霧水葛總黃酮的提取工藝優化及其對線蟲應激能力的影響

吳冬凡，李美其，王艷

（廣東藥科大學廣東省化妝品工程技術研究中心，廣東 廣州 510006）

霧水葛為蕁麻科植物霧水葛Pouzolzia zeyl‐anica（L.）Benn.的帶根全草，為嶺南特色藥材，具有清熱解毒、清腫排膿、利水通淋等功效，主要用于治療瘡瘍癰疽、乳癰、風火牙痛、痢疾、腹瀉、小便淋痛、白濁、消腫毒排膿[1?2]。

研究表明霧水葛的主要活性成分為黃酮、木脂素、萜類等，且黃酮類化合物大多為黃酮苷類[3?4]。黃酮類化合物在抗感染、抑制腫瘤、保護血管等方面發揮著重要的作用[5?8]。Wang Lujun等[9]用2，2-二苯基-1-苦基肼自由基清除法和鐵還原抗氧化法測得總黃酮、酚類具有較好的抗氧化性。

現代醫學研究表明，隨著年齡增長，體內代謝速度變得緩慢，會產生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[10]。而當機體內的ROS 過量時，就會誘導機體發生氧化應激，從而對細胞結構及生物分子功能造成重大損傷，進而直接或間接導致多種疾病的產生[11?12]。因此，研究改善氧化損傷所造成的衰老及衰老疾病的天然抗氧化物，對延緩衰老和預防相關疾病的產生有很大好處[13]。

秀麗隱桿線蟲是研究衰老的經典生物模型，具有體型小、壽命短、基因組完全測序，以及含有超過65%的人類疾病相關基因等優點[14]。因此在抗氧化和延緩衰老研究領域具有明顯優勢，被廣泛應用于抗衰老、藥物篩選和神經系統疾病等各方面的研究[15]。因為秀麗隱桿線蟲在衰老過程中表現出許多和人類高度相似的特征，包括神經退化、運動能力減退和降低免疫力等，因此本試驗選用霧水葛總黃酮喂食秀麗隱桿線蟲，通過對其壽命、運動能力、應激實驗等方面進行研究，探究霧水葛總黃酮的抗衰老作用機理，以期為霧水葛進一步研究與開發利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE52C 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），THZ-300 恒溫培養搖床（上海一恒科學儀器有限公司），WGZ-XT 智能細菌濁度儀（杭州齊威儀器有限公司），AS5150A 超聲波清洗機（天津奧特塞恩斯儀器有限公司），TDL80-2B 臺式高速離心機（上海安亭科學儀器有限公司），U-3900 紫外可見分光光度計（株式會社日立制作所），SHA-B 恒溫水浴搖床（常州澳華儀器有限公司），HPX-9082MBZ 恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），SMZB4連續變倍體視顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司），KB-1102G2光照振蕩培養箱（匡貝實業上海有限公司），SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 材料

蘆丁對照品（成都埃法生物科技有限公司，批號：153.18.4），野生型秀麗隱桿線蟲（N2）于2022 年11月購于廈門大學實驗室，大腸桿菌E.coilOP50（山東中科嘉億生物工程有限公司，ATCC11411），蛋白胨（北京奧特星生物技術有限責任公司），酵母浸膏、MRS 肉湯（廣東環凱生物科技有限公司），NGM培養基、培養基添加劑S2229（山東拓普生物工程有限公司），水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

霧水葛藥材于2022 年6 月購于中山市仙逸堂中藥飲片有限公司，經廣東藥科大學中藥學院何夢玲副教授鑒定為正品蕁麻科植物霧水葛Pouzolzia zeylanica（L.）Benn。

2 方法

2.1 霧水葛總黃酮的含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 藥材前處理：將霧水葛全草用萬能粉碎機粉碎，過60目篩，混勻，得到霧水葛細粉。分別在2個1 000 mL圓底燒瓶中加入50 g霧水葛細粉，按料液比1∶8 加入400 mL 石油醚，回流1 h，抽濾除去石油醚，濾渣加入400 mL 石油醚，繼續回流1 h，抽濾除去石油醚，將2 份濾渣合并混勻，將細粉放入鼓風干燥箱中，于30 ℃揮干石油醚后，收集于干凈錐形瓶中密封，備用[16]。

取霧水葛脫脂粉末1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，平行3 份，按料液比1∶8 加入70%（體積分數，下同）乙醇8 mL，在80 ℃、240 W 下，超聲提取1 h，提取2次，抽濾，合并濾液。使用旋蒸發儀濃縮回收乙醇，并經4 000 r/min 離心15 min，收集上清液于20 mL容量瓶中，用超純水定容，制成生藥質量濃度為0.05 g/mL的供試品溶液。

2.1.2 蘆丁對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10.8 mg，置于50 mL容量瓶中，加95%乙醇定容，搖勻，即得質量濃度為0.216 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。

2.1.3 顯色反應 參照李曉雪等[17]的方法，分別量取對照品溶液0、2、4、6、8、10 mL 分別置于6 個25 mL容量瓶中，加95%乙醇至10 mL，加5%（質量濃度）NaNO2溶液1 mL，搖勻。放置5 min 后，加10%（質量濃度）Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加入4%（質量濃度）NaOH 溶液10 mL，加水稀釋至刻度線，搖勻，放置15 min顯色。

2.1.4 檢測波長的確定 分別精密吸取蘆丁對照品、供試品溶液各5 mL，按“2.1.3”項下方法進行顯色操作，經紫外-可見光分光光度計在400～800 nm的吸收波長范圍內進行波長掃描，結果最大吸收波長為507 nm。

2.1.5 標準曲線的繪制 分別精密量取蘆丁對照品溶液0、2、4、6、8、10 mL，分別置于6個25 mL容量瓶中，使蘆丁的質量濃度分別為0、0.017、0.034、0.051、0.068、0.102 mg/mL，按“2.1.3”項下方法操作。以第1 個容量瓶的溶液為空白對照，在最大吸收波長上測定各質量濃度溶液的吸光度，用空白對照組調零，每組平行操作3次，以質量濃度（ρ）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線。得回歸方程A=12.664ρ+ 0.002 2，r=0.999 8，結果顯示，蘆丁在0.01～0.05 mg/mL范圍內具有較好線性關系。

2.1.6 方法學考察

2.1.6.1 精密度試驗 量取蘆丁對照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，按“2.1.3”項下方法操作，在最大吸收波長507nm 測定A 值，重復操作6 次，結果RSD為1.619%，表明方法精密度良好。

2.1.6.2 穩定性試驗 量取供試品溶液2 mL，置于25 mL 容量瓶中，按“2.1.3”項下方法操作，在0、15、30、45、60 min 時，分別在507 nm 測定A 值，結果RSD為2.100%，表明方法穩定性良好。

2.1.6.3 重復性試驗 分別量取供試品溶液2 mL 6份，置于6個25 mL 容量瓶中，按“2.1.3”項下方法操作，在507 nm 測定A 值，結果RSD 為0.532%，表明方法重復性良好。

2.1.6.4 加樣回收率試驗 分別量取供試品溶液2 mL、蘆丁對照品溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，搖勻，操作6份。按“2.1.3”項下方法顯色，在507 nm測定A 值，代入“2.1.5”項下的標準曲線中，計算回收率，結果RSD值為1.43%，表明方法加樣回收率較好，結果見表1。

表1 霧水葛中總黃酮的加樣回收率試驗結果Table 1 Results of recovery of total flavonoids of Pouzolzia zeylanica（L.）Benn

2.1.7 霧水葛總黃酮提取率的測定 將測得的吸光度代入回歸方程，計算出提取液中總黃酮的質量濃度，再根據公式（1）計算出霧水葛總黃酮的提取率。

式（1）中，c為測得的吸光度；b、k為回歸方程參數；N為稀釋倍數；V為提取液體積，單位為mL；m為樣品質量，單位為mg。

2.2 單因素考察

2.2.1 單因素試驗方法 按表2所示條件，進行霧水葛總黃酮提取，抽濾，合并濾液。使用旋轉蒸發儀濃縮回收乙醇，并以4 000 r/min離心15 min，收集上清液于20 mL容量瓶中，用超純水定容，制成生藥質量濃度為0.05 g/mL的供試品溶液，每個因素水平重復提取3次。按“2.1.3”“2.1.4”項下方法顯色、測定，計算總黃酮提取率。

表2 單因素試驗因素表Table 2 Single-factor table

單因素考察結果表明，霧水葛中總黃酮的提取率隨著乙醇體積分數的升高先升高后降低，在乙醇體積分數為60%時有最大提取量?？傸S酮提取率隨料液比增加而升高，當料液比增大至1∶32時達最大值，后趨于平緩的趨勢?？傸S酮提取率隨溫度增加而升高，當提取溫度為60 ℃時，此時總黃酮質提取率達最大值?？傸S酮提取率在提取時間為30～50 min 時，隨時間增加而升高，在50 min 后總黃酮提取率開始下降。

2.3 正交法優化霧水葛總黃酮提取工藝

2.3.1 正交試驗設計 為了更好考察超聲法的工藝參數對霧水葛總黃酮提取的影響，根據單因素考察結果，選取提取乙醇體積分數、提取時間、提取溫度、料液比為考察因素，以霧水葛總黃酮提取率為指標，設計L9（34）正交實驗來確定霧水葛總黃酮的最佳提取工藝，正交實驗因素水平表見表3，結果見表4－5。

表3 霧水葛總黃酮提取的正交實驗因素水平表Table 3 Orthogonal experimental factor level of total flavo‐noids of Pouzolzia zeylanica（L.）Benn

表4 L9（34）正交試驗結果Table 4 L9（34）Orthogonal experimental results

表5 方差分析表Table 5 Variance analysis table

由表可知，霧水葛總黃酮提取率影響因素按大小排序為D＞C＞B＞A，即料液比＞乙醇體積分數＞提取溫度＞提取時間。最佳提取工藝參數為A1B3C2D3，即：提取時間為40 min，提取溫度為70 ℃，乙醇體積分數為60%，料液比為1∶40 g/mL。

由表4可知，A、B、C、D 4個因素F值均大于F0.01（2，2）=99，說明提取時間、提取溫度、乙醇體積分數、料液比這4 個因素對霧水葛總黃酮提取率的影響都有統計學意義（P＜0.01），因此選擇這4 個因素作為霧水葛總黃酮提取工藝的考察指標合理。

2.3.2 驗證試驗 稱取霧水葛脫脂粉末1.0 g置于錐形瓶中，按料液比1∶40加入70%乙醇，在60 ℃、240 W條件下，超聲提取40 min，共2 次，抽濾，合并濾液。使用旋蒸發儀濃縮回收乙醇，并經4 000 r/min 離心15 min，收集上清液于20 mL 容量瓶中，用超純水定容，制成生藥質量濃度為0.05 g/mL 的供試品溶液，重復提取3 次。按“2.1.3”“2.1.4”項下方法顯色、測定，計算總黃酮提取率。

結果顯示，在最佳提取條件下霧水葛總黃酮提取率可達1.306%，比正交試驗中最高提取率相對升高7.76%，RSD=0.63%，表明該提取工藝可靠穩定。

2.4 線蟲試驗

2.4.1 溶液的配制 NGM培養基：稱取NGM培養基2.26 g于三角瓶中，加入超純水100 mL，加熱煮沸至完全溶解，于120 ℃高壓滅菌15 min后，將培養基置于60 ℃水浴鍋中恒溫1 h，加入配套添加劑A 液、B液各1瓶，搖勻，分裝于已滅菌培養皿中，冷凝備用。

M9 緩沖液：稱量NaCl 5 g、KH2PO43 g、Na2HPO4·12H2O 15.12 g，用超純水定容至1 000 mL，分裝，高壓蒸汽滅菌，備用。

線蟲凍存液：取甘油與超純水按體積比1∶1 混合得50 mL，分裝到試管，于120 ℃高壓滅菌15 min，冷卻備用。

裂解液：稱量NaOH 4.0 g 溶解于100 mL 超純水中，與次氯酸鈉溶液按體積比1∶1混合均勻，現配現用。

2.4.2 食物大腸桿菌E.coil OP50 的培養 將大腸桿菌E.coil OP50 甘油保種液劃板于LB 固體培養基上，置于37 ℃恒溫培養箱中，培養24 h，挑取長勢較好的單菌落接種于10 mLLB 液體培養基中，置于37 ℃、轉速為130 r/min的恒溫搖床中，培養10 h，取出，轉移至滅菌離心管中，在8 000 r/min 下，離心1 min，倒掉上清液，加入滅菌超純水重懸，洗滌2次，調整菌液A值至0.4～0.6。

2.4.3 線蟲的復蘇和保種 將線蟲凍存液從?80 ℃冰箱取出，放在4 ℃冷藏室融化。吸取200 μL 線蟲凍存液于含OP50 的NGM 培養基（涂布OP50 時，涂布面積要與培養皿留一定的空隙，避免線蟲爬上玻璃皿壁而缺水死亡）中，幾分鐘后就可以看到有線蟲開始爬行。復蘇培養3 d 后，培養基上會長出大量線蟲，通過切塊將線蟲轉移到新的含OP50 的NGM培養基中，進行傳代。

用M9 緩沖液4 mL 將同期化或產卵高峰期后培養2 d 的線蟲從NGM 培養基沖洗下，收集于滅菌的15 mLEP 管中，于2 000 r/min 離心1 min，棄上清液，再加入M9 緩沖液4 mL 重懸清洗2 次，棄上清液，在沉淀中加入M9 緩沖液1 mL，按1∶1（體積比）加入50%甘油，混勻，分裝于2 mL 凍存管中，用封口膜封口。將凍存管放入泡沫箱中，再將箱子放入?80 ℃冰箱凍存，避免速凍導致線蟲死亡。

2.4.4 線蟲的同期化 用M9 緩沖液2 mL 沖洗處于產卵高峰期的NGM 板，共沖洗2 次并收集于15 mL尖頭EP 管中，自然沉降后，棄上清液，繼續用M9 緩沖液4 mL 反復沖洗2 次，棄上清液。然后加入M9緩沖液2 mL、裂解液2 mL，振蕩3 min，以5 500 r/min 離心30 s，棄上清液。加入M9 緩沖液2 mL 進行重懸清洗，以5 500 r/min離心1 min，棄上清液，重復沖洗2次充分除去裂解液，在沉淀中加入M9緩沖液1 mL，置于20 ℃培養箱中，培養12 h。待卵孵化后，轉移至含有OP50 的NGM 培養基中，每個板上分裝溶液400 μL，即可得到同期化線蟲。

2.4.5 霧水葛提取液對OP50 生長的影響 將大腸桿菌甘油保種液劃板于LB 固體培養基上，置于37 ℃恒溫培養箱中，培養24 h，挑取長勢較好的單菌落接種于10 mL LB液體培養基中，置于37 ℃，轉速為130 r/min 的恒溫搖床中，培養10 h，取出。將3瓶已滅菌20 mL LB 培養基分為空白組、實驗組1、實驗組2，在空白組中加入400 μL上述培養好的菌，在實驗組1 加入400 μL 上述培養好的菌和800 μL總黃酮質量濃度為0.450 mg/mL 霧水葛的提取液，實驗組2 加入400 μL 上述培養好的菌和400 μL 總黃酮質量濃度為0.450 mg/mL 霧水葛的提取液，混勻，吸取2.5 mL在600 nm處測量其吸光度值。余下溶液將瓶口密封放在37 ℃、轉速為130 r/min 的恒溫搖床中培養。每隔一小時吸取2.5 mL，在600 nm處測量其吸光度值，共6 次，將3 組菌液分別減去初始吸光度值，繪制大腸桿菌生長曲線[18]。見圖1。

圖1 總黃酮提取液對OP50生長的影響Figure 1 The effect of total flavonoid extract on the growth of OP50

由結果可知，霧水葛總黃酮提取物并無明顯抑制OP50 生長的情況，在1 h 之后，空白組和實驗組的OP50 均進入生長對數期。因此，霧水葛總黃酮提取液不會導致線蟲產生熱量限制而出現假陽性的情況。

2.4.6 含藥培養基的配制 將霧水葛總黃酮提取物過微孔濾膜除菌，用滅菌超純水將提取液稀釋成總黃酮質量濃度為0.450 mg/mL 的提取液，分別與OP50 菌液按體積比1∶2 混合配制成總黃酮質量濃度分別為0.300（實驗組1）、0.225 mg/mL（實驗組2）的霧水葛總黃酮溶液，吸取400 μL 涂布于NGM 培養基上，即得。

2.4.7 霧水葛總黃酮提取液對線蟲運動能力的影響將同期化的線蟲培養3 d后，用挑蟲器挑取20條線蟲至分別含有0 mg/mL、0.225 mg/mL、0.300 mg/mL霧水葛總黃酮提取物的NGM 培養基中，每組3 個板。培養3 d 之后，挑取線蟲放在10 μLM9 緩沖液中，觀察并記錄10 s線蟲頭部擺動的次數。

結果（見圖2）顯示，與空白組相比，0.300 mg/mL霧水葛總黃酮增加線蟲頭的擺動次數有統計學意義（P＜0.01）；0.225 mg/mL 霧水葛總黃酮能增加線蟲頭擺動次數，但與空白組相比，差異無統計學意義。0.300 mg/mL 霧水葛總黃酮組與0.225 mg/mL霧水葛總黃酮組相比，差異也具有統計學意義（P＜0.05），表明在一定質量濃度范圍內增加霧水葛總黃酮給藥量能增加線蟲頭擺動次數。

圖2 總黃酮提取液對線蟲運動能力的影響Figure 2 The effect of total flavonoid extract on locomotor ability of nematode

2.4.8 H2O2誘導的急性氧化應激試驗 將同期化的線蟲培養3 d 后，用挑蟲器挑取30 條線蟲至分別含有0、0.225、0.300 mg/mL 霧水葛總黃酮提取物的NGM 培養基中，每組3個板。培養3 d之后，將各培養基中的線蟲重新挑到空白培養基中，然后在各培養基中加入0.2%的30%H202溶液1 mL，開始計時，每隔1 h 計數1 次，挑出死亡線蟲并計數，直至線蟲全部死亡（丟失、貼壁的線蟲為異常數據，不計入死亡統計中），繪制線蟲存活時間曲線[19]。結果見表6。

表6 急性氧化應激下不同質量濃度總黃酮提取物對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Table 6 Effects of total flavonoids extracts with different mass concentrations on the lifespan of cryptomeria elegans under acute oxidative stress

結果表明，在急性H2O2氧化損傷下，與空白組比較，0.300 mg/mL 霧水葛總黃酮能提高線蟲的平均壽命、中位壽命及最高壽命，差異有統計學意義，平均壽命延長率達32.28%；0.225 mg/mL 霧水葛總黃酮能提高線蟲的平均壽命、中位壽命及最高壽命，但差異無統計學意義。這表明一定質量濃度范圍內的霧水葛總黃酮能提高線蟲對H2O2的耐受力，從而延長壽命。線蟲抗氧化應激生長曲線見圖3。

圖3 總黃酮提取液抗線蟲氧化應激作用的影響Figure 3 The effect of total flavonoid extract on antioxidative stress of nematodes

2.4.9 熱應激試驗 將同期化的線蟲培養3 d 后，用挑蟲器挑取30 條線蟲至分別含有0、0.225、0.300 mg/mL 霧水葛總黃酮提取物的NGM 培養基中，每組3 個板。培養3 d 之后，將各培養基中的線蟲重新挑到空白在培養基中，放置于35 ℃培養箱中進行應激，每隔1 h計數1次，挑出死亡線蟲并計數，直至線蟲全部死亡（丟失、貼壁的線蟲為異常數據，不計入死亡統計中），繪制線蟲存活時間曲線。結果見表7、圖4。

圖4 總黃酮提取液抗線蟲熱應激作用的影響Figure 4 The effect of total flavonoid extract on the heat stress resistance of nematodes

表7 急性熱應激下不同質量濃度總黃酮提取物對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Table 7 Effects of total flavonoids extracts with different mass concentrations on the lifespan of cryptomeria elegans under acute heat stress

由結果可知，在急性熱應激損傷下，與空白組比較，0.300 mg/mL霧水葛總黃酮組線蟲能增加線蟲的平均壽命、中位壽命及最高壽命，差異有統計學意義，平均壽命延長率達42.96%。0.225 mg/mL 霧水葛總黃酮組線蟲的平均壽命、中位壽命及最高壽命也高于空白組，但差異無統計學意義，表明霧水葛總黃酮能增強線蟲抗熱應激的能力，但受劑量影響。

2.5 統計分析

采用SPSS 26.0 軟件進行t檢驗分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 討論

在單因素考察試驗中，因為霧水葛中的黃酮化合物主要為黃酮苷，水溶性比脂溶性稍好，所以當乙醇體積分數超過60%時，提取液中的成分更多為脂溶性成分，脂溶性成分溶出率提高會影響總黃酮的提取，從而使總黃酮提取率降低。剛開始料液比升高時總黃酮提取率也會升高，可能是因為藥材與溶劑之間的濃度差升高，接觸面積增大，有利于總黃酮從藥材中溶出。當料液比達到1∶32時，藥材中的總黃酮基本被提取出來，繼續升高料液比可能會導致其他物質的溶出從而抑制總黃酮提取，加之后續抽濾、濃縮的時間也會延長，工作成本升高。霧水葛總黃酮提取率隨提取時間、溫度升高先升高后降低，因為加熱能夠促進霧水葛中總黃酮的溶出，提取時間過短，藥材中的總黃酮還沒有完全溶出，但提取溫度過高、時間過長，會導致某些成分被破壞分解，總黃酮提取率下降。

食物減少會出現熱量限制，影響胰島素樣生長因子通路的作用，使線蟲壽命延長。為避免因霧水葛總黃酮提取物抑制OP50 生長而出現線蟲壽命延長的假陽性結果，故將霧水葛總黃酮提取物與OP50混合培養，觀察在飼喂霧水葛總黃酮提取液時食物是否達到熱量要求。由結果可知，霧水葛總黃酮不會抑制OP50生長。

隨著年齡的增長，細胞氧化損傷而引起其抗氧化功能紊亂。氧化應激在衰老相關疾病發作中起著重要作用，抗氧化劑能夠減弱或預防衰老所帶來的影響[20]。研究發現，黃酮類化合物通過作用于部分信號通路分子調控機體抗氧化[21]。線蟲能夠調節細胞的抗逆性和新陳代謝，符合衰老的自由基理論，近年來被廣泛用作研究氧化應激和衰老的模式生物。隨著時間的增長，線蟲的彎曲速度會明顯變慢，所以運動能力是反映線蟲衰老的主要指標之一；通過觀察線蟲頭部一定時間內的擺動次數可以直觀判斷線蟲的衰老程度。本研究結果顯示，給藥組線蟲的頭部擺動次數與空白組比較差異有統計學意義，表明霧水葛總黃酮具有一定的抗衰老作用。