9］報道的檢測方法，進行疑似病原的核酸檢測。結果顯示，鼻拭子和肺組織中所分離的細菌，溶血性曼氏桿菌核酸呈陽性；腸內容物及淋巴結樣品中所分離的細菌，魏氏梭菌呈核酸陽性。

3.4 動物試驗

為確定毒素對本次發病是否有致死作用，收集腸內容物進行毒素檢查。選擇4 只健康小鼠隨機分為2組。取所采集的腸內容物5 mL，加等量的滅菌生理鹽水稀釋，4 000 r/min 離心15 min，在無菌條件下取上清液分為A、B 兩個組份；A 組份置于60℃條件下處理30 min，B 組份不做處理；后分別取A、B 組份各0.2 mL靜脈注射于小鼠體內，A 組份和B 組份各注射2 只小鼠，觀察記錄小鼠健康狀況。結果顯示，注射A組份的小鼠一直存活，而注射B組份的小鼠在8 h左右時開始死亡。

4 診斷結果

根據臨床癥狀及內臟剖檢病理變化，初步確定為呼吸系統及消化系統相關病原感染；經血常規檢測后發現為細菌性病原感染；進一步使用細菌培養及染色鏡檢觀察發現，革蘭陽性菌和革蘭陰性菌同時存在；最后使用PCR 法進行可疑病原基因檢測，發現有魏氏梭菌及溶血性曼氏桿菌目標條帶；結合毒素試驗進一步確定了本次發病與魏氏梭菌的關聯性。最終診斷本次發病是由感染了魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌所引起的。

5 防治措施

臨床檢查及解剖病理觀察后，立即指導場主按照“控制傳染源、切斷傳播途徑、保護易感畜”的原則，采取了病健分離、消毒滅源、緊急免疫和增強抵抗力等綜合性防控措施。

5.1 隔離治療

立即將有癥狀駝羔轉移至隔離圈舍，參考已報道的治療方法［6，8］和陳萌等［9-10］報道的藥敏試驗結果，選擇針對性藥物進行緊急治療。其中對于呼吸道癥狀明顯的駝羔，使用硫酸頭孢喹污粉劑（10 mg/kg體重）及氟尼辛甲胺（2 mL/100 kg 體重）進行肌肉注射，連續給藥3～5 d；對于有呼吸道癥狀并伴有腹瀉的駝羔，在上述給藥的基礎上，肌肉注射硫酸阿米卡星（2 mL/100 kg體重），并口服諾氟沙星（6～8 粒/峰），每日1 次，連續3～5 d。

5.2 緊急免疫

對隔離的健康駝群，采取緊急免疫和增強抵抗力等措施。一方面，使用羊三聯四防滅活苗（購自山東綠都生物科技有限公司）及牛曼氏桿菌病滅活疫苗（購自北京生泰爾科技股份有限公司）進行免疫接種，其中，羊三聯四防滅活苗每峰接種8 mL（駝羔減半）；牛曼氏桿菌疫苗每峰4 mL（駝羔減半）。為確保安全，在免疫前先選擇2～3 峰成年雙峰駝進行小范圍免疫試驗，待觀察24 h 無免疫副反應后再進行全群免疫。另一方面，使用雙黃連等清熱解毒類中藥制劑，通過精料拌服或飲水給藥，進一步提高駝群抵抗力，以防被傳染。同時，在飼料中添加適量微生態制劑，用來調節胃腸道菌群，以促進反芻和增加采食，進一步增強消化及吸收功能。

5.3 無害化處理和消毒滅源

及時將病死駝羔尸體、不潔墊料、污染飼料及舍內糞便，采取焚燒或深埋等方法進行無害化處理，避免病原擴散。同時，為徹底殺滅養殖環境中的病原，鞏固防治效果，避免二次感染，參考韓小麗等［11］和王麗娟［12］報道的方法，對圈舍、外環境及食槽水槽等進行徹底消毒。其中，隔離駝舍使用0.3%的過氧乙酸溶液或用聚維酮碘配成3%的碘溶液進行消毒；健康駝舍及外環境使用0.05%的次氯酸鈉及20%漂白粉溶液進行交替消毒；水槽、食槽及飼喂器具等使用20%漂白粉溶液進行消毒；每日1次，連續消毒1周。

6 討論

駱駝是戈壁、沙漠等荒漠地區的主要畜種，它既是荒漠地帶的主要運輸工具，也是當地游牧民族的主要奶源和肉源，其乳因富含蛋白質、礦物質、維生素等多種營養成分而被美稱為“沙漠白金”［13］。近年來，隨著人們對駝乳及其他駝制品需求的增加，加之荒漠旅游的逐步發展，舍飼養駝的比例也在逐步上升。受此影響，駱駝所感染的疫病也呈現為復雜性和多發性，給養駝業帶來了一定的威脅。據國內現有報道，駱駝所感染的重大疫病及人畜共患病主要有口蹄疫、布魯氏菌病、結核病、炭疽［14］及魏氏梭菌?。?］。此外，長期以來駱駝采取自由放牧方式，因而體外常寄生蜱蟲、原蟲等［15-16］，這些寄生蟲群體龐大、繁殖力強、宿主譜廣、攜帶病原復雜，進一步增加了駱駝感染疫病的風險。

6.1 疫病流行情況

魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌作為一類條件致病菌，常共棲于健康動物體內，當動物機體受到外源感染或氣候、運輸、飼喂等環境改變致使機體抵抗力下降時，它們常會迅速繁殖而破壞體內正常菌群而使機體發病。根據國內現有研究報道，魏氏梭菌感染牛、羊等家畜的病例較為常見。近年來，也有報道其感染東北虎［17］、小熊貓［18］及赤猴［7］等野生動物的病例，但關于雙峰駝感染魏氏梭菌的病例卻很少見。另外，近幾年河南省、新疆地區、西藏地區報道了牛、羊感染溶血性曼氏桿菌的病例。2021 年，甘肅省肅南沿山地區出現了牦牛感染溶血性曼氏桿菌的病例［19］，但目前尚未見有雙峰駝等荒漠類牲畜同時感染魏氏梭菌病和溶血性曼氏桿菌病的報道。在本病例中，首次確診了雙峰駝感染魏氏梭菌及溶血性曼氏桿菌，這提示該類病原在本地區的流行和發生呈復雜性和多樣性的趨勢，但對于其流行的主要血清型，有待于通過深入研究來確定。

6.2 病因分析

魏氏梭菌在自然界中分布廣泛。研究表明，氣溫驟變、飼養管理差或更換飼料等均可誘發魏氏梭菌病，污染的糞便是其主要的傳染源［12］。對于溶血性曼氏桿菌病而言，運輸應激、飼養管理差、氣候變化或外源感染等是其發病的主要誘因［11］。在本病例中，發病死亡駝羔以呼吸道和消化道癥狀為主。經詢問場主，該場周邊50 km 范圍內無其他養殖場，且養殖場周邊草場無放牧牲畜；場內近一年內無雙峰駝調入，且駝羔均為本場母駝所產；故排除外源傳染及長途運輸而發病的可能性。經與飼養員交談得知，曾在駝羔2 月齡以后，開始補飼以玉米為主的精料；現場調查發現，駝舍內飲水槽為廢舊鐵皮桶改造而來，且槽中飲水多日未更換，水槽衛生較差。經后續詢問得知，該養駝場由養羊場改造而來，場內設施及飼喂工具均沿用養羊場的，整體表現為舍內陰冷、通風不良及過于潮濕。綜合分析，引起本次發病的主觀原因是給幼駝補飼精料過早，加之飲水不潔，而使駝羔消化不良而發??；潛在原因是因消毒滅源不徹底，養殖環境中可能存在前羊場遺留的病原或芽孢；客觀原因是養殖環境差、飼養管理粗放。但是否是由于感染了魏氏梭菌而繼發產生了曼氏桿菌病，尚有待于通過動物回歸試驗來確定。

6.3 病原診斷

快速而準確地找出病原，是臨床上實施針對性防治的前提。家畜血液中的中性粒細胞、淋巴細胞等白細胞，對外來細菌具有吞噬、分解作用［20］，在機體的特異性免疫和非特異性免疫中發揮著重要作用［21］。因此，可依據白細胞等血液生化指標的變化，對機體感染微生物的情況進行初步判斷。在本病例中，駝羔血液中的中性粒細胞及淋巴細胞百分比在發病初期表現為升高，發病后期有呈現降低趨勢，這可能與溶血性慢性桿菌可特異性溶解反芻動物的白細胞和血小板有關［1］。病原菌的分離培養是確診病原的常用方法，通過對培養后的可疑菌進行菌落觀察和菌體染色觀察，可進一步縮小病原菌的范圍。在本病例中革蘭陽性菌和革蘭陰性菌同時存在。為盡快確定病原，筆者使用普通PCR 檢測方法對可疑菌進行了16S RNA 核酸檢測，將病原鎖定為魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌。但也有研究報道，非魏氏梭菌致死的家畜也容易在死后被魏氏梭菌侵染［1，2，22］。因此，檢出本菌也并不能說明它就是病原［1，22］。隨后，筆者通過動物試驗進行了腸內容物毒素檢查，進一步驗證了毒素與本次駝羔死亡的關聯性。但對于所感染魏氏梭菌的型別和毒素的類別，由于試驗條件有限，未進行深入的毒素中和保護試驗。

6.4 綜合防治

魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌病都具有超急性、病程短、死亡率高等特點［23-24］，犢牛、羔羊等幼畜是主要發病群體。目前，由魏氏梭菌引起的腸毒血癥，和由溶血性曼氏桿菌引起的肺炎及急性敗血癥，已呈全球性分布［25-26］。由于這類病發病急、死亡快，發病后常來不及治療，因此，“早發現、早隔離、防重于治”仍是當前控制該類病的主要措施。研究表明，該類病原作為一類條件治病菌，易受飼養環境差或氣候因素變化而發病，因此，提供良好的飼養環境并根據病原的流行特點及時進行疫苗接種，對于預防該類病具有重要意義。在本病例中，由于場區環境差、飲水不潔，加之補飼精料過早而導致發病。發病后，立即組織實施了“病健分離、緊急免疫、消毒滅源、改善環境”等綜合防治措施，在第一時間內無害化處理了病死駝羔及其污染物；并使用不同消毒劑對養殖環境及飼喂工具進行了更替消毒；更換為精料補充料進行飼喂，同時將飲水槽更換為橡膠材質的或陶瓷材質的，定期清潔水槽做到飲水干凈衛生；最后，對健康駝群接種疫苗進行緊急免疫，逐步控制了病情。

7 結論

經過現場流行病學調查、臨床檢查及剖檢觀察，同時結合實驗室檢測方法，確定了本次發病是由于感染了魏氏梭菌及溶血性曼氏桿菌引起的；發病誘因與飼養管理不當存在很大的關聯性。通過實施病健分離、隔離治療、緊急免疫及消毒滅源等綜合性防治措施后，該養駝場駱駝的病情逐步得到控制并恢復了生產。