嗜黏蛋白阿克曼菌對鯉糖代謝的調控機制

王亞娓， 黃真屹， 楊博雅， 游 富， 張新黨,2，楊國坤,2， 常緒路,2， 馮世坤,2， 孟曉林,2*

(1. 河南師范大學水產學院，河南 新鄉 453007；2. 河南省水產動物養殖工程技術研究中心，河南 新鄉 453007)

近年來，隨著水產品的需求量不斷增加，優質蛋白資源短缺已成為限制水產養殖快速發展的因素[1]。因此，尋找新型蛋白源或使用低廉的非蛋白質能量物質是目前水產養殖行業的焦點之一[2]。糖類作為三大能源物質之一，價格低廉、來源廣泛，研究表明，在飼料中添加糖類不僅可以滿足機體的能量需求，還能夠發揮“蛋白質節約”效應[3]。有關糖類在水產飼料中的應用早在20世紀40—50年代就有跡可循，研究發現，糖類在魚體內作為能源物質能夠促進機體生長發育，提高魚類的生長效率和蛋白質效率[4]。除此之外，在飼料中添加適宜水平的糖類一方面能夠改善飼料的物理性狀，降低飼料成本，另一方面可以進行生物氧化產生ATP，有利于機體活化氨基酸，減輕氮排泄造成的養殖水體污染。然而，與哺乳動物相比，魚類對糖類的耐受能力較低，被認為是天然的“糖尿病患者”[5]，飼料中添加的糖水平過高會導致魚類發生應激反應，降低飼料利用率，葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)活性下降，血糖水平持續偏高，且高糖還會導致肝臟腫大、糖原累積，影響魚類正常肝功能[6]。此外，高糖飼料還會改變魚類腸道內微生物的菌群組成與結構，造成腸道菌群失調，從而導致魚類代謝紊亂[7]，有研究分別用含0%、10%、20%、30%和40%糊精的飼料飼喂鯉(Cyprinus carpio)、真鯛 (Pagrus major)、鰤(Seriola) 30 d，發現當糊精水平達到40%時鯉的生長才受到影響[8]。

研究表明，腸道菌群可通過多種作用機制調控魚類糖代謝，包括調節膽汁酸代謝[9]、產生腸源性短鏈脂肪酸(SCFAs)[10]、促進脂多糖(LPS)或肽聚糖的產生[11]等。嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila，Akk)作為二代益生菌，于2004年首次從人體糞便中分離出來，研究發現，Akk能夠促進機體腸道屏障完整性[12]、調節免疫反應[13]、抑制腸道炎癥[14]、減輕肥胖以及防治胰島素抵抗、總膽固醇升高和脂肪組織儲存[15]等代謝性疾病。此外，相對于正常群體，處于糖尿病前期的病人或Ⅰ型糖尿病小鼠(Mus musculus)體內Akk豐度顯著降低，表明Akk與糖尿病之間存在聯系[16-17]。在哺乳動物中，Akk代謝產生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，與G蛋白偶聯受體(GPCR)結合后促進腸道L細胞分泌GLP-1調控機體糖代謝[18]。人體實驗探究Akk作為補充劑的安全性及相關參數(即胰島素抵抗、循環脂質、內臟肥胖和體重)，證實Akk的安全性及耐受性[19]。由于Akk是嚴格厭氧菌，限制了其在水產中的應用，巴氏滅活的Akk是安全使用的有效方式之一，研究發現，Akk產生的有益效果不會隨著巴氏滅活而減少，即巴氏滅活的Akk同樣能夠降低胰島素抵抗，改善血脂異常，且效果相對于活菌更加顯著[20]。綜上所述，目前關于Akk作用的研究多聚焦在血糖平衡、脂肪堆積、腸道通透性和體重等方面，且大多局限于人類及哺乳動物，有關Akk在魚類糖代謝調控中的具體作用機制目前尚不清楚。

因此，本實驗以鯉為研究對象，探究Akk及GLP-1對飼料中不同糖水平的時空響應及其反饋調節，闡明P-Akk介導GLP-1調控鯉葡萄糖代謝的分子作用機制。研究結果有助于進一步認識腸道益生菌Akk在鯉糖代謝調控過程中的作用，從腸道菌群-內分泌激素軸的角度完善雜食性魚類糖代謝的內分泌調控網絡，為Akk應用于飼料添加劑奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料及養殖管理

不同葡萄糖水平實驗(實驗1) 以酪蛋白和明膠作為蛋白源，魚油和豆油作為脂肪源，分別添加20%、30%、40%、50%的葡萄糖，共配制4種飼料，飼料配方見表1。

表1 實驗飼料組成及營養水平(干物質%)Tab. 1 Composition and nutrient levels of experimental diets ( dry matter %)

配制飼料前，所有原料必需經過粉碎機粉碎，且全部過60目篩。將所有粉碎好的飼料原料按配方混勻后加入魚油和豆油，手工將油脂微粒搓散、混勻，最后再加入適宜蒸餾水使粉狀飼料成團，用飼料顆粒機制成粒徑2.5 mm的顆粒飼料，晾干后置于?20 °C冰箱保存備用。

實驗鯉購買自延津縣漁場(新鄉，河南)。實驗開始前禁食24 h，選擇初始體重為(10.5±1.0) g、體格健壯的鯉幼苗360尾，隨機分為4組∶C組(20%葡萄糖)、L組(30%葡萄糖)、M組(40%葡萄糖)、H組(50%葡萄糖)，每組3個養殖桶，每桶30尾，養殖實驗在河南師范大學水產養殖基地進行，養殖期間每3天換水量為總體積的1/3，光照∶黑暗=1∶1，水溫維持在(25±1) °C，pH為6.5～7.8，每日3次定時、定量(體重的3%)投喂。

在養殖4周(4W)、8周(8W)時分別進行取樣，取血清、腸道和腸道內容物置于離心管中，－80 °C冰箱保存。本研究獲得了河南師范大學實驗動物管理和使用倫理委員會批準，實驗過程中操作人員嚴格遵守倫理規范，并按照河南師范大學倫理委員會制定的規章制度執行。

添加P-Akk實驗(實驗2) Akk的培養。嗜黏蛋白阿克曼菌購自德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)DSM 22959。首先配制BHI黏蛋白培養基，用99.999%的氮氣除氧，121 °C滅菌30 min，放入厭氧箱中冷卻備用，將Akk接種在厭氧培養基中，環境溫度為37 °C，厭氧培養36 h，通過稀釋涂布平板法計算活菌數，以OD值為橫坐標，以平板計數濃度為縱坐標建立標曲。P-Akk∶Akk在70 °C滅菌30 min。

根據實驗1的結果，將葡萄糖添加水平為40%組作為基礎飼料，選擇大小為(16.78±0.39) g、體格健壯的黃河鯉240尾，隨機分為NC組(40%葡萄糖)、LP組(40%葡萄糖+108CFU/g P-Akk)、MP組(40%葡萄糖+109CFU/g P-Akk)、HP組(40%葡萄糖+1010CFU/g P-Akk)組，每組3個重復，每桶20尾，養殖4周。接種Akk，測OD值，計算每天添加到飼料中3個濃度P-Akk所需的量，每次投喂前1 h，對P-Akk進行離心，無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸后噴灑至基礎飼料上，晾干后進行飼喂，養殖實驗管理同實驗1。

1.2 樣品采集

不同葡萄糖水平實驗開展4 W時，每桶隨機選4尾鯉，每組總共12尾鯉用MS-222麻醉，測定其體長、體高、體寬和終末重量，其后尾靜脈取血置于2 mL離心管中，室溫靜置4 h后7500×g離心10 min，將血清分裝后于?20 °C保藏備用。解剖分離內臟團，取出腸道用PBS沖洗干凈，剪取1 cm左右前腸分別放入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中，另取腸道內容物、肝臟和腸道(前腸、中腸)置于離心管中，?80 °C保存；剩余的魚繼續養殖，第8 W時按照上述操作取樣。添加PAkk實驗開展4 W取樣操作亦同上。

1.3 生長指標測定

在養殖8 W后，每組選取12尾鯉測量體重、體長、內臟團及肝臟的重量，以此計算如下生長指標∶

存活率(SR，%)=(終末魚數/初始魚數)×100%；

增重率(WGR，%)=(末重?初重)/初重×100%；

特定生長率(SGR，%)=Ln(末重/初重)/天×100%；

飼料系數(FCR，%)=總飼料消耗量/(終末總重?初始總重)×100%；

肝體比(HIS，%)=(肝臟重/全魚重)×100%；

臟體比(VSI，%)=(內臟重/全魚重)×100%；

肥滿度(CF，g/cm3)=(體重/體長3)×100。

1.4 腸道組織形態分析

將腸道組織進行脫水、透明之后用自動包埋機進行包埋，使用切片機進行切片，厚度為7 μm。按照試劑盒說明書染色，封片后使用光學顯微鏡觀察腸道絨毛高度及肌層厚度。

將腸道組織從戊二醛溶液中取出，使用乙醇溶液進行梯度脫水，加入叔丁醇沒過組織，4 °C放置至叔丁醇凝固，真空干燥，噴金處理后在掃描電子顯微鏡下進行觀察、拍照。

1.5 GLP-1含量測定

將GLP-1a、GLP-1b蛋白用CBS梯度稀釋后4 °C過夜，加入封閉液37 °C孵育2 h；PBST清洗5次，拍干后分別加入GLP-1a、GLP-1b抗體稀釋液，37 °C放置2 h；PBST清洗后拍干，加入抗體稀釋液于37 °C放置1 h；用PBST清洗5次后拍干，TMB顯色后37 °C放置30 min，2 mol/L H2SO4終止顯色，酶標儀OD450讀數，繪制標準曲線。將血清或者腸道蛋白用CBS進行稀釋，其余操作同上。

1.6 糖代謝相關基因的檢測

將收集好的樣品加入TRIzol后進行破碎，并按照試劑盒說明書提取肝臟、腸道組織RNA，提取的RNA調節好濃度后按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA作為模板，18SrRNA基因作為內參進行實時熒光定量PCR。所用引物如表2所示，用公式2?△△CT計算基因的mRNA相對表達水平。

表2 實時熒光定量PCR引物Tab. 2 Real-time PCR primers

1.7 腸道內容物短鏈脂肪酸及Akk豐度檢測

短鏈脂肪酸(SCFAs)的檢測 稱取腸道內容物置于離心管中，加入飽和氯化鈉溶液混合均勻，酸化后用渦旋儀處理使樣品充分溶解，加入乙醚振蕩30 s，4 °C、12000 r/min離心10 min，取上清液，加入無水硫酸鈉，振蕩30 s后4 °C、4500 r/min離心3 min，用0.22 μm濾膜過濾后將樣品加入到進樣瓶中，使用氣相色譜儀檢測腸道內容物中短鏈脂肪酸含量。

Akk定量分析 Akk厭氧培養36 h后使用稀釋涂布平板法計算活菌數。根據已有研究[21]確定Akk引物序列如表3，并驗證其具有特異性。通過構建含Akk 16SrRNA部分片段的重組質粒，確定Akk實時熒光定量PCR標準曲線。按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAamp，德國)說明書提取鯉腸道內容物DNA，檢測DNA濃度后－80 °C冰箱保存。根據預實驗確定每孔100 ng DNA的加樣量，按照反應體系和條件進行熒光定量PCR，根據標準曲線確定Akk豐度。

表3 不同糖水平飼喂對鯉生長指標的影響Tab. 3 Effects of different sugar levels on C. carpio growth indexes

1.8 原代肝臟、腸細胞孵育實驗

將鯉麻醉后用75%乙醇擦拭魚體表面，冰上解剖后取出肝臟、腸道組織放入預冷的含有HBSS的50 mL離心管中，在超凈臺中將組織轉移至無菌培養皿，挑出血塊及結締組織并將其剪碎后反復沖洗3～4次。向30 mL HBSS中加入60 μL EDTA(0.5 mol/L)，輕搖2～3 min至肝臟組織蓬松。棄去上清液，使用HBSS清洗肝臟碎片，每次3 min，共3次。向30 mL HBSS中加入150 ng膠原酶Ⅳ和400 U Dnase Ⅱ(腸道組織用膠原酶Ⅰ、Ⅳ處理)，密封后于28 °C水浴鍋中均勻搖晃25 min。消化完畢后，用巴氏吸管反復吹打組織30～40次，使用細胞篩(200目)過濾后轉移至50 mL離心管中，離心后棄去上層HBSS。加入預冷的DMEM培養基，密封后離心。棄去上層液體，用DMEM培養基(含10% FBS)重懸細胞，取等量臺盼藍及細胞懸液進行混合，于倒置顯微鏡下計算細胞數量，每孔細胞培養板接種約105個細胞，28 °C生化培養箱過夜培養。第2天將培養基更換為無血清的DMEM培養基，1 h后進行后續處理。

使用不同濃度的P-Akk (0、108、109、1010個/mL，分別記為P0、P8、P9、P10)孵育原代細胞(n=6)。1、3 h和6 h后吸棄培養基，更換為TRIzol或RIPA以便收集細胞裂解液，?80 °C冰箱保存直至提取RNA，方法同“糖代謝相關基因的檢測”。

1.9 數據處理與分析

本實驗中所有數據均使用PASW Statistics 18.0軟件進行，組間差異的計算采用單因素方差分析(ANOVA)。相關基因的表達用2?△△CT方法計算。使用GraphPad Prism 8.0.2(GraphPad Software Inc., 美國)作圖，所有數據均以平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示，P＜ 0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同糖水平對鯉生長性能的影響

不同葡萄糖水平飼喂8周后鯉的末重相對于C組均顯著升高，但各組間增重率、特定生長率及飼料轉化率無顯著性差異(P＞ 0.05)。與C組相比，L組、M組的肥滿度顯著升高，H組有升高的趨勢，但未達到顯著水平(P＞ 0.05)。高糖飼喂后鯉的肝體比、臟體比相對于C組有所增加，但僅在M組中達到顯著水平(P＜ 0.05)(表3)。

2.2 飼料中不同葡萄糖水平對GLP-1含量、Akk豐度的影響

與20%葡萄糖添加組相比，高糖飼料顯著降低鯉血清中GLP-1b含量，GLP-1a無顯著性變化(P＞ 0.05)。4W時，高糖飼料顯著降低鯉腸道中GLP-1a含量，GLP-1b在L組、M組顯著降低(P＜ 0.05)。8W時，L組中GLP-1a的含量顯著降低，GLP-1b在各組間無顯著性差異(P＞ 0.05)(圖1)。

圖1 不同糖水平對鯉血清(a) (b)和腸道(c) (d)GLP-1含量的影響C. 20% 葡萄糖組，L. 30% 葡萄糖組，M. 40% 葡萄糖組，H. 50% 葡萄糖組，下同。Fig. 1 Effects of different glucose levels on GLP-1 content in serum (a) (b) and intestine( c) (d) of C. carpioC. 20% glucose group, L. 30% glucose, M. 40% glucose, H. 50% glucose, the same below.

隨著葡萄糖添加水平升高，4 W時腸道內容物中Akk豐度逐漸降低，并在M組及H組達到顯著水平，但8 W后各組之間已無顯著性差異(P＞ 0.05)(圖2)。

圖2 不同糖水平對鯉腸道內容物中Akk豐度的影響Fig. 2 Effects of different glucose levels on the abundance of Akk in intestinal contents of C. carpio

2.3 P-Akk對鯉血清生化指標及腸道組織形態的影響

添加P-Akk后檢測鯉血清中葡萄糖、TG、ALT及AST含量，結果顯示，相較于對照組，添加P-Akk后血清中葡萄糖濃度顯著降低(P＜ 0.05)，TG含量在LP組、MP組顯著降低(P＜ 0.05)，ALT、AST相較于NC組無顯著性差異(P＞ 0.05)(圖3)。

圖3 不同濃度P-Akk對鯉血清生化指標的影響NC. 40%葡萄糖，LP. 40%葡萄糖+108 CFU/g P-Akk，MP. 40%葡萄糖+109 CFU/g P-Akk，HP. 40%葡萄糖+1010 CFU/g P-Akk，下同。Fig. 3 Effects of different P-Akk levels on serum biochemical indexes of Cyprinus carpioNC. 40% glucose, LP. 40% glucose + 108 CFU/g P-Akk, MP. 40% glucose + 109 CFU/g P-Akk, HP. 40% glucose + 1010 CFU/g P-Akk, the same below.

腸道組織掃描電鏡及AB-PAS染色結果顯示，絨毛上黏蛋白被染成紫色。NC組腸絨毛破裂，微絨毛稀釋，腸道損傷嚴重，添加P-Akk恢復高糖飼料誘導的腸道損傷，且MP組腸絨毛較為完整，破裂情況明顯減少，腸絨毛上黏蛋白大量增多；此外，LP組和HP組絨毛高度顯著高于NC組，MP組和HP組肌層厚度顯著變厚(P＜ 0.05)(圖4)。

圖4 不同濃度P-Akk對鯉前腸組織形態的影響(a) 1～4. 掃描電鏡觀察，5～8. AB-PAS染色；SH. 實驗損傷，V. 腸絨毛，M. 肌層。Fig. 4 Effects of different P-Akk levels on the intestine morphology of C. carpio(a) 1-4. scanning electron microscope observation; 5-8. AB-PAS staining; SH. experimental damage, V. villus, M. muscularis.

2.4 P-Akk對鯉GLP-1及糖代謝相關基因表達量的影響

飼喂P-Akk后相較于對照組，鯉血清中GLP-1a無顯著性變化，GLP-1b含量顯著降低(P＜ 0.05)。P-Akk顯著降低腸道組織中GLP-1a、GLP-1b的含量(P＜ 0.05)。不同濃度的P-Akk處理原代腸細胞1 h后GLP-1a含量無顯著性差異，GLP-1b在P10組顯著降低(P＜ 0.05)。3 h后，GLP-1a、GLP-1b在P9組、P10組顯著降低(P＜ 0.05)。P-Akk處理6 h后，GLP-1a含量無顯著變化，GLP-1b含量相對于P0組顯著降低(P＜ 0.05)(圖5)。

P-Akk處理顯著升高pi3k的mRNA表達量，pfk、ampk1的mRNA表達水平在MP組顯著升高，gk的mRNA表達量在MP組、HP組顯著升高，pepckmRNA表達水平在MP組顯著降低(P＜ 0.05)(圖6)。

圖6 不同濃度P-Akk對鯉肝臟糖代謝相關基因表達的影響Fig. 6 Effects of different P-Akk levels on the expression of glucose metabolism related genes in liver of C. carpio1. gk, 2. pfk, 3. gys, 4. g6pase, 5. pepck, 6. pygl, 7. ampk1, 8. ampk2, 9. akt, 10. pi3k.

原代肝細胞孵育結果顯示，P-Akk處理后gk、pfk、gysmRNA表達水平顯著升高(P＜ 0.05)。P-Akk處理3 h后，pi3k的mRNA表達量在高濃度組顯著升高，6 h時，ampk2在P8組、P9組顯著升高，其他基因無顯著變化(P＞ 0.05)(圖7)。

圖7 不同濃度P-Akk對鯉原代肝細胞糖代謝相關基因表達的影響Fig. 7 Effects of different P-Akk levels on the expression of glucose metabolism related genes in primary hepatocytes cells of C. carpio(a) gk, (b) pfk, (c) pepck, (d) gys, (e) ampk1,(f) ampk2, (g) pi3k, (h) akt.

添加P-Akk后muc2 mRNA表達水平逐漸升高，并在MP組、HP組達到顯著水平(P＜ 0.05)。腸細胞孵育實驗結果顯示，P-Akk顯著升高黏蛋白muc2 mRNA表達水平，但6 h時各組間已無顯著差異(P＞ 0.05)(圖8)。

圖8 不同濃度P-Akk對鯉腸道(a)和腸細胞(b) muc2 mRNA表達的影響Fig. 8 Effects of different P-Akk levels on the muc2 mRNA expression in intestine (a) and intestinal cells (b) of C. carpio

2.5 P-Akk對鯉SCFAs及其受體的影響

P-Akk處理后腸道內容物中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、異戊酸及總SCFAs含量相較于對照組都升高，并在MP組達到顯著水平(P＜0.05)(圖9)。

圖9 不同濃度P-Akk對鯉腸道內容物中短鏈脂肪酸含量的影響Fig. 9 Effects of different P-Akk levels on the content of short chain fatty acids in the intestine of C. carpio

添加P-Akk后相較對照組，gpr40的mRNA表達量升高，其中g32在MP組、HP組顯著升高，g34、g48-1、g48-4的mRNA表達量在MP組顯著升高(P＜ 0.05)。原代腸細胞再次證明P-Akk顯著升高g34、g48-1、g13的mRNA表達水平(P＜ 0.05)(圖10)。

圖10 不同濃度P-Akk對鯉腸道(a)和腸細胞(b) (c) (d) (e)gpr40 mRNA表達的影響Fig. 10 Effects of different P-Akk levels on the gpr40 mRNA expression in the intestine (a) and intestinal cells (b) (c) (d) (e) of C. carpio(a) 1. gpr40-g32, 2. gpr40-g34, 3. gpr40-g48-1, 4. gpr40-g48-4; (b) gpr40-g31; (c) gpr40-g34; (d) gpr40-g48-1; (e) gpr40-g13-1.

3 討論

碳水化合物作為自然界常見的能源物質添加到飼料中可以起到節約蛋白質、降低成本的作用，但不同環境、食性的魚類對碳水化合物的利用能力不同，飼料中糖類過高或過低均會導致腸道菌群紊亂，對魚體產生不利影響，如降低生長性能[22]、誘導肝臟和腸道損傷等。鯉作為雜食性魚類對糖類物質的耐受能力相對于其他食性的魚類較高，但是這種能力不足以使鯉完全消化飼料中的糖類物質。攝入高糖后魚體血糖含量隨飼料中糖水平的升高而持續上升[23]，誘導肝臟、腸道損傷，腸道菌群紊亂[24]，長期高糖毒性使得活性氧及炎性介質增加，進而損傷腸道L細胞，導致GLP-1分泌缺陷，具體表現為GLP-1分泌減少、腸道炎癥反應、腸道菌群失調、胰島素抵抗等[25]。本研究發現，高糖飼料顯著增加鯉的末重、肝體比、臟體比和肥滿度，且40%的葡萄糖添加組效果較為顯著，與大黃魚(Larimichthys crocea)和點帶石斑魚(Epinephelus coioides)的研究結果類似[26]。此外，隨著葡萄糖添加水平升高，血清及腸道中GLP-1a、GLP-1b含量降低，表明高糖飼料抑制腸道組織中GLP-1分泌，推測GLP-1具有升血糖的作用，但具體作用機制尚不清楚。

腸道微生物與宿主之間相互影響，具有營養、防御和免疫調節等生理功能，能夠促進機體生長發育[27]。Akk作為二代益生菌，其豐度與機體代謝疾病相關，在各種肥胖或其他代謝紊亂的小鼠模型中顯著減少，具體表現為瘦素缺陷型[18]、高脂飼料飼喂[28]、T2DM小鼠等，添加Akk或巴氏滅活的Akk能夠改善肥胖、胰島素抵抗、肝臟脂肪變性等代謝綜合征[15]，調節高脂、高糖飲食引起的代謝紊亂，且109CFU/mL的Akk滅活后效果相對更好[29-30]。本研究發現，高糖飼料顯著降低鯉腸道內容物中厭氧菌Akk豐度，用P-Akk處理后鯉血清中葡萄糖、TG含量顯著降低，肝臟糖酵解基因mRNA表達水平顯著升高、糖異生基因mRNA表達量顯著降低，表明P-Akk通過調控糖代謝相關酶活力及基因表達調控機體糖代謝過程，降低血糖含量，即P-Akk同Akk一樣能夠調節糖、脂代謝，緩解高糖飼料引起的代謝紊亂[31]。Dan等[32]研究發現，腸絨毛密度、高度和肌層厚度對增加食糜接觸面積、促進消化吸收至關重要，隨飼料中碳水化合物水平的升高而降低，目前，關于不同糖類及糖水平對魚類腸道健康的影響已有報道，對高體大鱗鲆(Tarphops oligolepis)的研究發現，添加適宜水平的水蘇糖使得遠端小腸褶皺增多，絨毛高度增加，表明適宜的水蘇糖促進腸道對營養物質的吸收，維護腸道健康[33]。腸道組織形態觀察結果顯示高糖飼料導致鯉腸絨毛破裂，微絨毛稀疏，肌層厚度顯著變薄，表明高糖飼料破壞鯉腸道黏膜屏障，降低腸道對營養物質的吸收能力，導致腸道損傷，而P-Akk處理后腸絨毛高度和肌層厚度顯著增加，腸道損傷情況明顯改善，表明P-Akk緩解高糖飼料誘導的腸道損傷，促進糖類物質消化吸收。腸絨毛之間分布大量杯狀細胞，能夠合成并分泌黏蛋白，使黏液層增厚，增強腸道屏障功能，保護腸道健康[34]。黏蛋白具有聚糖、結合水的能力，能夠孵育黏液保持潮濕和潤滑，保護腸上皮細胞免于脫水和機械應力，形成腸道黏膜保護屏障[35]。同時，黏蛋白還能夠為Akk等細菌的生長供能，促使其在腸道中定植。Akk是一種能夠分解利用黏蛋白作為營養物質的黏液降解菌，Akk分解黏蛋白產生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，又可以誘導黏蛋白的分泌[36]。本研究發現，P-Akk處理后黏蛋白數量增多，muc2的mRNA表達水平顯著升高，SCFAs含量增加，gpr40 mRNA表達量升高，推測P-Akk促進包括Akk在內的產SCFAs菌在腸道中的定植，且109CFU/g效果較為顯著。

Akk代謝產生乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸，進而通過G蛋白偶聯受體(GPR)影響腸道上皮L細胞分泌GLP-1，GLP-1是一種強效腸促激素，能夠調控胰島β細胞分泌胰島素，在調節葡萄糖穩態中具有重要作用[37]。哺乳動物和硬骨魚類由不同的代謝途徑調控，其中幾種主要激素的功能存在差異，尤其是胰島素和GLP-1[38]。在哺乳動物中，GLP-1通過抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素，同時刺激胰島β細胞分泌胰島素，以達到降低血糖的目的[39]。在魚類中，GLP-1對葡萄糖的調控作用類似胰高血糖素，促進糖質新生和肝糖原降解[40]，升高血糖含量。本研究發現隨著葡萄糖添加水平升高，血清及腸道中GLP-1a、GLP-1b含量降低，GLP-1a、GLP-1b與受體結合后激活AMPK、PI3K/AKT信號通路，調節糖代謝相關酶活力及基因表達，促進肝臟糖異生、抑制糖酵解，升高鯉血糖含量。養殖實驗及細胞實驗發現PAkk處理后GLP-1a、GLP-1b含量減少，同時伴隨血糖含量的降低，結合糖代謝基因檢測結果，推測P-Akk影響GLP-1分泌，激活下游信號通路，如AMPK、PI3K/AKT，調控機體糖代謝，與Everard等[18]的研究結果一致。

目前，添加益生菌已經成為促進水產養殖業綠色發展的重要戰略手段，Akk作為二代益生菌具有良好發展前景。近年來，關于Akk的研究多集中在人類及哺乳動物上，Akk在魚類中的作用機制研究還需要不懈努力。本實驗室前期研究發現Akk能夠調控腸道中GLP-1分泌，本研究進一步證實飼料中添加P-Akk的確可以通過介導GLP-1分泌調控鯉糖代謝。這一結果可為P-Akk調控鯉糖代謝提供理論依據，解決了活菌添加不易的難題，且安全性有保障，更有希望廣泛使用。

4 結論

綜上，鯉自身具有一定糖代謝調節能力，通過肝臟糖酵解及糖異生途徑抵抗高糖飼料引起的血糖升高，但糖類水平過高會誘導鯉血糖升高，造成肝臟、腸道損傷。外源添加P-Akk能夠增加鯉腸道內容物中短鏈脂肪酸含量，抑制腸道分泌GLP-1，緩解高糖飼料引起的血糖升高，維持葡萄糖穩態。該研究結果可為Akk作為益生菌在水產飼料中的應用提供理論基礎和實踐依據。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）