基于同源建模和分子對接技術研究不同物種乙酰膽堿酯酶和有機磷農藥的相互作用

王佳琪

(呼倫貝爾市農畜產品質量安全中心/呼倫貝爾市農牧業檢驗檢測中心，內蒙古 呼倫貝爾 021000)

引言

有機磷農藥自開發應用以來對世界范圍內的農業生產無疑產生了巨大的推動作用，但是在促增產保豐收的背后卻對自然環境和人類健康產生了巨大的危害。隨著該類農藥的使用，類似于“毒韭菜”“毒李子”的有機磷農藥中毒事件時有發生。在現實中有機磷中毒癥狀具有發病急、毒死率高的特點，而數據顯示在每年的中毒病例中急性有機磷中毒，占到20%～50%，死亡率達到3%～40%[1]。另外，為應對農業種植過程中不合理使用有機磷農藥，造成的潛在中毒風險，各基層農畜產品質量安全檢測站通常使用農藥殘留速測試劑盒進行，這種基于酶抑制法的速測試劑盒，優點在于快速、靈敏、效率高，但對檢測條件要求較為嚴格，會出現假陽性和假陰性的可能[2]。因此，通過研究不同物種AChE與各類有機磷農藥的分子對接模型，分析結合模式和結合能的大小，找到普適性和強結合力的潛在結合位點或潛在定點突變位點，這對有機磷農藥速測尋找新酶源和有機磷農藥急性中毒治療中新型解毒劑的研制具有現實意義和理論指導意義。當前農藥快速檢測所用的酶抑制法，其檢測用酶的靈敏度是檢測準確度的關鍵。而這類酶源主要集中在豬肝、雞血等動物組織以及玉米、小麥等植物組織當中。隨著研究的深入，也有從煙草天蛾、棉鈴蟲等昆蟲體內提取。有研究顯示，從家蠅中提取的酶在進行農藥殘留快速檢測中表現出最優的檢測效果[3]。另外，AChE的抑制劑主要有治療阿爾茲海默癥的藥物他克林(Tacrine)等，以及農業上常用的有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑，而有機磷農藥直接或間接造成中毒案例在我國的數目非常巨大。其毒理作用表現為AChE被有機磷農藥磷酸化，這種磷酸化具有不可逆的特點，因此導致體內乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)不能分解成膽堿和乙酸，從而ACh在體內大量蓄積，最終產生嚴重的中毒癥狀。臨床上治療急性有機磷農藥中毒的藥物有抗膽堿能藥如阿托品、鹽酸戊乙奎醚，而前者毒副作用大，后者起效慢，對于重度有機磷農藥中毒患者不適用[4]；肟類復能劑如碘解磷定和氯解磷定，但有報道稱氯解磷定對甲胺磷中毒搶救效果顯著，對其他有機磷農藥中毒救治效果不理想。但無論是哪類藥物都是基于AChE的結構基礎，利用基團競爭機制來發揮作用。與大部分分子對接研究相似，本研究將1/2的工作量放到了同源建模等前期基礎性工作上，一個質量過關的模建蛋白對于后期分子對接研究非常重要。另外，有學者研究了32個物種的AChE與9種有機磷和氨基甲酸酯農藥的分子對接相互作用[5]，還有學者研究了毒死蜱與電鰻、人類、果蠅和家鼠的AChE間的相互作用[6]。而本研究盡可能多的覆蓋到了25種農業上常用的有機磷農藥和覆蓋半翅目、雙翅目、鱗翅目和鞘翅目等11個目的30個物種的AChE之間的分子對接研究，基于DS 2019的半柔性對接模塊，更全面的研究分子層面中不同物種與不同有機磷農藥之間的相互作用。以綠盲蝽等30個物種的AChE模建蛋白和乙酰甲胺磷等25種有機磷農藥分子為研究對象，立足于半柔性分子對接基礎上，通過對比結合能(Binding Energy)大小、三維對接空間構象分析以及非鍵相互作用力分析，研究受體蛋白與配體分子間的相互作用力類型，關鍵氨基酸殘基結合位點等結合機制，為有機磷農藥快速檢測篩選新酶源以及有機磷農藥中毒新型解毒劑的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 同源建模

隨著測序技術的發展，大量物種的AChE的蛋白質結構被解析出來，但其三維結構的探究卻由于技術和資金的限制而少見。同源建模作為一種計算機輔助手段利用已知三維結構的AChE為模板構建未知結構的AChE，在藥物虛擬篩選和新酶源發掘中卻常見。本研究從NCBI和Uniport網站檢索得到30個物種的AChE氨基酸序列，并將FASTA格式的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服務器，通過序列比對找到同源性大于30%的7個已知三維結構的蛋白晶體。并在ProteinDataBank數據庫下載下列蛋白晶體：黑腹果蠅(PDB ID：6XYS、1QO9)、岡比亞按蚊(PDB ID：6ARX、6ARY、5YDH、5X61)、人(PDB ID：7D9O)，詳見表1，并以此為模板在SWISS-MODEL在線服務器進行同源建模。

表1 同源建模信息表

1.2 模型質量評估

分子對接技術的基礎是擁有一個質量可靠的受體蛋白，因此同源建模模型構建完成后，對模型的結構合理性進行評估是必不可少的。利用UCLA-DOELAB-SAVESv6.0在線服務器的ERRAT[7]、Verift-3D[8]和PROCHECK[9]3個模塊進行模型質量評估。

ERRAT計算0.35nm范圍之內，不同的原子類型對之間形成的非鍵相互作用的數目(側鏈)。以得分的方式評價結構合理程度大于85較好，一般情況下得分在91分左右的結構都是可接受的。

Verift-3D是根據數據庫已有蛋白質晶體結構的氨基酸位置以及α螺旋、β折疊、無規則卷曲和一些loop來評估目標模型和一級序列的相容性。超過80%的殘基擁有大于0.1的3D/1D值，則模型質量合格，獲得PASS，即為通過評估[10]。

PROCHECK以PDB中高分辨的晶體結構參數為參考，通過測評三維立體化學結構中的氨基酸殘基角度是否合理來評價蛋白模型的合理性，結果以Ramachandran plot(拉馬錢德蘭圖)顯示。拉氏圖將模型氨基酸劃分為4個區域，包括核心區，又叫最佳合理區(The most favored regions)、允許區(The additional allowed regions)、大致允許區(The generous allowed regions)和禁阻區(The disallowed regions)，當不低于90%的氨基酸分布在允許區時，即為合理分布[11-13]。

1.3 分子對接

通過ZINC15在線檢索器選取25種有機磷農藥作為配體分子，并下載其二維分子結構式，并以“.mol”格式保存。在Chem 3D軟件中生成三維立體結構，導入Discovery Studio 2019軟件中優化分子構象、能量最小化和賦予CHARMm力場。

將同源建模得到的30個蛋白模型作為受體蛋白導入Discovery Studio 2019軟件中，利用Prepare Protein功能進行加氫、補全殘基、調整二面角、完善原子距離和賦予力場等自動優化程序。接著通過序列比對找到各物種AChE的催化三聯體(SER、HIS、GLU)，再以三聯體為中心15?為半徑的球形范圍作為活性中心，利用Flexible Docking模塊通過半柔性對接方式將配體分子對接到受體蛋白的活性中心上，結果以結合能(Binding energy)值的大小來評價，最終選取結合能最小以及構象最穩定的組合進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 各物種乙酰膽堿酯酶的同源建模

從生物信息學角度看氨基酸序列同源性越高，則蛋白質三維結構的空間結構越具有相似性。因此，將目標氨基酸序列提交到SWISS-MODEL在線服務器通過序列比對的方式找到一致性大于30%，并且序列覆蓋度足夠大的蛋白晶體作為模板蛋白，對于后續分子對接研究具有可靠性。而在實際操作中，模板蛋白與目標蛋白一致性最高達到98.97%，最低也有54.19%，利用Discovery Studio 2019軟件將同源建模得到的蛋白質三維結構與模板蛋白進行結構疊合結果如圖1所示，列舉a、b、c和d為序列一致性從高到低的4個模建蛋白和模板蛋白的疊合結果，從結果看蛋白質的結構包括催化三聯體高度重合，表現出保守性。而各別蛋白結構LOOP表現為個體差異，但遠離活性中心。

注：a、b、c、d分別是一致性從高到低擬果蠅(98.97%)、印度跳蟻(70.7%)、二斑葉螨(54.19%)、伊氏葉螨(54.19%)的建模蛋白與模板蛋白的疊合視圖，活性中心氨基酸以球狀表示，其余氨基酸以帶狀表示。

2.2 模建蛋白質量評估

SAVES服務器提供了ERRAT、Verify-3D、PROVE、WHATCHECK、PROCHECK等5個質量評估程序，通常超過3個程序獲得PASS結果則該蛋白結構即為合理可靠，可進行下一步分子對接研究。本研究利用SAVES服務器的ERRAT、Verift-3D和PROCHECK程序對不同物種AChE同源模建蛋白進行立體化學、序列和結構的匹配度等方面的合理性評估。其中ERRAT程序以85%、Verift-3D以80%、PROCHECK以90%為質量合格標準，通過評估所有30個物種的AChE同源模建蛋白質量均達到合格標準，如圖2所示。

圖2 30個物種AChE模建蛋白在ERRAT、Verift-3D和PROCHECK程序中質量評估表現

為展示模型在評估軟件中的質量表現，選則與模板蛋白相似性為54.19%的伊氏葉螨乙酰膽堿酯酶(TeAChE)模建蛋白在不同程序中的評估結果如圖3所示，拉氏圖結果顯示落在最佳合理區的氨基酸占88.2%，落在允許區氨基酸占11.1%，大致允許區占0.4%，有99.7%的氨基酸分布在允許區，說明蛋白模型較為合理。而ERRAT和Verift-3D打分結果分別是87.582%、87.62%，進一步證明了模建蛋白構建的可靠性。

圖3 伊氏葉螨乙酰膽堿酯酶(TeAChE)模建蛋白在ERRAT、Verift-3D和PROCHECK程序中質量評估結果

2.3 分子對接結果

分子對接結果以受體蛋白和配體分子間的結合能(Binding energy)值的大小來評價，結合能值越小二者結合的越緊密[5]。如圖4所示，大部分物種的AChE對有機磷農藥都表現出敏感性，但是從敏感趨勢上來看絕大部分物種對乙酰甲胺磷(Acephate)、敵敵畏(Dichlorvos)、馬拉硫磷(Malathion)、久效磷(Monocrotophos)、二溴磷(Naled)和氧樂果(Omethoate)表現出強親和力，總結合能在-1700kcal·mol-1以上，而對涕滅威(Carbanolate)、地蟲磷(Fonofos)、甲基對硫磷(Methyl_parathion)、八甲磷(Schradan)和特丁硫磷(Terbufos)表現出弱親和力，總結合能在-690kcal·mol-1以下。另外，黑尾葉蟬和二斑葉螨的乙酰膽堿酯酶與甲基對硫磷(Methyl_parathion)、胺磷(Phosphamidon)和八甲磷(Schradan)未體現出非鍵相互作用力，從三維空間對接構象分析是由于這3種有機磷分子沒有完全包埋在活性中心空腔里。

圖4 25種有機磷農藥與30個物種乙酰膽堿酯酶分子對接結合能結果

為了從結構方面充分了解各物種與有機磷農藥的具體相互作用，本研究從半翅目、雙翅目、鱗翅目、同翅目、鞘翅目等11個目的30個物種中挑選出斜紋夜蛾、三化螟(鱗翅目)和桔小實蠅、家蠅(雙翅目)4個物種的AChE與有機磷農藥分子對接結合能最高的模型進行三維空間構象和非鍵相互作用力的分析。

利用DS 2019的Ligand Interactions和Show 2D Diagram模塊分析家蠅AChE和二溴磷的結合模式以及非鍵相互作用力如圖5所示，對接結果的三維模式顯示二溴磷(Naled)分子完全包埋在受體蛋白的活性位點空腔之內，另外TYR151、GLY228、HIS557 3個氨基酸主要通過氫鍵與配體相互作用，而Trp163、Phe407、Trp447、Phe448與配體分子產生疏水相互作用。其中，屬于催化三聯體成員的HIS557與配體分子同時形成傳統氫鍵、碳氫鍵和疏水相互作用力，氫鍵鍵長1.26?，一般而言氫鍵鍵長在2?以下被認為是強氫鍵，由此可知該氨基酸對于受體蛋白和配體分子之間的強結合能貢獻值較大。

圖5 家蠅乙酰膽堿酯酶與二溴磷的結合模式和相互作用力

桔小實蠅AChE與敵敵畏(Dichlorvos)的結合模式和相互作用力如圖6所示，對接結果的三維模式顯示敵敵畏(Dichlorvos)分子完全包埋在受體蛋白的活性位點空腔之內，GLY203、SER290和HIS532主要通過氫鍵與配體相互作用，而TYR126、TRP138、ALA291、TRP323、LEU380、PHE382、TYR422、PHE423、PHE492等9個氨基酸與配體產生疏水相互作用。屬于催化三聯體成員的HIS532同時與配體分子形成傳統氫鍵和疏水相互作用力，氫鍵鍵長1.62?。

圖6 桔小實蠅乙酰膽堿酯酶與敵敵畏的結合模式和相互作用力

三化螟AChE與乙酰甲胺磷(Acephate)的結合模式和相互作用力如圖7所示，對接結果的三維模式顯示乙酰甲胺磷(Acephate)分子完全包埋在受體蛋白的活性位點空腔之內，GLY232、GLY234、SER314、HIS554主要通過氫鍵與配體相互作用，TRP443和ALA555 2個氨基酸與配體產生疏水相互作用，而TRP199通過Pi-Sulfur鍵和疏水相互作用于配體分子。值得注意的是，催化三聯體成員的HIS554與配體分子同時產生傳統氫鍵、Pi-Sulfur鍵和疏水相互作用，其中氫鍵鍵長2.46?。另外，GLY234與配體分子以氫鍵產生相互作用，鍵長3.06?。

圖7 三化螟乙酰膽堿酯酶與乙酰甲胺磷的結合模式和相互作用力

斜紋夜蛾AChE與久效磷(Monocrotophos)的結合模式和相互作用力如圖8所示，對接結果的三維模式顯示久效磷(Monocrotophos)分子完全包埋在受體蛋白的活性位點空腔之內，GLY231、TYR233、TYR244和HIS553主要通過氫鍵與配體分子相互作用，TYR235、TYR442、PHE443和ALA554等4個氨基酸與配體分子形成疏水相互作用。催化三聯體成員HIS553與配體分子同時形成傳統氫鍵和疏水相互作用，氫鍵鍵長2.9?。另外，TYR244與配體分子形成鍵長為2.24?、2.64?的2條碳氫鍵和鍵長為2.35?的1條傳統氫鍵，這對于提升受體蛋白和配體分子的親和力來說貢獻顯著。

圖8 斜紋夜蛾乙酰膽堿酯酶與久效磷的結合模式和相互作用力

3 討論

本研究利用同源建模和分子對接技術研究了30個物種的乙酰膽堿酯酶和25種有機磷農藥分子間的相互作用，結果顯示絕大部分物種的AChE對25種有機磷農藥都有親和力，僅個別有機磷農藥對某些物種未體現出對接構象，如黑尾葉蟬和二斑葉螨AChE與甲基對硫磷(Methyl_parathion)、胺磷(Phosphamidon)等，說明相較而言這些物種對這幾種有機磷農藥敏感性較低，從結構上來說利用定點突變來提高這些物種對各類有機磷農藥的敏感性，對于發掘有機磷快檢新酶源有很大空間。從分子對接空間構象上看，各物種與有機磷農藥的相互作用主要體現在傳統氫鍵、碳氫鍵、疏水作用和Pi-Sulfur鍵等非鍵相互作用，拋開范德華力和其他類型的作用力，其中傳統氫鍵和碳氫鍵對受體蛋白和受體分子之間的結合能貢獻較大，而Alkyl鍵和Pi-Alkyl鍵等疏水作用次之。從上述例子來看，對接過程受體蛋白結構中催化三聯體之一的組氨酸與配體分子至少產生2個以上的相互作用。這對于配體穩定的結合在活性中心非常重要。另外，通過例子可以觀察到一些有意思的現象：色氨酸(家蠅：TRP63；桔小實蠅：TRP138、TRP323；三化螟：TRP443)，這些氨基酸的疏水側鏈(吲哚基團)為富電子芳香環側鏈，丙氨酸(家蠅：PHE407、PHE448；桔小實蠅：PHE382、PHE423、PHE492；斜紋夜蛾：PHE443)，在對接過程中可作為外周陰離子位點、?；诖被峄蛘邊⑴c芳香引導機制[14]，這對提高農藥分子和受體蛋白的親和力往往起到正向作用。桔小實蠅和斜紋夜蛾的絡氨酸TYR422與TYR442，三化螟和斜紋夜蛾的丙氨酸ALA555和ALA554，都為相同位置氨基酸，與不同農藥分子產生相同的作用力，說明這些氨基酸在乙酰膽堿酯酶和農藥分子進行互作的過程中功能是保守的，而根據這些氨基酸的性質來看都屬于非極性疏水氨基酸，與乙酰膽堿酯酶三維空間結構研究結論中的酰胺骨架和芳香引導機制高度吻合。氫鍵方面，家蠅的甘氨酸GLY228，三化螟GLY232、GLY234，斜紋夜蛾GLY231、GLY233為同位置氨基酸，對接過程中作為氧陰離子洞組成氨基酸發揮重要作用。而催化三聯體組成氨基酸組氨酸，在對接過程中發揮最重要的作用，這個位點氨基酸可能成為在對乙酰膽堿酯酶農藥敏感性改進過程中的潛在突變位點。

4 結論

本研究結果表明，通過同源建模的方法來構建晶體結構未知的不同物種乙酰膽堿酯酶的三維結構蛋白的方法可靠。以此為基礎進行分子對接研究，結果顯示30個物種的乙酰膽堿酯酶和25種有機磷農藥分子絕大部分都體現出親和力，說明在現實情況下這些農藥對的有效性。與此同時，三維空間結合模式分析表明，不同物種與有機磷農藥分子間的相互作用力來源于氫鍵和疏水作用居多，作用模式基本符合外周陰離子位點、酰胺骨架、?；诖?、氧離子洞和芳香引導機制等乙酰膽堿酯酶功能位點假說。另外，通過篩選可從30個物種中挑選與有機磷分子結合最優的物種作為有機磷農藥快檢的新酶源，這具有現實意義。