楊梅素經β-catenin對厄洛替尼抗非小細胞肺癌的增敏作用與機制

宋 鵬 李敏敬 楊春燕

1 濱州醫學院醫藥研究中心 山東 煙臺 264003;2 濱州醫學院中醫學院 山東 煙臺 264003;3 濱州醫學院口腔醫學院口腔生物學教研室 山東 煙臺 264003

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是常見的惡性腫瘤之一,占肺癌發病總數的80%以上,其患者5年生存率不到20%[1]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)靶向藥物厄洛替尼(erlotinib)在臨床上應用于晚期NSCLC的二、三線治療[2],但腫瘤耐藥成為限制厄洛替尼療效的關鍵問題。因此,晚期NSCLC厄洛替尼耐藥機制及耐藥后的治療策略已成為研究熱點。

c-met基因擴增[3]、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog,KRAS)基因突變[4]、胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1,IGF-1R)活化[5]及T790M突變[6]與厄洛替尼耐藥相關,但仍有部分厄洛替尼耐藥機制不明[7]。長期使用厄洛替尼可導致β-catenin及其相關分子Axin2、CD44、Ccnd1、Lgr-5、基質金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase7,MMP7)上調,誘發厄洛替尼耐藥[8]。體外實驗證實,抑制β-catenin可降低NSCLC對吉非替尼耐藥[9]。這提示,β-catenin通路可能在厄洛替尼耐藥過程中發揮重要作用。楊梅素(myricetin)是從楊梅樹樹皮、樹葉中提取的一種黃酮醇類化合物,具有鎮痛、抗過敏和抗炎癥的作用[10]。楊梅素可下調結直腸癌細胞中β-catenin的表達,抑制下游cyclin D1/PCNA/survivin信號傳導,從而誘導腫瘤細胞凋亡[11]。楊梅素可抑制人乳腺癌細胞β-catenin的表達,進而影響乳腺癌病程[12]。楊梅素調節β-catenin信號通路的分子機制至今不明,尚待進一步研究。楊梅素被美國FDA批準可應用于醫藥、食品等行業,這為楊梅素作為臨床抗癌藥物使用提供了有利條件[13]。

在NSCLC細胞中,楊梅素可以抑制β-catenin表達。本研究擬探討楊梅素調控Wnt-β-catenin通路的分子機制,并研究抑制β-catenin在提高NSCLC對厄洛替尼敏感性中的機制,有助于挖掘楊梅素的抗癌機理及厄洛替尼的耐藥機制,并開發改善厄洛替尼等靶向藥物療效。楊梅素與厄洛替尼聯合使用的治療方案有可能成為晚期NSCLC治療的新策略,具有潛在的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC細胞株A549購自普諾賽生命科技有限公司。siβ-catenin由廣州銳博生物科技有限公司合成人β-catenin的siRNA、LipofecTAMINE 2000購自invitrogen公司。楊梅素生化試劑、Hoechst 33258 (IH0060)購自北京索萊寶公司(貨號為#SM8390)。胎牛血清購自Hyclone公司(貨號為SV30087.02)。DMEM(貨號為11965092)、RPMI1640(貨號為11875119)購自Gibco公司。β-catenin(貨號為#8480)、Cleaved Caspase-3(貨號為#9661)、Cleaved Caspase-7(貨號為#8438)、Anti-rabbit IgG(貨號為#7074)購自CST公司。β-actin購自ZSGB-Bio公司(貨號為#TA-09)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞使用含 5%胎牛血清,100 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養基作為細胞培養液,培養條件為37℃,5% CO2細胞培養箱中培養,每2～3 d更換一次培養基。A549細胞經不同濃度楊梅素(0、50、100、200 μM)處理72 h,楊梅素處理24、48、72 h后分別收集部分細胞提取蛋白。

1.2.2 β-catenin siRNA的化學合成及轉染 由廣州銳博生物科技有限公司合成針對人β-catenin以及陰性對照序列。其中β-catenin的siRNA序列為 5′-UGGUUGCCUUGCUCAACAAdTdT-3′;陰性對照siRNA 序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3′。轉染前細胞密度控制在50%左右,采用脂質體轉染試劑Lipofec TAMINE 2 000轉染siRNA,siRNA最終濃度為50 nM。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達水平 根據收集細胞的數量進行RIPA裂解液的裂解,提取細胞總蛋白,并用BCA法定量。將裂解物在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液中煮沸5～10 min,取20 μg左右蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉移到PVDF膜,用封閉液封閉,然后與一抗孵育,洗膜,繼之與二抗孵育,洗膜,采用ELC化學發光試劑檢測蛋白的表達量。

1.2.4 集落形成實驗 胰酶消化細胞,制備細胞懸液,每孔500個細胞接種于6孔板中,使細胞分散均勻。培養24 h后分別對A549細胞加入1、5、10 nM厄洛替尼進行處理,然后將細胞繼續培養2～3周,厄洛替尼處理24、48、72 h后分別收集部分細胞提取蛋白。當培養皿中出現肉眼可見的克隆時,終止培養。甲醇固定15 min,加適量姬姆薩應用液染色10～30 min。光學顯微鏡下采集圖像,應用NIS-Elements F3.0成像系統(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)統計集落的數量及大小。

1.2.5 Hoechst 33258實驗 將0.5×103～1×103細胞接種于24孔板中,并進行相應的處理。Hoechest 33258與PBS按照1∶100的比例配置成工作液濃度,將1 mL工作液加入24孔板中37℃孵育30 min,然后棄去工作液,并用PBS清洗3次,用熒光顯微鏡觀察,亮藍色的即為凋亡細胞。

2 結果

2.1 厄洛替尼誘導β-catenin的表達 分別以時間梯度和濃度梯度的厄洛替尼處理A549細胞,Western blot檢測厄洛替尼對β-catenin表達的影響,結果發現,厄洛替尼上調A549細胞中β-catenin的表達,并呈時間和劑量依賴性(圖1)。

A.5 nM厄洛替尼處理A549細胞0～72 h或0～10 nM厄洛替尼處理A549細胞48 h,檢測β-catenin表達,β-Actin作為內參;B、C. 蛋白表達量的定量統計。與作用時間為0 h,厄洛替尼不添加組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

A.免疫印跡檢測siCtrl、siβ-catenin轉染構建的β-catenin敲降細胞系;B.上述細胞用厄洛替尼處理后的集落形成率檢測。C. 柱狀圖顯示集落形成3個復孔的數量統計值。與siCtrl組比較,***P<0.001。

2.2 敲降β-catenin后A549細胞對厄洛替尼敏感性的影響 β-catenin不但與腫瘤的發生發展密切相關,還介導腫瘤的耐藥。厄洛替尼處理細胞后,β-catenin表達升高,這可能是細胞的代償性反應,與細胞對厄洛替尼的敏感性有關。本研究采用小干擾RNA敲降β-catenin表達,Western blot顯示,siβ-catenin成功敲降A549細胞中β-catenin的表達。集落形成結果表明,敲降β-catenin表達顯著降低A549細胞集落形成能力,與對照細胞比較,β-catenin表達受抑制的細胞在用厄洛替尼處理后集落形成率顯著降低(圖2)。

2.3 楊梅素對β-catenin表達作用的影響 本研究進一步檢測楊梅素對A549細胞株中β-catenin表達的影響,結果發現,A549細胞經楊梅素100 μM處理0～72 h范圍內的β-catenin表達量降低,并于48 h后顯著降低,呈現時間依賴性。A549細胞經不同濃度楊梅素(0、50、100、200 μM)處理24 h后,β-catenin的表達顯著降低,并呈劑量依賴性(圖3)。

A.100 μM楊梅素處理A549細胞0～72 h或0～200 μM楊梅素處理A549細胞48 h,β-catenin表達檢測,β-Actin作為內參;B、C. 對蛋白表達量的定量統計。與作用時間為0或楊梅素添加量為0的對照組比較,**P<0.01,****P<0.0001。

A.A549細胞經過厄洛替尼(5 nM)、楊梅素(100 μM)或兩者疊加處理24 h,Hoechst 33258染色檢測,藍色高亮代表凋亡細胞;B.對A中凋亡細胞占總細胞數的比例進行柱狀圖分析; C.Western blot檢測以上分組中cleaved caspase 3和cleaved caspase 9的表達。與厄洛替尼單獨用藥組比較,**P<0.01。

2.4 楊梅素對厄洛替尼促進A549細胞凋亡的增敏作用 A549細胞經過楊梅素、厄洛替尼或兩者聯合處理,用Hoechst 33258染色方法來檢測細胞的凋亡率,用Western blot檢測與凋亡相關蛋白表達水平。研究發現,與楊梅素或厄洛替尼單獨處理組比較,楊梅素、厄洛替尼聯合處理組中A549細胞的凋亡比率升高,P<0.01。與楊梅素或厄洛替尼單獨處理組比較,楊梅素、厄洛替尼聯合處理組中凋亡相關蛋白(cleaved caspase 3、cleaved caspase 7)表達量升高,P<0.01。見圖4。這提示,楊梅素可能通過抑制β-catenin的表達增強厄洛替尼對非NSCLC的敏感性。

3 討論

表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)對NSCLC患者有顯著的療效,但是其耐藥性限制了EGFR-TKI的長期療效。本研究發現,厄洛替尼能誘導NSCLC細胞系A549中β-catenin表達升高,β-catenin是增強厄洛替尼藥物敏感性的關鍵分子。本研究首次證明,在NSCLC患者中,楊梅素能夠抑制β-catenin的表達,通過促進細胞凋亡的方式增敏厄洛替尼。本研究有助于深入了解厄洛替尼耐藥機制和天然提取物楊梅素的抗癌機理。本研究還未應用于NSCLC動物模型,有待從體內驗證楊梅素增敏厄洛替尼的效果及作用機制。

β-catenin在NSCLC晚期治療厄洛替尼耐藥中起重要作用。β-catenin是Wnt-β-catenin信號通路的關鍵蛋白,該通路在多種腫瘤中都有異常表達,通過調控其下游靶基因cyclin-D1和c-myc促進細胞的增殖和腫瘤的發展[14-15]。在EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞系中,β-catenin水平升高,抑制β-catenin信號傳導可增強對EGFR- TKI治療的敏感性[16]。β-catenin在EGFR突變的細胞中上調和激活。突變的EGFR優先結合和酪氨酸磷酸化β-catenin,導致β-catenin介導的反式激活的增加。β-catenin對于EGFR突變的肺癌的發展是必不可少的[17]。這表明,β-catenin在厄洛替尼耐藥細胞系中升高,這種變化導致細胞增殖和耐藥性維持。靶向β-catenin途徑可能為預防肺癌發展或克服對EGFR-TKIs的耐藥性提供新的策略。

β-catenin作為腫瘤治療靶點缺乏有效藥物。β-catenin與腫瘤的發生、生長、轉移、免疫等密切相關[18]。使用iCRT14阻斷β-catenin可以減緩肝癌的進展[19]。使用人參皂苷Rb1抑制β-catenin的蛋白表達和核易位,干擾β-catenin/TCF4的相互作用,可以抑制胃癌前病變的發生和發展[20]。小分子化合物白屈菜赤堿Chelerythrine靶向作用于NSCLC干細胞中β-catenin,減緩腫瘤進展[21]。但到目前為止,基于該靶點的抑制劑、拮抗劑等的研究大多處于臨床前研究階段,尚缺乏有效的靶向藥物。并且Wnt-β-catenin通路生物學功能多樣,在腫瘤性疾病、非腫瘤性疾病和干細胞功能維持方面均有重要作用。因此,靶向藥物的設計要充分考慮其拖把效應及毒性效應,采用FDA已獲批藥物進行新功能療效的探索成為重要的研發路徑。

本研究首次發現,楊梅素可抑制NSCLC中β-catenin的表達,并呈現劑量和時間的依賴效應。楊梅素可通過調控β-catenin在腫瘤中發揮作用,例如楊梅素可通過誘導人乳腺癌中GSK3β和Bax蛋白表達,抑制β-catenin/cyclin D1/PCNA等,促進caspase-3活性,通過誘導凋亡的方式抑制MCF-7細胞活力[22]。本研究發現,在NSCLC厄洛替尼治療中,楊梅素抑制β-catenin表達,顯著促進A549細胞凋亡,增敏厄洛替尼藥效。本研究將有助于開發克服厄洛替尼耐藥的新策略。楊梅素聯合厄洛替尼的治療方案有可能在一定程度上克服厄洛替尼的耐藥問題,為臨床上治療NSCLC腫瘤患者提供新選擇,為臨床研發提供了有力的實驗證據。