丙戊酸鈉促進神經根回植術后神經元存活的機制研究

吳殿秀,袁依然,楊麗娟,王海鵬

(1.北華大學基礎醫學院,吉林 吉林 132013;2.北華大學臨床醫學院,吉林 吉林 132011)

臂叢根性撕脫傷是上肢致殘率較高的一種損傷,撕脫的范圍可以是一個、多個甚至是全部臂叢,由于軸突接近胞體撕裂,可導致神經胞體的大量死亡[1]。為代替死亡神經元的功能,NANDHANA M等[2]通過肋間神經和副神經等移位、游離及移植肌肉,恢復和重建了部分肢體功能,但手術過程不可避免地犧牲部分組織供區功能,而且術后功能恢復并不理想,目前,在脊髓水平上的神經修復-神經根回植術成為國內外學者的研究熱點。CHAI H[3]研究發現,通過神經根回植術不但能增加神經元存活率,而且存活下來神經元80%以上會再生出軸突長入回植的神經根。

丙戊酸鈉是一種不含氮的廣譜情緒穩定劑,應用于臨床上治療癲癇已有30多年的歷史。有研究[4-5]表明,丙戊酸鈉不僅具有保護神經元的作用,而且還可以促進軸突的生長。本試驗在大鼠臂叢神經撕脫傷的基礎上給予神經根回植術治療,通過是否服用丙戊酸鈉,比較單一手術治療與手術聯合藥物治療對神經元保護作用的差別。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

SPF級成年雄性Wistar大鼠(吉林大學基礎醫學院動物實驗中心)155只,體質量200～250 g;將大鼠隨機分為空白組(5只)、手術組(75只)、丙戊酸組(75只);手術組和丙戊酸鈉組按照術后不同時間點分為1、2、3、7、14 d 5個亞組,每個亞組15只。

主要試劑:TUNEL試劑盒(羅氏公司,瑞士);Bcl-2抗體(Abcam公司,英國);實時熒光定量試劑盒(FastStart Universal SYBR SYBR Green Master,ROX公司,瑞士);反轉錄試劑盒(M-MLV,Fermentas公司,英國);總RNA提取試劑盒(PolyA Ttract?mRNA Isolation System Ⅲ Promega,Madison,MA,Promega公司,美國);蛋白質電泳分子量Marker(Takara公司,日本)。

1.2 實驗方法

模型制備:應用10%水合氯醛(0.25 mL/100 g)對大鼠行腹腔注射麻醉,將大鼠俯臥位固定于無菌手術操作臺上,剃毛器剔除頸后及上背部鼠毛,常規消毒。以C6為中心,取頸背部后正中長約3 cm切口,以突出的T2棘突為定位標志(棘突最高),將肌肉組織向兩側牽開,顯露C5、C6椎板,咬除相應棘突和右側半椎板,顯露脊髓及C6神經根。將銳利刀片靠近脊髓,小心切斷神經根,再用刀片作約3 mm深脊髓橫行切口,將C6神經前根回植入脊髓前角,無創縫線縫合2針固定,后根曠置,縫合切口,待動物清醒后分籠飼養。丙戊酸組大鼠術后用丙戊酸鈉300 mg/(kg·d)的水代替正常飲水飼養。

取材:隨機選取10只大鼠,麻醉后,雙側眼球摘除法放血處死,取手術側C6節段脊髓,-80 ℃冷凍保存(5只用于實時熒光定量PCR檢測,5只用于Western blot檢測)。剩余5只大鼠用肝素鹽水混合物(肝素12 500 U+100 mL生理鹽水)灌注、沖洗組織血管里的血液后用4%多聚甲醛固定液灌流。切取C6節段脊髓,浸于4%多聚甲醛緩沖液固定,脫水后用石蠟包埋,制作厚度約為3 μm的連續橫斷切片(用于TUNEL檢測)?？瞻讓φ战M5只大鼠按照PCR檢測要求進行取材。

TUNEL法檢測:按照試劑盒說明染色后在200倍顯微鏡下觀察,神經核染為棕黃色的判定為陽性凋亡細胞。計數右側(手術側)陽性的神經元,計數左側(正常)胞體清晰、蘇木精染成藍色胞核神經元。凋亡神經元百分比為右側凋亡神經元數目與左側正常神經元數目的比值。

Western blot檢測:提取大鼠脊髓中的蛋白質,檢測樣品蛋白質含量。通過SDS-PAGE電泳、轉膜、抗原抗體反應后進行顯色、曝光,最后將獲得的膠片進行凝膠圖像分析。將膠片進行掃描或者拍照,用圖像處理系統分析目標條帶的灰度值,與內參灰度值的比值作為表達指數。

實時熒光定量PCR檢測:提取出大鼠脊髓總RNA后,定量RNA濃度與純度,根據試劑盒說明反轉錄得到cDNA,并以其為熒光定量模板(引物見表1),用Applied Biosystems熒光定量PCR儀進行擴增,采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對含量。

表1 PCR引物

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 神經元凋亡情況

本研究結果顯示,神經根回植術后第1、2天各組內未發現凋亡神經元,術后第3～14天手術組與丙戊酸組有凋亡神經元存在。在第3、7天丙戊酸鈉組凋亡的神經元百分率低于手術組(P<0.05),而在第14天兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 神經元凋亡百分率

2.2 Bcl-2的蛋白表達情況

本研究結果顯示,神經根回植術后,手術組與丙戊酸鈉組Bcl-2的蛋白表達逐漸升高,第7天后表達降低。丙戊酸鈉組較手術組Bcl-2的蛋白表達在術后第2、3、7天均明顯升高(P<0.05),但術后第1、14天比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖1。

圖1 TUNEL 染色凋亡神經元Fig.1 Apoptotic of neurons detected by TUNEL

表3 Bcl-2 Western blotting 條帶IOD標準化值

2.3 Bcl-2的mRNA 表達情況

本研究結果顯示,神經根回植術后手術組與丙戊酸鈉組Bcl-2的mRNA 表達逐漸增高,第7天后的mRNA表達降低(P<0.05)。丙戊酸鈉組較手術組Bcl-2的mRNA表達在術后第2、3、7 天明顯增高(P<0.05),術后第1、14天mRNA表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表4。

圖2 Bcl-2 Western blotting條帶Fig.2 Bcl-2 Western blotting bands

表4 Bcl-2 的mRNA表達

3 討 論

臂叢根性撕脫傷雖不會危及生命,但可引起上肢嚴重傷殘。傷后治療是迄今為止國內外手外科、神經外科的難題之一。隨著醫療技術的發展,神經移位術、肌肉關節功能重建等多種治療方法被應用于臨床[6-7],但由于受可供移植和轉位的神經有限、移位神經后大腦功能重塑及供區功能受損等多種原因影響,術后肢體功能恢復難以達到滿意效果。有學者[8]發現,節前根性撕脫傷的損傷位置由于更接近胞體,導致脊髓內部大量神經元死亡,所以單純修復術后神經纖維失去了“原動力”再生,損傷較重者根本無法再修復。CHAI H 等[3]發現,臂叢根性撕脫傷后應用神經根回植術可以減緩傷側肌肉萎縮,增加肌纖維橫截面積,恢復肌肉電生理學特征。HOANG T X等[9]發現單個神經根回植可以促進多個脊髓損傷節段內的神經元存活。HTUT M等[10]將神經根回植手術應用于臨床治療,證實神經根回植術可以有效地保護運動神經元,并促進神經纖維再生,但其具體機制還有待進一步研究。有研究[4,11]發現,小分子物質丙戊酸鈉可以通過血腦屏障直接到達損傷處保護臂叢根性撕脫傷后的神經元。本試驗通過神經根回植術聯合應用丙戊酸鈉即手術聯合藥物的方法治療神經根撕脫傷,通過TUNEL染色證實丙戊酸鈉可以在神經根回植術的基礎上進一步減少神經元的凋亡。

Bcl-2是公認的具有強大抑制凋亡作用的基因,它可以通過抑制Ca2+從內質網內釋放、調節Ca2+從內質網到線粒體的再次分布及濃度波動、抑制線粒體釋放元色素C而減少神經元凋亡[12],也可以通過抑制第二種線粒體來源的激活劑或低等電點IAP結合蛋白保護神經元免受自由基侵害的作用。NATSUME A等[13]發現,L4-6根性撕脫傷大鼠Bcl-2可有效增加脊髓前角神經元存活數量,YUAN P X[14]發現,丙戊酸可以通過增加Bcl-2和GAP-43的表達保護神經元。本試驗通過Western blot及實時熒光定量PCR技術檢測結果顯示,臂叢撕脫傷后應用丙戊酸會誘導Bcl-2的蛋白及mRNA表達增加,同理可推斷丙戊酸可以通過增加脊髓內Bcl-2的基因表達來抑制神經元的凋亡,從而促進受損神經元的存活。

綜上所述,在大鼠臂叢根性撕脫傷后早期進行神經根回植聯合丙戊酸鈉治療,可增加Bcl-2的蛋白及mRNA表達,有利于損傷神經元的存活,本研究可為后期臂叢根性撕脫傷的臨床治療提供新的思路和方法。