線粒體靶向抗氧化劑SKQ1對糖尿病小鼠腎損傷的治療作用與機制

高 治 鞏永鳳 王明霞

濱州醫學院基礎醫學院生理學教研室 山東 煙臺 264003

糖尿病腎病(diabetic nephropathy ,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的一種嚴重并發癥。隨著DM發病率的增加,DN已成為慢性腎臟疾病發展的重要致病因素[1]。全球約30%～40%的終末期腎病患者是DM患者[2]。DN癥狀包括蛋白尿、足細胞損傷和腎纖維化[3-4]。足細胞作為高度分化的細胞,構成腎小球濾過屏障的最外層。由于足細胞的再生能力有限,足細胞的損傷和丟失可能導致腎小球濾過膜的破壞[5]。因此,足細胞損傷與蛋白尿的發展密切相關[6]。臨床上評估DN的進展和嚴重程度時,通常使用足細胞損傷和腎纖維化的程度作為指標[7]。因此,保護足細胞和減輕腎纖維化的治療被認為對DN具有重要意義。

SKQ1是質體醌的衍生物,是一種靶向線粒體的抗氧化劑,對比其他線粒體靶向抗氧化劑(Mitoquinone,MitoQ),SKQ1的促氧化活性低于MitoQ,其“抗氧化”活性范圍大于MitoQ,這為SKQ1的臨床應用提供了潛在的優勢[8]。已證實SKQ1在治療疾病過程中發揮著關鍵作用,包括干眼病、阿爾茨海默病、傷后愈合和衰老過程[9-10]。同時研究發現,SKQ1不僅可以預防缺血再灌注損傷、順鉑或葉酸等導致的急性腎損傷[11],還可以延長腎缺血再灌注損傷后的壽命[12]。鑒于此,SKQ1對DN是否具有防治作用,是否可以通過抑制足細胞損傷和腎纖維化進而減輕DN的腎損傷,引起我們的濃厚興趣。本研究應用SKQ1干預1型DM模型小鼠,探討SKQ1對DM模型腎臟足細胞損傷和腎纖維化的影響,進一步闡明SKQ1對 DN疾病進展過程中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6野生型小鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,選取7周齡的雄性小鼠進行實驗,體質量為22 g左右,每組小鼠10只。所有動物實驗均遵守實驗動物倫理學規范,飼養于SPF級動物房,每籠不超過5只小鼠,飼養環境溫度、濕度適宜,自由飲食攝水,維持晝夜交替,每2～3天更換一次墊料,保證環境整潔。飲用水和鼠籠及其他物品均經過高壓蒸汽滅菌后使用,限制人員進出飼養間頻率,以減少動物產生應激反應。

1.2 主要試劑與藥品 SKQ1(MCE);鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)(sigma);肌酐、尿素氮等試劑盒(南京建成科技有限公司);ELISA 試劑盒(美國Bethyl公司);DAPI(北京索萊寶科技有限公司);足突蛋白(NPHS2)抗體(R&D SYSTEMS)、腎母細胞瘤基因1(Wilms tumor gene 1,WT1)抗體(Abcam)、結蛋白(desmin)抗體(Abcam)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體(Abcam)、HRP標記的二抗(Cell Signaling Technology,美國CST公司)。

1.3 單側腎切除術 為加速小鼠糖尿病腎臟損傷,本研究采用單側腎切除手術聯合STZ注射誘導1型糖尿病模型。

1.3.1 手術方法 腹腔注射4%水合氯醛(100 μL/10 g)麻醉小鼠,在右側背部做切口,暴露出小鼠右側腎臟,微血管夾夾閉腎門血管和輸尿管,在近心端用縫合線進行結扎,在遠心端剪斷血管及輸尿管,縫合傷口,39℃水浴鍋上保持小鼠體溫,手術結束后補充500 μL生理鹽水。

1.3.2 誘導1型DM模型 單側腎切除術恢復一周后,用STZ進行腹腔注射(50 mg/kg),連續注射5 d。注射前需禁食,第一天禁食12 h,后四天禁食6 h,造模后1周后測血糖,隨機血糖≥16.65 mmol/L為糖尿病小鼠。對照組注射等量的生理鹽水。

1.4 治療方法 SKQ1組小鼠每天自由飲用SKQ1(250 nmol·kg-1·d-1))水溶液[9,13],對照組和DM組正常自由飲水。3組持續處理28周。

1.5 尿液取材 代謝籠接取12 h尿液,將尿液12 000 rpm、離心4 min后轉移至新的離心管中,凍于-80 ℃保存。根據ELISA 試劑盒中的說明書方法進行檢測。

1.6 腎臟取材 腹部解剖小鼠,摘取小鼠腎臟,去除被膜,小鼠腎臟沿縱軸切開,一半腎臟加到1.2 mL Trizol中、提取RNA,一半腎臟加入4% PFA固定,待做組織學染色,或一半腎臟OCT包埋后凍存于-80℃待做免疫熒光。

1.7 RNA提取以及qRT-PCR實驗 按照Trizol試劑盒說明書的步驟提取腎組織總RNA,使用反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA,用于qRT-PCR。 qRT-PCR結果采用QuantStudioTM設計與分析SE軟件v1.5.0獲得。表1包含本研究中使用的引物序列。與β-actin歸一化后,計算各mRNA的表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 免疫熒光染色 將OCT包埋的腎組織取出,-20℃環境下切5 μm的切片,使用甲醇-20℃固定20 min;10% 胎牛血清(0.2 % Tween 20)室溫封閉90 min;一抗均以1∶200稀釋,4℃孵育過夜,PBS洗3遍;二抗以1∶200稀釋,室溫避光孵育90 min,PBS洗3遍;加DAPI室溫避光孵育5 min,PBS洗3遍后Mowiol封片,使用Zeiss LSM880激光共聚焦顯微鏡(德國蔡司)觀察拍照。

1.9 組織學染色 取出固定好的腎組織,梯度脫水后用石蠟包埋,切4 μm石蠟切片,進行HE和PAS染色,使用光學顯微鏡觀察各組腎臟組織病理結構變化的情況。

2 結果

2.1 SKQ1減輕DM小鼠尿微量白蛋白水平 血糖結果(圖1A)顯示,DM組和SKQ1組DM誘導成功,兩組血糖均高于對照組。ELISA結果(圖1B)顯示,與對照組相比,DM組小鼠后期尿微量白蛋白均顯著升高 (P<0.01) ;而與DM組小鼠相比,SKQ1組小鼠后期尿微量白蛋白顯著降低(P<0.05) 。

A.小鼠空腹血糖;B.小鼠蛋白尿/肌酐的相對值。與對照組相比,**P<0.01,***P<0.001; 與DM組相比,#P<0.05。

2.2 SKQ1對DM小鼠腎臟病理結構的影響 對不同組別小鼠腎組織進行HE染色,觀察腎臟病理結構改變。HE染色結果(圖2)顯示,與對照組相比,DM組小鼠腎小球系膜細胞增多,細胞外基質增多;與DM組比,SKQ1 組小鼠腎小球系膜細胞數目減少,細胞外基質增生減輕。

HE染色(×400,n=3),上圖比例尺100 μm,下圖比例尺50 μm。

2.3 SKQ1對各組小鼠足細胞相關蛋白表達的影響 qPCR結果(圖3)顯示,DM組Nphs2、Podxl、Wt1等小鼠腎臟足細胞相關mRNA表達量均較對照組減少(P<0.01) ,desmin的表達量較對照組增多(P<0.01);SKQ1 組小鼠腎臟足細胞相關轉錄因子Nphs2 、Podxl、WT1表達量均較DM組增多(P<0.01) ,desmin的表達量較DM組減少(P<0.01)。免疫熒光結果(圖3)顯示,小鼠腎臟足細胞相關蛋白變化與mRNA的結果一致;并統計WT1陽性細胞數代表足細胞數量(圖3),結果顯示,與正常組比較,DM組小鼠腎小球足細胞數量減少,SKQ1組小鼠腎小球足細胞數量增加。

A-D: Nphs2、Podoxl、Wt1、 desmin mRNA表達水平(實時熒光定量PCR,n=5);E-F,H:NPHS2、Podxl、desmin熒光強度;G:WT1陽性細胞數;I-L:NPHS2、WT1、Podxl、desmin蛋白表達(免疫熒光×400,n=3),比例尺20 μm, DAPI染核;與對照組相比,*P<0.05, **P<0.01 ,***P<0.001;與DM組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。

2.4 SKQ1改善DM小鼠腎臟纖維化 q-PCR(圖4A)和免疫熒光(圖4B、C)結果顯示,與對照組相比,DM組小鼠α-SMA表達量明顯增多(P<0. 001),SKQ1組小鼠α-SMA表達減少(P<0.05)。PAS(圖4D)染色結果顯示,與對照組相比,DM組小鼠腎小球有明顯的膠原纖維沉積,SKQ1組小鼠腎小球膠原纖維沉積明顯減輕。

A.α-SMA mRNA表達水平(實時熒光定量PCR,n=5);B-C.α-SMA熒光強度、蛋白表達(免疫熒光×400,n=3),比例尺20 例尺;D.PAS染色(×400,n=3),上圖比例尺100 μm,下圖比例尺50 μm。與對照組相比,***P<0.001;與DM組相比,#P<0.05,##P<0.01。

3 討論

隨著DM發病率的迅速上升,DN已成為慢性腎臟疾病發展的重要致病因素[14]。本研究旨在闡明線粒體靶向抗氧化劑SKQ1對DM相關腎損傷的保護作用及機制。通過雄性C57BL/6小鼠行右側腎切除術后,腹腔注射STZ構建DM模型,然后通過飲用SKQ1水溶液進行治療[9,13],連續飲用28周。結果顯示,DM狀態下尿微量白蛋白水平明顯增加,在飲用SKQ1水溶液后明顯降低。Vladimir P. Skulachev在一側腎切除后進行腎缺血/再灌注,發現SKQ1通過利尿、血[肌酸酐]和Ca2+重吸收部分正?；确矫姘l揮保護作用[15]。Gaetano Serviddio發現,SKQ1可以降低腎缺血再灌注后血尿素氮和肌酐水平。這些結果均說明SKQ1可以在一定程度上改善蛋白尿及腎功能。

盡管近幾十年來進行了大量研究[16],但DN的確切機制尚未完全闡明。關于DN的發展,一種被廣泛接受的觀點是,DN是高血糖條件下多個腎靶點損傷的綜合結果[17]。在這些靶點中,足細胞被公認為是早期損傷部位,且多個腎臟信號通路的破壞在這些病理損傷的進展中至關重要[18]。本研究發現,DM狀態下NPHS2、Podoxl、WT1等蛋白的表達量明顯下降,足細胞的損傷標志物desmin表達上調;在飲用SKQ1水溶液后,足細胞標志物NPHS2、Podoxl和WT1等蛋白的表達量增加,足細胞的損傷標志物desmin表達下降,這也說明飲用SKQ1水溶液治療可以保護足細胞免受損傷。NPHS2可以維持裂隙膜的正常濾過功能,Podoxl是CD34家族表面糖基化的唾液酸激酶,其能將足突和狹縫膈膜蛋白正確定位到膜結構域并維持超濾結構的完整性[19],并且也是腎小球疾病中的足細胞損傷特定標志物[20]。WT1也是足細胞的特異標志之一,腎臟組織中 WT1 表達的變化可以反映足細胞損傷程度[20]。Desmin是慢性腎小球病時足細胞損傷的早期標志物之一,當足細胞損傷時desmin表達增強。Vladimir P. Skulachev研究顯示,腎臟上皮細胞與SKQ1預孵育可在缺氧24 h再復氧24 h后提高上皮細胞的存活率[15]。這與本研究的結果一致,SKQ1可以保護足細胞,減少足細胞的死亡。E. Y. Plotnikov 和Gaetano Serviddio研究發現SKQ1在腎缺血再灌注模型中發揮了腎臟保護功能[19-21]。同時也有研究發現,SKQ1預處理可以減輕腎缺血再灌注后小鼠的死亡率[12-15]。在本次研究中也發現,DM組死亡率為50%(5只鼠死亡),SKQ1組的死亡率20%(2只鼠死亡),SKQ1干預明顯提高DM鼠的存活率,并延長了小鼠的壽命(此數據沒有展示)。這些研究發現與本研究的結果一致,在病理狀態下,SKQ1具有腎臟保護功能。

腎臟纖維化是DN病進展為終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)的重要原因,是全球醫療保健的主要負擔[22]。腎纖維化發生的機制較為復雜,多種細胞信號通路共同參與調節腎纖維化的形成。本研究發現,DN病小鼠足細胞數量減少的同時還伴有腎纖維化。之前就有研究發現,足細胞損傷是局灶性節段性腎小球硬化發生發展的主要因素。腎臟纖維化的主要特征是成纖維細胞和細胞外基質過量累積,同時有腎小球硬化等現象發生[23],這些病理變化最終會發展為ESRD。足細胞受到損傷后,肌成纖維細胞分泌α-SMA,是腎纖維化發生的關鍵。本實驗結果顯示,DM組小鼠腎小球可見大量細胞外基質沉積,α-SMA蛋白表達增多,足細胞數量減少,腎組織出現病理損害。經SKQ1治療后,α-SMA蛋白表達顯著減少,腎間質沉積的細胞外基質明顯降低,足細胞數量增多,腎組織病理變化也有所改善。本研究結果表明,SKQ1可以改善糖尿病狀態下小鼠的腎小球纖維化情況。

綜上所述,SKQ1可以減輕足細胞損傷,改善小鼠尿微量白蛋白排泄和腎小球纖維化,進而延緩DN的進展。