巨核細胞/血小板E1A激活基因阻遏子基因敲除小鼠構建及胎肝巨核細胞誘導分化

劉 晶, 梅 竹, 周 婷, 劉春影, 劉 丹, 閆承慧, 宋海旭

北部戰區總醫院 寒地心血管病全國重點實驗室 心血管內科,遼寧 沈陽 110016

血小板是外周循環血液中重要的組成部分,呈圓盤狀的無核小細胞,胞漿中含有大量的細胞器和分泌顆粒[1-2]。血小板的主要功能表現在維持出血和止血的動態平衡,也參與調控炎癥反應和組織修復等病理生理過程[3-4]。巨核細胞是血小板的前體細胞,經過增殖、分化和多倍體化等一系列復雜的過程后分泌血小板。巨核細胞的成熟障礙可能會導致血小板的數目和功能異常,引起血小板相關的疾病[5-6]。目前,調控巨核細胞成熟障礙的研究機制仍需要深入探索。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes 1,Creg1)是含有220個氨基酸的分泌型糖蛋白,具有促進組織和細胞成熟分化的作用。多項研究已經證實,Creg1是調控心血管系統的重要因子[7-10]。本研究旨在構建巨核細胞/血小板特異性Creg1基因敲除小鼠,誘導胎肝巨核細胞分化,為研究Creg1在巨核細胞分化和血小板生理功能中的作用提供實驗工具和方法?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取4只8周齡雌性健康Creg1flox/flox小鼠,12只8周齡雄性健康Pf4-Cre+小鼠,體質量20～25 g,購自集萃藥康生物有限公司。經北部戰區總醫院動物管理委員會批準,標準飼養條件。雌性Creg1flox/flox小鼠與雄性血小板因子4(platelet factor 4,Pf4)-Cre+小鼠繁育,獲得Creg1flox/wtPf4-Cre+小鼠,進一步交配獲得巨核細胞/血小板特異性Creg1敲除小鼠(Creg1flox/floxPf4-Cre+,簡寫Creg1-/-)。

1.2 主要試劑 DMEM培養基購自Thermo Fisher公司(美國);胎牛血清購自Gibico公司(美國);逆轉錄試劑盒購自Takara公司(日本);引物購自Sangon Biotech公司(中國);濾網(100/70/40 μm)購自Sangon Biotech公司(中國);重組血小板生成素(15 000 IU)購自沈陽三生制藥有限公司;Trizol裂解液購自Invitrogen公司(美國)。

1.3 Creg1-/-小鼠的構建方法及基因型的鑒定 利用Cas9/RNA system gene targeting的技術手段,構建針對小鼠Creg1基因的gRNA,指導Cas9蛋白在特定位點剪切Creg1基因的DNA雙鏈。小鼠Creg1基因共有4個外顯子,經Cre/loxP切除第2和第3外顯子,造成移碼突變,終止翻譯,完成Creg1基因的失活。子代小鼠4周齡時,提取鼠耳組織進行基因鑒定[11]。

1.4 熒光定量聚合酶鏈式反應檢測Creg1的表達情況 采用Trizol法提取巨核細胞中的總RNA,按照實驗說明進行去除基因組DNA,再進行逆轉錄反應和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)。m-Creg1 Forward:GTGGCACTACTGGTGTCGC;m-Creg1 Reverse:CGCGCACCTCCTTTATTGTG;m-Gapdh Forward:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG;m-Gapdh Reverse:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。

1.5 小鼠胎肝巨核細胞誘導分化 選取孕齡約15 d的孕鼠,麻醉處死,無菌條件下取出胎肝。將胎肝磨碎,用10%胎牛血清的DMEM沖洗。室溫條件下400 g離心5 min,加入適量的1×紅細胞裂解液,室溫下放置10 min。DMEM中和,400 g離心5 min,倒掉上清后用10%胎牛血清的DMEM重懸細胞,濾網過濾。將重懸的細胞轉移到培養皿中,加入濃度為15 IU/ml的血小板生成素,孵育培養4 d,每天加1次同等劑量的血小板生成素[12]。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Creg1-/-小鼠的構建情況 本研究利用Cas9/RNA system gene targeting的技術手段成功構建了Creg1-/-小鼠(圖1a)。收取小鼠鼠耳組織,提取基因組,對子代小鼠進行基因鑒定(圖1b)。

圖1 Creg1-/-小鼠的構建和鑒定情況(a.構建示意圖;b.PCR擴增鑒定)

2.2 應用實時熒光定量PCR檢測巨核細胞中Creg1 mRNA的表達水平 與Creg1flox/flox小鼠比較,Creg1-/-小鼠巨核細胞中Creg1 mRNA的表達量顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 實時熒光定量PCR檢測巨核細胞中Creg1 mRNA的表達

2.3 Creg1-/-小鼠胎肝巨核細胞的誘導分化情況 與Creg1flox/flox小鼠比較,Creg1-/-小鼠胎肝巨核細胞誘導分化4 d時,光鏡下觀察發現巨核細胞的直徑明顯變小,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 胎肝巨核細胞的誘導分化情況(a.光鏡下觀察巨核細胞分化4 d時的直徑大小;b.Creg1flox/flox小鼠與Creg1-/-小鼠巨核細胞直徑比較)

3 討論

巨核細胞是產生血小板的前體細胞,成熟分化障礙會導致血小板的數目減少或功能異常。調控巨核細胞增殖、分化、多倍體化和前血小板釋放的機制十分復雜,促進巨核細胞的成熟和血小板生成的機制尚不明確[13-14],仍有很多爭議,需要研究者們應用不同的實驗方法和工具去深入探索。

本研究發現,Creg1在機體發育和維持機體穩態中發揮重要功能,能夠促進心肌、脂肪、血管和平滑肌等組織細胞分化[15-17]。目前,筆者團隊已經構建了Creg1基因在心臟、脂肪、骨骼肌和單核細胞等組織細胞特異性敲除的工具小鼠,深入地闡述了相關疾病的發生機制,并給予了藥物和小分子化合物的干預[18-20]。本研究中,Creg1flox/flox小鼠和Creg1-/-小鼠作為研究血小板相關疾病機制的實驗工具小鼠被成功構建和基因鑒定。隨后,本研究進一步誘導Creg1flox/flox小鼠和Creg1-/-孕鼠的胎肝巨核細胞,結果發現,Creg1基因的敲除導致了巨核細胞直徑變小,可能會引起巨核細胞分化和多倍體過程異常,最終導致血小板生成的數目和生理功能發生改變。這提示,Creg1在巨核細胞成熟過程中可能發揮重要作用。

綜上所述,Creg1-/-小鼠作為研究巨核細胞和血小板相關疾病發生機制的實驗工具鼠,可能揭示尚未發現和闡明的重要病理生理學機制,為臨床治療血小板疾病提供理論基礎支持。