振蕩頻率對曼氏無針烏賊成體死亡率及生存狀態的影響

周珊珊， 周永東， 李 哲， 歐陽洪， 鎮小蔓，梁 君， 陳俊琳， 陳佳怡， 徐開達*

(1. 浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316000；2. 浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江 舟山 316000；3. 浙江省普陀區海洋與漁業局，浙江 舟山 316100)

曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)屬軟體動物門(Mollusca)頭足綱(Cephalopoda)十腕總目(Decapodiformes)烏賊目(Sepioidea)烏賊科(Sepiidae)，俗稱墨魚，屬于中型烏賊，曾是我國“四大海產”之一，在我國浙江和福建沿海較為集中。過度捕撈和生境破壞等致使烏賊資源受到嚴重破壞，產量連續下降，曼氏無針烏賊已經無法形成漁汛，因此相關部門開展了一系列的增殖放流工作[1-4]。目前，曼氏無針烏賊增殖放流主要通過放流烏賊受精卵的方式開展，附著的烏賊卵易被海水沖散或因環境因素而不能完全孵化，孵化率低，放流幼體和懷卵親體的方式可以提高烏賊卵的孵化率和幼體存活率[3,5-8]。然而，烏賊在運輸過程中對外界刺激十分敏感，運輸晃動容易使其噴墨而大量死亡，成為制約增殖放流、苗種繁育等過程的關鍵因素[9-10]。

運輸過程中會發生水流的振蕩，振蕩程度可以通過振蕩頻率來量化[11-13]。振蕩頻率影響黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii)幼魚、大口黑鱸(Micropterus salmoides)、石斑魚、鯽(Carassius auratus)等魚類的死亡率，且對乳酸、糖原、酶活性等具有顯著影響，乳酸、糖原、酶活性等生理生化指標是反映機體能量代謝和應激情況的重要指標[11-14]。且谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(GOT)、堿性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性與硫化物、亞硝酸氮對曼氏無針烏賊的脅迫損傷密切相關[15-16]。目前，國內外學者的研究主要集中在烏賊生態學[17-18]、人工繁育[19-21]、生長發育[22-24]、資源分布[25]、分子生物學[26-27]等方面，但仍缺乏運輸過程中振蕩頻率對曼氏無針烏賊死亡率及生存狀態影響的相關研究。因此，本研究選用乳酸、糖原及ALT、GOT、ALP、SOD的活性為指標開展了振蕩頻率對烏賊死亡及機體影響的研究，查明了振蕩頻率對烏賊成體死亡及生存狀態的影響，推測高頻率下曼氏無針烏賊成體的死亡原因，量化烏賊對振蕩頻率所產生的應激程度，為曼氏無針烏賊成體的增殖放流運輸過程提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及馴化

實驗所用曼氏無針烏賊為成體，取自浙江省舟山市西軒養殖試驗場中間培育的烏賊，胴背長為(6.5±0.3) cm，體重為(2.8±0.4) g，且各頻率組間無顯著差異(P＞0.05)。采用上海力辰儀器科技有限公司HY-4A調速多用振蕩器(振蕩幅度20 mm，頻率0～300 r/min)進行實驗。實驗在西軒養殖場進行，暫養1周，每天定時 6∶00、17∶00投喂冰鮮飼料，飼喂后換水，用氧氣泵不斷向水中充氧，保持水中DO＞5.5 mg/L，鹽度為30～31，pH 7.8～7.9，光照周期為12 L∶12 D。實驗開始前24 h停止喂食，然后將烏賊從暫養池中轉入到相同水溫的透明聚乙烯圓形水桶(體積5 L)，將水桶平放于模擬運輸振動臺上并加以固定。實驗過程中操作人員嚴格遵守實驗動物福利和動物實驗倫理規范，并按照浙江海洋水產研究所實驗動物管理及動物福利倫理委員會制定的規章制度執行。

1.2 實驗方法

參考相關文獻[11-14]，并根據預實驗結果，去除短時間內可能會導致烏賊高死亡率，無法進行實際運輸操作的較大頻率。共設 6個處理組，振蕩頻率分別為0、60、100、120、140、160 r/min，每個振蕩設3個平行。實驗持續12 h，各組水溫均為 23 °C，保持DO＞5.5 mg/L，海水鹽度、pH同暫養池，實驗過程不投餌。每個透明聚乙烯圓形水桶內盛放2.5 L海水，放入4只烏賊。

實驗過程中觀察到烏賊浮于表面，鰭的擺動停止，觸碰無反應即判定為死亡，記錄對應時間，并撈出取樣。當烏賊較虛弱的情況下，會出現噴墨情況，為避免噴墨產生的干擾，噴墨后輕柔換水。每組實驗在該組全部樣品死亡后結束，若該組樣品未全部死亡則在實驗進行 12 h 后終止。烏賊經丁香酚快速麻醉后，測量體長和體重，隨后置于冰上快速取其腹部肌肉、肝臟樣品，保存于–80 °C中待測。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定肝臟組織中的乳酸和糖元含量以及各酶的活性。

1.3 數據分析

數據的統計和分析采用SPSS 17.0軟件進行，并以平均值±標準誤(mean±SE)表示，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對烏賊胴背長、死亡率、糖原和乳酸含量、酶活性等數據進行差異分析，以P＜0.05作為差異顯著標準。烏賊死亡率與生理指標間采用Spearman相關性分析，以P＜0.05作為顯著相關標準，以P＜0.01作為差異極顯著標準。同時，利用MINE算法分析各指標與死亡率間的相關性。

2 結果

2.1 不同振蕩頻率下曼氏無針烏賊的噴墨行為及死亡率

曼氏無針烏賊對振蕩產生了一系列的適應性行為，低頻率處理組烏賊靜止匍匐于水槽底部，游動頻率減少。高頻率處理組(120、140、160 r/min)，部分烏賊靜止匍匐于底部，部分烏賊會利用觸腕，纏繞于氣石水管上或貼于玻璃槽壁上(圖版)。當烏賊較虛弱，無法控制墨囊肌肉時，會出現多次噴墨的情況，之后浮于水體表面，處于虛弱假死的狀態，一段時間后死亡。

曼氏無針烏賊死亡時間主要出現在振蕩4～8 h，頻率越低出現死亡的時間越晚。高頻率160 r/min在2 h時即出現死亡。對照組無死亡個體。60、100、120、140、160共5個處理組，在0～3的烏賊死亡數合計為4只，3～6 h死亡數合計為13只，6～9 h死亡數合計為10只，9～12 h死亡個數合計為6只(圖1)。曼氏無針烏賊不宜長時間運輸，振蕩頻率為60 r/min的運輸時間不宜超過6 h，振蕩頻率為100 r/min的運輸時間不宜超過3 h。

圖1 不同頻率下曼氏無針烏賊的死亡時間Fig. 1 Death time of S. japonica at different frequencies1. 1 h 12 min, 2. 2 h 24 min, 3. 3 h 36 min, 4. 4 h 48 min, 5. 6 h, 6. 7 h 12 min, 7. 8 h 24 min, 8. 9 h 36 min, 9. 10 h 48 min.

除160 r/min處理組外，隨著頻率增大，曼氏無針烏賊死亡率逐漸升高，頻率120 r/min、140 r/min時死亡率最高，為91.7%，顯著高于0、60和100 r/min處理組(P＜0.05) (圖2)。

圖2 不同振蕩頻率條件下曼氏無針烏賊的死亡率不同字母表示差異顯著(P＜0.05)。Fig. 2 Death rates of S. japonica at different oscillation frequenciesDifferent letters indicate significant differences (P＜0.05).

圖版 振蕩情況下曼氏無針烏賊的行為過程1. 靜止于水槽底部，2. 觸腕吸附于水槽底部(箭頭)，3. 觸腕纏繞于塑料管(箭頭)，4. 觸腕纏繞于塑料管(腹面觀，箭頭)。Plate Behavior of S. japonica at different oscillation frequencies1. stationary at the bottom of the tank, 2. the tentacles adsorb to the bottom of the tank (arrow), 3. the tentacles wound around the pipe (arrow), 4. the tentacles wound around the pipe (ventral aspect, arrow).

2.2 不同振蕩頻率下曼氏無針烏賊糖原和乳酸含量變化

頻率影響曼氏無針烏賊肌肉和消化腺糖原含量，不同組織糖原變化略有不同(圖3)。隨著頻率的增加，肌肉糖原含量降低，對照組糖原含量最高(39.4 mg/g prot)，140 r/min處理組最低(26.0 mg/g prot)，其次為160 r/min處理組(29.1 mg/g prot)，140 r/min處理組與0、60和100 r/min間差異顯著(P＜0.05)。除60 r/min處理組外，隨著頻率的增加，消化腺糖原含量降低，60 r/min處理組消化腺糖原含量最高(39.4 mg/g prot)，其次為對照組，160 r/min處理組糖原含量最低(26.8 mg/g prot)，100、140和160 r/min組與0 r/min組間差異顯著(P＜0.05)。

圖3 不同振蕩頻率條件下曼氏無針烏賊的糖原含量同一組織不同頻率誤差線上的不同字母表示不同振蕩頻率組間差異顯著(P＜0.05)，圖4同。Fig. 3 Glycogen content of S. japonica at different frequenciesDifferent letters above error bars indicate significant differences between different frequencies groups in same tissue (P＜0.05), the same as Fig.4.

頻率影響曼氏無針烏賊肌肉和消化腺乳酸含量，隨著頻率的增加肌肉乳酸含量升高，對照組乳酸含量最低(0.8 mmol/g prot)，160 r/min處理組最高(1.3 mmol/g prot)，100、120、140和160 r/min組與0 r/min組間差異顯著(P＜0.05)。除60 r/min處理組外，隨著頻率的增加，消化腺乳酸含量增加，0和100 r/min組乳酸含量最低，為 0.9 mmol/g prot，160 r/min處理組糖原含量最高(1.1 mmol/g prot)，60、160 r/min處理組與0 r/min組間差異顯著(P＜0.05) (圖4)。

圖4 不同振蕩頻率條件下曼氏無針烏賊的乳酸含量Fig. 4 Lactic acid content of S. japonica at different frequencies

2.3 不同振蕩頻率下曼氏無針烏賊消化腺酶活性的變化情況

除60 r/min處理組外，隨著頻率的增加，ALT活性降低，120、140和160 r/min處理組與0、60和100 r/min處理組間差異顯著(P＜0.05)，60 r/min處理組ALT活性最高(3.0 U/g prot)，160 r/min處理組ALT活性最低(1.5 U/g prot) (圖5)。除60 r/min處理組外，隨著頻率的增加，GOT活性降低，120、140和160 r/min處理組GOT活性與0、60和100 r/min處理組間差異顯著(P＜0.05)。在頻率60 r/min下最高(4.3 U/g prot)，其次為對照組(3.9 U/g prot)，160 r/min最低(1.2 U/g prot) (圖5)。

圖5 不同振蕩頻率條件下曼氏無針烏賊的ALT和GOT活性同一種酶不同頻率誤差線上的不同字母表示不同頻率組間差異顯著(P＜0.05)，圖7同。Fig. 5 Enzymatic activity of S. japonica at different frequenciesDifferent letters above error bars indicate significant differences between different frequencies group in same enzyme activity (P＜0.05).

ALP活性隨著頻率的增加而增加，0 r/min組最低(5.6 IU/g prot)，140 r/min組最高(7.9 IU/g prot)，140和160 r/min處理組與其他組間差異顯著(P＜0.05)。除頻率60 r/min處理組外，SOD活性隨著頻率的增加而升高，在頻率60 r/min下最低(48.9 U/mg prot)，在140和160 r/min頻率最高(66.5、66.4 U/mg prot)，且120、140和160 r/min處理組與其他組間差異顯著(P＜0.05) (圖6)。

圖6 不同振蕩頻率條件下曼氏無針烏賊的ALP和SOD酶活性Fig. 6 Enzymatic activity of S. japonica at different frequencies

2.4 死亡率與生理指標相關性分析

不同振蕩頻率下，死亡率與SOD、肌肉乳酸含量、ALP之間呈極顯著正相關(P＜0.01)，與肌肉糖原、消化腺糖原含量、GOT和ALT活性之間呈極顯著負相關(P＜0.01) (表1)。

表1 死亡率與生理指標相關性分析Tab. 1 Correlation analysis of mortality and physiological indicators

不同振蕩頻率下死亡率與生理指標相關性較強的前5個生理指標依次為GOT活性、肌肉糖原含量、ALT活性、肌肉乳酸含量和SOD活性(表2)。

表2 MINE算法分析死亡率與生理指標的關系Tab. 2 MINE algorithm analying the relationship between mortality and physiological indicators

3 討論

3.1 振蕩頻率對曼氏無針烏賊行為及死亡率的影響

運輸過程中的晃動是引起水生動物死亡的重要非生物因素，特別對具有噴墨屬性的博克氏蛸(Octopus bocki)、虎斑烏賊(Sepia pharaonis)等來說，噴墨引發較高的死亡率[10,28-30]。在遇到晃動時，曼氏無針烏賊采取靜止匍匐于水槽底部的方式來對抗水流，當高頻率晃動導致個體能量損耗，機體無法平衡匍匐于底部時，曼氏無針烏賊采取觸腕纏繞于水管上或貼于玻璃槽壁上以輔助抵御水流的晃動。曼氏無針烏賊貼底匍匐和噴墨后的虛弱情況與虎斑烏賊噴墨后的情況基本一致[29]。振蕩頻率顯著影響曼氏無針烏賊的死亡率，頻率大于100 r/min時死亡率顯著上升，在120和140 r/min頻率下死亡率最高，且超過160 r/min頻率下的死亡率，分析是由于容器發生了共振，增大了晃動程度。這與姜勝超[31]對波浪作用下液艙內流體晃蕩的耦合數值分析研究相似，在艙外波浪與艙內液體共振時，艙內出現波峰變陡，波谷變坦的非線性特征，并在沖擊頂蓋后呈現出波浪翻卷及氣液混合等復雜物理現象。因此，曼氏無針烏賊在運輸過程中應盡量避免過高的振蕩頻率，特別是避免波峰重疊所造成的高死亡率的發生。

曼氏無針烏賊的死亡時間主要在4～8 h，頻率越低個體出現死亡的時間越晚。黑棘鯛幼魚在頻率低于105 r/min振蕩24 h的死亡率為0，在頻率為140 r/min時死亡率為50%，175、210 r/min時死亡率100%[11]。與黑棘鯛幼魚相比，在振蕩12 h的情況下，烏賊在120、140 r/min時死亡率已經達到91.7%，相對于魚類，其短時間內的死亡率更高。烏賊在100 r/min、運輸12 h的死亡率為33.3%，當頻率上升至120、140 r/min時，死亡率顯著上升至91.6%。因此認為運輸過程振蕩頻率宜低于100 r/min。根據運輸實際，在振蕩頻率大于100 r/min情況下運輸時間不宜超過2 h。

3.2 振蕩頻率對曼氏無針烏賊糖原、乳酸含量的影響

糖原主要存在于肌肉和肝臟中，有氧代謝途徑分解代謝產生葡萄糖，而乳酸則是糖酵解途徑的主要產物。隨著振蕩頻率的增加，曼氏無針烏賊肌肉組織糖原逐漸耗盡，更多的供能來源于糖酵解途徑，形成了乳酸堆積。在振蕩頻率為140 r/min時糖原含量最低，140和160 r/min時乳酸含量較高，這與大口黑鱸、黑棘鯛幼魚、大黃魚(Larimichthys crocea)等在運輸振蕩過程中糖原和乳酸的變化規律一致[11-12,32]。大口黑鱸在3 h，頻率130 r/min的運輸條件下，肌肉糖原含量顯著低于0和60 r/min處理組，而乳酸含量顯著高于0、60和100 r/min處理組。黑棘鯛幼魚、大黃魚隨實驗振蕩頻率的增加，肌肉乳酸濃度和糖元含量分別增加和降低。本研究中140 r/min處理組的糖原含量最低，與該組死亡率最高具有一致性。

烏賊的肝臟與肌肉組織中糖原和乳酸變化趨勢基本一致，但在60 r/min出現了糖原增加、乳酸顯著升高的趨勢，說明烏賊在低頻率的振蕩下，啟動了糖酵解途徑為機體供能，引發了乳酸的堆積，之后肌肉中的乳酸通過血液運輸至肝臟，在肝臟中重新合成了糖原，從而維持機體血糖穩定。因此，60 r/min情況下出現了糖原含量的增加和乳酸含量的顯著升高，同時與肝臟解毒酶(ALT、GOT)活性小幅度的升高有一定相關性。當頻率大于60 r/min，機體可能出現了肝臟損傷，肝臟的乳酸代謝能力降低，糖原的合成也相應降低。這與草魚(Ctenopharyngodon idella)的肝臟糖原代謝有一定差異，脂肪蓄積對草魚肝臟組織影響的相關研究發現，脂肪過量蓄積會導致肝臟內葡萄糖含量上升，乳酸含量下降，肝臟將乳酸合成為糖原為機體供能[33]。

3.3 振蕩頻率對曼氏無針烏賊酶活性的影響

ALT與GOT主要分布在肝細胞內。肝細胞發生病變或壞死時ALT和GOT濃度升高，且升高的程度與肝細胞受損的程度相一致。當脅迫程度增強，機體肝細胞死亡時，酶活性顯著下降[16]。本研究中，曼氏無針烏賊體內ALT和GOT活性在60 r/min振蕩頻率下增加，隨著頻率增大，酶活性在120 r/min處理組出現顯著降低，表明烏賊肝細胞先出現損傷，后發生死亡。本研究結果與硫化物脅迫下曼氏無針烏賊GOT活性變化規律一致[29]。振蕩對烏賊的影響可能還包括噴墨后的微毒性作用。不同頻率烏賊在振蕩運輸后期均發生了噴墨，雖然及時進行了換水，但可能仍有烏賊吸入墨而導致肝臟損傷。

軟體動物不具備特異性免疫，吞噬作用在其防御機制中具有重要作用，ALP是其中一類重要的水解酶，異物被吞噬后與溶酶體結合，再被水解酶消化分解從而完成防御反應[29]。本研究中大于100 r/min的振蕩頻率下ALP活性顯著增加，表明高頻率振蕩刺激了曼氏無針烏賊的免疫反應，這與低濃度條件下亞硝酸氮對曼氏無針烏賊脅迫、氨氮對櫛孔扇貝(Chlamys farreri)脅迫下ALP的變化趨勢一致[15,34]。高濃度亞硝酸氮、氨氮脅迫下曼氏無針烏賊和櫛孔扇貝均出現了酶活性的下降，產生機體損傷，而本實驗中高振蕩頻率下ALP酶活性未出現下降，表明高振蕩頻率并沒有造成烏賊嚴重的機體損傷。SOD可以防止機體受到自由基的損害，受到輕度逆境脅迫時，SOD活性往往升高，而受到重度逆境脅迫時，SOD活性降低，此時機體受到損傷[15]。本研究中140和160 r/min的振蕩頻率下SOD活性顯著升高，說明烏賊受到輕度逆境脅迫，以升高SOD活性來減少高頻率對機體造成的自由基損傷。

3.4 死亡率與生理指標間的相關性

Spearman相關性分析應用于死亡率與免疫組化指標之間的相關性[35-36]。本研究中，不同振蕩頻率下死亡率與SOD活性、肌肉乳酸含量、ALP活性之間呈極顯著正相關，隨著振蕩頻率增加，以上各指標升高、死亡率增加，與烏賊在亞硝酸氮、氨氮等有害物質脅迫下的防御機制相似[15,34]。不同振蕩頻率下死亡率與肌肉和消化腺糖原含量、GOT活性、ALT活性之間呈極顯著負相關。糖原含量越高，死亡率越低，與大口黑鱸、黑棘鯛幼魚、大黃魚等在運輸振蕩過程中能量消耗規律一致[11-12, 32]。

近年來，maximal information-based nonparametric exploration (MINE)算法為非參數變量的相關性分析提供了新策略。與其他基于特定函數的回歸模型不同，MINE算法可以檢測由多個因素驅動的復雜關系，該方法的最大優勢在于其提供了在同一尺度下評價相關性的大小，從而找到關系最強的變量對[37-38]。MINE算法已經廣泛應用于探索生物與環境參數之間的關系，為各類型變量關系提供了一種標準化的數據挖掘解決方案[39-40]。本研究利用MINE算法，得出不同振蕩頻率下死亡率與生理指標相關性較強的前5個生理指標，依次為GOT活性、肌肉糖原含量、ALT活性、肌肉乳酸含量和SOD活性，與Spearman相關性分析結果一致，且與前文已論述的硫化物、亞硝酸氮、氨氮及運輸脅迫條件下的相關研究結果相一致。

綜上所述，振蕩頻率顯著影響成體曼氏無針烏賊的存活率，烏賊產生了一系列行為和生理反應來適應振蕩產生的影響，肌肉能量耗盡和肝胰臟損傷可能是烏賊在運輸過程中高死亡率的主要原因。建議運輸過程中避免較大程度振蕩的發生，振蕩頻率應低于100 r/min且運輸時間少于3 h。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）