綿羊源溶血性曼氏桿菌A2型的分離鑒定及耐藥性分析

梁纖纖，鄭啟銘，李曉卓，馮繼紅，李 月，劉文鍇，韓翔舒，阿卜杜熱合曼·努爾麥麥提，蘇戰強*，夏 俊*

（1.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830000；2.新疆昌吉呼圖壁縣農業農村局，新疆 昌吉 831100；3.新疆畜牧科學院獸醫研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫學研究中心，烏魯木齊 830000；4.農業農村部草食動物疫病防控重點實驗室（省部共建），烏魯木齊 830000；5.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832061）

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica，MH）是巴氏桿菌科曼氏桿菌屬的革蘭氏陰性菌，寄生在反芻動物的上呼吸道中，能夠導致動物肺炎乃至死亡，屬于條件性致病菌，宿主常常在斷奶、惡劣天氣、運輸等應激情況下發病[1]。MH共分12個血清型，臨床分離株主要以A1、A2、A6為主[2]，A1通常在牛呼吸道檢出，而A2、A6為感染羊的主要血清型[3]。由MH引起的牛、羊等反芻動物的呼吸道疾病具有較高發病率和死亡率，給我國乃至全世界的養殖產業造成嚴重的經濟影響[4]。國內外關于溶血性曼氏桿菌病的報道較多，也有學者進行關于MH 的滅活疫苗的研究，但由于各血清型之間交叉免疫保護性較低，疫苗的免疫譜窄，疫苗保護效果不理想，目前該病仍缺乏有效的防治手段[5，6]。本研究采集病死綿羊肺臟組織進行細菌分離鑒定、病原學研究、小鼠致病性分析和藥敏試驗，為后續MH的實驗室診斷及疫苗的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

阿勒泰地區某羊場部分羊只出現咳嗽氣喘、精神萎靡、體溫升高等臨床癥狀，病死羊只剖檢可見肺臟嚴重充血。送檢病死綿羊肺臟組織4份。

1.1.2 主要材料

馬丁肉湯培養基購自青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自索萊寶科技有限公司；DL2000核酸Marker購自賽國生物科技有限公司；藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗動物

18～22 g健康雌性BALB/c小鼠12只，購自新疆維吾爾自治區疾病預防與控制中心實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養與純化

在超凈工作臺中嚴格無菌操作，將肺臟組織接種于馬丁肉湯瓊脂培養基中，37 ℃恒溫培養過夜。過夜培養后挑取半透明狀單菌落再次接種于馬丁肉湯液體培養基中，37 ℃恒溫培養16～18 h，觀察生長情況，并將純化培養后的細菌進行革蘭氏染色，鏡檢觀察其形態。

1.2.2 PCR鑒定及血清型鑒定

使用文獻建立的MH特異性[7]PCR 方法進行鑒定，經鑒定后采用KLIMA等[8]建立的MH A1、A2和A6 血清型特異PCR 方法，對MH 血清型進行鑒定，引物序列如表1。反應體系為常規50 μL，瞬離后混合均勻置于PCR 擴增儀中，反應條件為95 ℃預變性3 min，94 ℃循環變性30 s，退火溫度為58 ℃復性20 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環，72 ℃終延伸5 min，最后于4 ℃保存。配制1%瓊脂糖凝膠進行電泳，參照DNA 2000 Marker，判斷產物的序列大小是否與目標值一致。PCR擴增產物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結果于NCBI進行BLAST。

表1 引物序列

1.2.3 藥敏試驗

采用K-B 紙片法檢測MH 分離株對20 種抗菌藥物包括青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環素、阿奇霉素、林可霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、多黏菌素B、諾氟沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明進行敏感性測定。吸取200 μL細菌純培養物，均勻涂布于馬丁肉湯瓊脂培養基上，吸收5 min 后，將藥敏片等距貼于培養基上進行藥敏試驗。于37 ℃恒溫培養18 h后判定結果，藥敏結果判定按CLSI標準。

1.2.4 小鼠致病性試驗

使用活菌計數法測得該分離株的含菌量為1.664×109CFU，將12只小鼠隨機分為兩組，A組每只腹腔注射0.2 mL 分離株純培養物，B 組每只腹腔注射相同劑量的無菌PBS。觀察小鼠精神狀態，如出現死亡，立即剖檢觀察肺臟病理變化，并采集死亡小鼠心血及肺臟組織進行細菌分離培養及鑒定。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養與純化

將肺臟組織接種于馬丁肉湯培養基恒溫培養后，可見露滴狀、表面光滑、邊緣整齊、呈正圓形的半透明菌落，挑取單菌落接種馬丁肉湯液體培養基恒溫培養后，進行革蘭染色，鏡檢可見短桿狀、粉紅色兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌。見圖1，圖2。

圖1 馬丁肉湯瓊脂培養基培養結果

圖2 革蘭氏染色鏡檢（物鏡100×）

2.2 PCR鑒定及血清型鑒定

細菌純培養物經MH 特異性PCR 擴增后獲得約206 bp 大小目的條帶，見圖3，再進行血清型鑒定，得到約106 bp大小目的條帶，見圖4，與血清A2型目的條帶大小相符，因此判定該分離株為A2型菌株。

圖3 分離株特異性PCR鑒定結果

圖4 分離株血清型PCR鑒定結果

2.3 致病性試驗

試驗組6 只小鼠注射菌液6 h 后開始出現精神萎靡，眼部分泌紅黃色炎性物質，排黃色混濁尿液，隨后幾小時內陸續出現死亡，15 h內全部死亡。對照組小鼠24 h內全部存活，無異常表現。將死亡小鼠剖檢，采集心血和肺臟組織進行細菌分離鑒定，與MH相符。

2.4 藥敏試驗

藥敏結果如圖5、圖6所示，該分離株對青霉素、頭孢唑林、氨芐西林敏感；對包括頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、阿奇霉素、多黏菌素B、諾氟沙星、環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明、氟苯尼考、克林霉素、林可霉素、阿米卡星、氯霉素、四環素、卡那霉素在內的17種抗菌藥物耐藥。

圖5 藥敏試驗1

圖6 藥敏試驗2

3 討論與結論

隨著新疆養羊業的蓬勃發展，養殖規模不斷擴大，羊患病的風險也日益突出，尤其是羊呼吸系統疾病，主要由支原體、巴氏桿菌和曼氏桿菌引起。曼氏桿菌不僅能使羔羊發病，也能感染成年羊，一旦發病，病羊則會消瘦、咳嗽氣喘，嚴重者還會死亡，制約了新疆養羊業的發展。國內外關于牛曼氏桿菌的報道很多，關于羊的研究卻不夠全面。目前有學者研究關于羊曼氏桿菌的滅活疫苗，臨床使用效果卻不佳，可能是由于血清型不同，難以達到交叉保護的效果，要制備具有交叉保護效果的疫苗，關于曼氏桿菌血清型的研究必不可少。聶荷蓮[9]等的研究中說明溶血性曼氏桿菌A2型的主要來源是羊，江蘇地區的溶血性曼氏桿菌A2 型也是來源于羊。本研究從新疆地區的綿羊中也分離到了溶血性曼氏桿菌A2型，為后續曼氏桿菌的研究和疫苗制備提供參考。

本研究中的分離株僅對青霉素、頭孢唑林、氨芐西林敏感，對其他頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環內酯類、多肽類、喹諾酮類、磺胺類、氯霉素類、林可酰胺類、四環素類等多種抗菌藥耐藥，可能是由于新疆地區治療溶血性曼氏桿菌病僅依靠抗菌藥物，導致多重耐藥性的產生。郜敏[10]等的研究顯示四川MH分離株鏈霉素、阿奇霉素、頭孢氨芐、恩諾沙星和頭孢噻吩耐藥，其中復方新諾明耐藥性最強。本研究耐藥性的結果與該研究基本一致，但與馮旭飛[4]等報道中MH 分離株對四環素、氟苯尼考、氧氟沙星、恩諾沙星等大部分藥物敏感的結果存在很大差異，可能由于養殖過程中大量使用相關抗菌藥物有關。本研究中的MH存在多重耐藥性，可為后續MH耐藥基因的研究提供參考，本研究藥敏試驗結果也說明該養殖場對于溶血性曼氏桿菌病的治療用藥情況需要改進。