草魚TAB2與TAK1蛋白互作鑒定及其對兩種抗菌肽基因表達的影響

楊文飛， 郭佳靜， 趙文平， 李槿年

(安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036)

轉化生長因子-β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase-1, TAK1)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[1]。TAK1結合蛋白家族(TAK1 binding proteins, TABs)包含TAB1、TAB2和TAB3等3個成員[2]。在哺乳動物中已探明TAK1與TAB2的相互作用(簡稱互作)能夠激活NF-κB和MAPK信號通路，進而通過調控抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)、細胞因子和趨化因子等免疫分子表達參與宿主抗菌免疫過程[3]。目前，草魚(Ctenopharyngodon idella)[4-5]、點帶石斑魚(Epinephelus coioides)[6]和大黃魚(Larimichthys crocea)[7-8]等多種硬骨魚類的tak1和tabs基因均被克隆鑒定，且已有報道大黃魚TAB2與TAK1存在互作關系[8]。生物信息學分析顯示，草魚TAB2(CiTAB2)和TAK1(CiTAK1) 與大黃魚相應蛋白的氨基酸同源性分別為73.9%和92.8%，且具有相似的結構域，推測CiTAB2與CiTAK1可能存在互作關系，但仍需驗證。

擬態弧菌(Vibrio mimicus) 是引起魚類弧菌病的常見病原菌[9-11]。由于國內尚無商品化的漁用擬態弧菌疫苗，行業內主要使用抗生素類藥物防治擬態弧菌所致的魚類弧菌病。然而，抗生素類藥物的頻繁使用，不僅增加細菌產生耐藥性，導致抗菌療效甚微，而且造成水環境污染、藥物殘留及水產品安全等問題。因此，亟需探索有效防治魚類弧菌病的新方法。

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是生物體經誘導產生的具有廣譜抗菌活性和免疫調節作用的一類小分子多肽[12]。因其具有廣譜抗菌、作用機理獨特、低耐藥和低致敏等特點，AMPs被認為是最有前景的抗生素替代品。迄今為止，抗菌肽數據庫(http://aps.unmc.edu/AP/)中收錄的魚源AMPs已達100余種。其中，β-防御素1(β-defensin1)和鐵調素 (hepatic bactericidal proteins, hepcidin)是2種富含半胱氨酸，且具有廣譜抗菌活性的抗菌肽[13-14]。

我們前期研究中用Cihepcidin和Ciβ-defensin-1的重組真核表達質粒轉染鯉上皮瘤細胞系(epithelima popuasum cuprini, EPC)細胞，采用平板涂布法檢測并發現轉染后48 h的細胞培養上清液對擬態弧菌生長具有抑制作用。但是，CiTAB2-CiTAK1互作能否促進這2種抗菌肽表達仍不清楚。對此，本研究以CiTAB2與CiTAK1為研究對象，分析Citab2與Citak1對擬態弧菌感染的響應，在細胞水平鑒定這2種蛋白是否存在共定位與互作關系，檢測CiTAB2-CiTAK1互作對抗菌肽基因Cihepcidin和Ciβ-defensin1表達的影響，以期為從蛋白互作調控抗菌肽表達的角度防治魚類弧菌病提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚健康草魚[體重(100 ± 5)g]購自合肥市高新技術農業園。恒溫(26 °C)循環水養殖系統暫養2周，每天定時光照12 h并按其體重的3%早、晚各投喂1次飼料。本研究獲得了安徽農業大學實驗動物管理和使用倫理委員會批準(2019036)，實驗過程中操作人員嚴格遵守安徽農業大學倫理規范，并按照安徽農業大學倫理委員會制定的規章制度執行。

實驗菌株、細胞和載體擬態弧菌菌株04-14由本實驗室從患病草魚體內分離鑒定并保存[15]；草魚腎細胞系(Ctenopharyngodon idellakidney,CIK)和人胚腎上皮細胞系(human embryonic kidney 293T, HEK293T)均由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α(Escherichia coliDH5α)感受態細胞購于北京擎科新業生物技術有限公司；真核表達載體pEGFP-N1、pCMV-Myc和pmCherry-N1由中國農業科學院上海獸醫研究所劉光清研究團隊惠贈。

主要試劑胎牛血清(FBS)、MEM和DMEM細胞培養液均為美國Gibco公司產品；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、TRIzol試劑、FastKing RT Kit (With gDNase)反轉錄試劑盒和SuperReal PreMix Plus熒光定量試劑盒購自天根生物科技(北京)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Lipofectamine 3000、RIPA裂解液和特超敏ECL化學發光試劑盒購自上海碧云天生物技術股份有限公司；Anti-Myc免疫磁珠購自上海翎因生物科技有限公司；Myc-Tag鼠源單克隆抗體、GFPTag鼠源單克隆抗體、pEGFP -Tag鼠源單克隆抗體購自Abways technology。

1.2 擬態弧菌感染后組織中Citab2與Citak1的表達模式分析

實驗用草魚隨機分為感染組和對照組，經濃度為100 mg/L的MS-222麻醉后，分別腹腔注射0.2 mL濃度為1×109CFU/mL的擬態弧菌菌株04-14菌液和0.2 mL無菌生理鹽水。分別于注射后24、48和72 h從各組采集3尾實驗魚的免疫相關組織(脾臟、頭腎、肝臟、鰓和腸)。用TRIzol試劑提取組織總RNA，按照FastKing RT Kit (With gDNase)反轉錄試劑盒說明書合成cDNA作為實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測用模板。

根據Citab2與Citak1序列設計特異性引物，選擇β-actin作為參考基因 (表1)，qPCR檢測擬態弧菌感染后上述靶基因在免疫相關組織中的相對表達量。qPCR反應體系∶2×SGExceel UltralSYBR Mixture 10 μL，cDNA模板100 ng，上下游引物各0.5 μL，RNase free ddH2O補足至20 μL。反應條件∶95 °C 預變性3 min、95 °C 20 s，58 °C 20 s，72 °C 25 s，共計40個循環。每個樣品3個技術重復，使用2?△△CT法[16]計算目的基因mRNA相對表達水平，分析感染后其表達模式。

表1 本研究所用引物的序列信息Tab. 1 Primers and their sequences used in this study

1.3 重組真核表達質粒的構建

為了在細胞水平探究CiTAB2與CiTAK1的共定位、互作及其對抗菌肽基因表達的影響，需首先構建4種重組真核表達質粒(pmCherry-N1-Citab2、pCMV-Myc-Citab2、pEGFP-N1-Citab2和pEGFP-N1-Citak1)。構建步驟∶根據真核表達載體、Citab2和Citak1的序列特征設計3對含有酶切位點的特異性引物(表1)，以草魚頭腎組織cDNA為模板，PCR擴增Citab2和Citak1。將回收純化的PCR產物與空載體依次進行雙酶切、酶連及轉化DH5α感受態細胞。取轉化后的感受態細胞涂布于含100 μg/mL 氨芐西林(Amp)的LB培養基，37 °C培養至長出菌落，隨機挑取3個菌落進行擴大培養后，抽提質粒進行PCR和雙酶切鑒定，以鑒定重組真核表達質粒是否構建成功。

1.4 CiTAB2與CiTAK1的細胞共定位分析

將生長狀態良好且密度為2×105個/孔的HEK 293T和CIK細胞分別接種至24孔細胞培養板，用DMEM或MEM完全培養液于37 °C (HEK293T細胞)或28 °C(CIK細胞)、5% CO2條件下培養至50%匯合度后，棄去孔內培養液，更換為不含血清與雙抗的細胞培養液，使用Lipofectamine 3000脂質體轉染試劑將重組真核表達質粒pEGFP-N1-Citak1與pmCherry-N1-Citab2共同轉染至HEK293T和CIK細胞中。轉染體系∶1 μg質粒(1∶1，質量比)、1.5 μL轉染試劑和50 μL不含血清與雙抗的細胞培養液。轉染后48 h，棄去細胞孔內培養液，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌3次，用4% 多聚甲醛室溫固定細胞15 min，PBS洗滌3次，再用DAPI染核12 min，PBS洗滌3次，熒光倒置顯微鏡下觀察CiTAB2與CiTAK1在細胞中共定位情況。

1.5 蛋白質免疫共沉淀實驗

利用免疫共沉淀實驗(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)與Western blot (WB)鑒定CiTAB2與CiTAK1在HEK293T細胞中是否存在互作。將HEK293T細胞接種6孔細胞培養板，2×106個/孔，用DMEM完全培養液于37 °C、5 % CO2條件下培養12 h。待細胞匯合度達到85%時，用Lipofectamine 3000將重組真核表達質粒pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-N1-Citak1共同轉染HEK293T細胞中，同時設置pCMV-Myc-Citab2與pEGFPN1以及pEGFP-N1-Citak1與pCMV-Myc共轉染對照組。轉染體系∶2 μg質粒、5 μL轉染試劑和250 μL不含血清與雙抗的MEM培養液。轉染后48 h，棄去孔內培養液，用預冷的PBS洗滌3次，再加入500 μL含有1‰苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，于冰上裂解細胞10 min， 4 °C，10000 r/min離心5 min，收集上清液。其中一部分細胞裂解上清液保存至?80 °C用作陽性對照(Input組)，另一部分用于下一步Co-IP。

吸取20 μL Anti-Myc免疫磁珠至EP管，用預冷的TBST在磁力架上洗滌3次。將200 μL各共轉組細胞裂解上清液加入洗滌后的免疫磁珠中，置于翻轉混合儀上，4 °C條件下混合12 h，再用TBST洗滌3次，收集Co-IP后的蛋白復合物樣品(IP組)。Input組和IP組蛋白樣品經12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉移至PVDF膜，分別以1∶1000稀釋的Myc-Tag和GFP-Tag鼠源單克隆抗體為一抗，1∶10000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG為二抗進行WB檢測，特超敏ECL試劑盒顯影。

1.6 CiTAB2-CiTAK1互作對抗菌肽Cihepcidin和Ciβ-defensin1mRNA表達的影響

CIK細胞培養與轉染體系同“CiTAB2與CiTAK1蛋白的細胞共定位分析”。將pEGFP-N1-Citak1與pEGFP-N1-Citab2分別單轉和共轉CIK細胞，同時做轉染空載體pEGFP-N1對照。分別于轉染后24、36和48 h收集細胞樣品，TRIzol法提取細胞總RNA，并反轉錄為成cDNA，使用Cihepcidin和Ciβ-defensin1特異性引物(表1)，qPCR檢測2種抗菌肽基因在CIK細胞中的mRNA表達水平，qPCR反應體系與條件同“擬態弧菌感染后組織中Citab2與Citak1的表達模式分析”。

1.7 數據分析

使用SPSS 18.0軟件和2?△△CT方法計算擬態弧菌感染后草魚免疫相關組織中Citab2與Citak1，以及共同轉染Citab2與Citak1后CIK細胞中Cihepcidin和Ciβ-defensin1的mRNA相對表達量，并進單因素方差分析及多重比較，0.01 ＜P＜ 0.05表示差異顯著，P＜ 0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 擬態弧菌感染后組織中Citab2與Citak1的表達模式

擬態弧菌感染后草魚免疫相關組織中的Citab2與Citak1時空表達模式結果顯示，感染后24 h脾臟與頭腎中Citab2mRNA表達水平即達到峰值，分別為對照組的2.816倍和15.4倍(P＜0.01)，隨后2個檢測時間點略有下降，但仍顯著高于未感染對照組(P＜ 0.05)。與未感染對照組相比，肝臟組織中Citab2 mRNA表達水平在感染后24 h無顯著變化(P＞ 0.05)，隨后2個檢測時間點則顯著上調(P＜ 0.01)；腸和鰓組織中Citab2 mRNA表達水平分別在感染后24和48 h顯著上調(P＜0.01)，而在其余檢測時間點無顯著變化(P＞ 0.05)。各免疫相關組織中Citak1mRNA表達模式是一致的，均表現為在感染后24 h顯著上調(P＜ 0.01)，隨后兩個檢測時間點則顯著下調(P＜ 0.01)(圖1)。實驗表明CiTAB2和CiTAK1具有響應擬態弧菌感染并誘導機體免疫應答的潛能。

圖1 擬態弧菌感染后不同時間Citab2 (a)和Citak1(b)在草魚免疫相關組織中的相對表達水平變化1. 肝臟，2. 脾臟，3. 頭腎，4. 腸，5. 鰓；*表示差異顯著(P＜0.05)，**表示差異極顯著 (P＜0.01)；誤差線表示標準誤差 (n=3)。Fig. 1 The fold changes of Citab2 (a) and Citak1 (b) in immune-related tissues of C. idella at different time after V. mimicus infection1. liver, 2. spleen, 3. head kidney, 4. intestine, 5. gill; single asterisks and double asterisks denote significant differences (P＜0.05) and extremely significant differences (P＜0.01); respectively, error bar is shown as the standard error (n=3).

2.2 4種重組真核表達質粒的PCR與雙酶切驗證結果

采用酶切酶連方法構建4種重組真核表達質粒pEGFP-N1-Citab2、pEGFP-N1-Citak1、pmCherry-N1-Citab2和pCMV-Myc-Citab2，并進行質粒PCR和雙酶切驗證。結果顯示，以質粒DNA為模板擴增到目的基因Citab2(圖2，泳道2、6和10，2178 bp)或Citak1(圖2泳道14，1626 bp)；雙酶切反應后均獲得2條DNA條帶，大小分別與空載體(pEGFP-N1/4715 bp、pCMV-Myc/3770 bp及pmCherry-N1/4707 bp)和目的基因(Citab2/2178 bp 或Citak1/1626 bp)大小一致(圖2泳道4、8、13和16)，說明上述4種重組真核表達質粒構建成功。

圖2 重組質粒pEGFP-N1-Citab2(a), pCMV-Myc-Citab2(b), pmCherry-N1-Citab2(c)和pEGFP-N1-Citak1(d)的PCR與雙酶切驗證M. 標準物質10000； 1、5和9. ddH2O陰性對照；2. pEGFP-N1-Citab2的PCR產物；3. pEGFP-N1-Citab2；4. pEGFP-N1-Citab2的雙酶切產物；6. pCMV-Myc-Citab2的PCR產物；7. pCMV-Myc-Citab2；8. pCMV-Myc-Citab2的雙酶切產物; 10. pmCherry-N1-Citab2的PCR產物；11. pmCherry-N1的雙酶切；12. pmCherry-N1-Citab2；13. pm-Cherry-N1-Citab2的雙酶切； 14. pEGFP-N1-Citak1的PCR產物；15. pEGFP-N1-Citak1；16. pEGFP-N1-Citak1的雙酶切。Fig. 2 PCR and double enzyme digestion verification of recombinant plasmid pEGFP-N1-Citab2 (a), pCMV-Myc-Citab2 (b), pmCherry-N1-Citab2 (c) and pEGFP-C1-Citak1 (d)M. DL 10000; 1, 5and 9. ddH2O negative control; 2. PCR product of pEGFP-N1-Citab2; 3. pEGFP-N1-Citab2; 4. double enzyme digestion of pEGFPN1-Citab2; 6. PCR product of pCMV-Myc-Citab2; 7. pCMV-Myc-Citab2; 8. double enzyme digestion of pCMV-Myc-Citab; 10. PCR product of pmCherry-N1-Citab2; 11. double enzyme digestion of pmCherry-N1; 12. pmCherry-N1-Citab2; 13. double enzyme digestion of pm-Cherry-N1-Citab2; 14.PCR product of pEGFP-N1-Citak1; 15. pEGFP-N1-Citak1; 16. double enzyme digestion of pEGFP-N1-Citak1.

2.3 CiTAB2與CiTAK1在細胞中的共定位

將重組真核表達質粒pmCherry-N1-Citab2和pEGEP-N1-Citak1分別共同轉染HEK293T和CIK細胞。共轉48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察到DAPI染色后的細胞核呈藍色，融合蛋白EGFPN1-Citak1和mCherry-N1-Citab2在2種細胞的胞質中均有表達，分別發出綠色和紅色熒光，使得融合圖中陽性細胞胞質中發出黃色熒光，(圖版)。結果顯示，CiTAB2與CiTAK1在HEK293T和CIK細胞的胞質中存在共定位，同時推測二者在細胞內可能有相互作用。

圖版 CiTAK1與CiTAB2在HEK293T和CIK細胞中的共定位1～3. HEK293T細胞，4～6. CIK細胞；3和6. 分別為1和2及4和5的合并圖，箭頭指示CiTAB2與CiTAK1共定位在胞質中(黃色)。Plate Co-localization of CiTAK1 and CiTAB2 in HEK293T and CIK cells1-3. HEK293T cells, 4-6 CIK cells; 3,6. merged image of 1 and 2, as well as 4 and 5, arrows indicate the co-localization of CiTAK1 and CiTAB2 in the cytoplasm (yellow).

2.4 CiTAB2與CiTAK1互作的鑒定結果

將真核表達質粒pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-N1-Citak1、pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-N1以及pEGFP-N1-Citak1與pCMV-Myc分別共轉染293T細胞。轉染后48 h，以帶有Anti-Myc抗體的免疫磁珠與各共轉組細胞裂解液樣品進行Co-IP，再分別用抗Myc和EGFP標簽抗體對蛋白復合物進行WB檢測。結果顯示，用Myc抗體進行的WB檢測結果中，在Input組共轉pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-N1-Citak1以及pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-N1的細胞裂解液樣品中均檢測到Myc-CiTAB2蛋白條帶(85.6 ku)，說明共轉后pCMV-Myc-Citab2在細胞中得到表達；在IP組共轉pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-C1-Citak1以及pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-N1的蛋白復合物中也均檢測到Myc-Citab2蛋白條帶，表明帶Myc標簽的CiTAB2蛋白被成功捕獲。由于Myc標簽蛋白本身很小(約3.0 ku)，共轉pCMV-Myc與pEGFP-C1-Citak1的蛋白復合物中未檢測到該標簽蛋白條帶 (圖3)。

圖3 CiTAB2 與CiTAK1在HEK293T細胞內的相互作用Fig. 3 Protein interaction between CiTAB2 and CiTAK1 in HEK293T cells

用EGFP抗體進行的WB檢測結果中，在Input組共轉pEGFP-N1-Citak1與pCMV-Myc-Citab2以及pEGFP-N1-Citak1與pCMV-Myc的細胞裂解液樣品中均檢測到EGFP-N1-Citak1蛋白條帶(89.5 ku)，共轉pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-N1的細胞裂解液中檢測到大小約為26.9 ku的EGFP標簽蛋白條帶，說明帶有EGFP標簽的CiTAK1表達載體表達正常。在IP組，僅從共轉pEGFPN1-Citak1與pCMV-Myc-Citab2的IP產物中檢測到CiTAK1融合蛋白條帶(89.5 ku)，從而證明在細胞內CiTAB2與CiTAK1能夠相互作用 (圖3)。

2.5 CiTAB2-CiTAK1互作對Cihepcidin與Ciβ-defensin1 mRNA表達的影響

采用qPCR方法檢測共同過表達CiTAB2與CiTAK1對Cihepcidin與Ciβ-defensin1 mRNA表達水平的影響。結果顯示，相對于空載體轉染組，共轉組中2種抗菌肽基因mRNA水平在各檢測時間點均顯著上調(P＜ 0.01)(圖4)；2個單轉組中CihepcidinmRNA水平在轉染后24 h均無顯著變化(P＞ 0.05)，36 h均顯著上調(P＜ 0.01)，48 h仍顯著上調(單轉CiTAK1，P＜ 0.01)或回降到對照水平(單轉CiTAB2，P＞ 0.05) (圖4-a)；2個單轉組中Ciβ-defensin1 mRNA水平在轉染后24 h顯著下調(單轉CiTAK1，P＜ 0.01)或無顯著變化(單轉CiTAB2，P＞ 0.05)，隨后均顯著上調(P＜ 0.01)(圖4-b)。進一步分析發現，共轉組中2種抗菌肽基因mRNA表達水平在各檢測時間點均顯著高于2個單轉組(P＜ 0.05或0.01)。結果表明，CiTAB2-CiTAK1互作能促進這2種抗菌肽基因的表達。

圖4 CiTAB2-CiTAK1互作對兩種抗菌肽基因mRNA表達的影響(a) pEGFP-C1-Ciatk1或/與pEGFP-C1-Citab2單轉或共轉后不同時間點CIK細胞中Cihepcidin mRNA的相對表達量；(b) pEGFP-C1-Citak1或/與pEGFP-C1-Citab2單轉或共轉CIK細胞后不同時間點Ciβ-defensin1 mRNA的相對表達量； 不同小寫字母表示同一時間點下重組質粒轉染組與空質粒轉染組間的顯著差異(P＜0.05或0.01)，星號表示同一時間點下共轉組與單轉組間的顯著(*P＜0.05)或極顯著差異 (**P＜0.01),誤差線表示標準誤差 (n=3)。Fig. 4 Effects of CiTAB2-CiTAK1 interaction on the mRNA expression of two antimicrobial peptides genes(a) relative mRNA expression of Cihepcidin at different time points in the CIK cells single-transfected or co-transfected with plasmids pEGFP-C1-Citak1or/and pEGFP-C1-Citab2; (b) relative mRNA expression of Ciβ-defensin1 at different time points in the CIK cells single-transfected or co-transfected with plasmids pEGFP-C1-Citak1or/and pEGFP-C1-Citab2. Different lowercase letters indicate significant differences between recombinant plasmid-transfected and empty plasmid-transfected groups at the same test time point (P ＜ 0.05 or 0.01). Single asterisks and double asterisks denote significant differences (P＜0.05) and extremely significant differences (P＜0.01) between single-transfected and co-transfected groups at the same test time point,respectively. Error bar is shown as the standard error (n=3).

3 討論

信使RNA(mRNA)是聯系DNA與蛋白質之間的橋梁，特定基因的mRNA表達量能夠反映該基因的表達豐度。因此，檢測病原微生物感染后體內某種基因的mRNA水平變化，可作為判斷該基因是否參與感染或抗感染過程的重要指標。Zhao等[4-5]用多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)人工感染草魚，qPCR檢測并發現腮、脾臟、頭腎和皮膚中CiTAB2與CiTAK1基因均上調，但其時空表達模式并不完全一致。本研究也得到類似結果，擬態弧菌感染能顯著提高Citab2與Citak1在草魚免疫相關組織中的mRNA表達水平，其中Citab2在各檢測組織中的時空表達模式不同，Citak1在各檢測組織中均呈現為感染后24 h顯著上調，隨后顯著下調。此外， 擬態弧菌感染后抗菌肽hepcidin和β-defensin1的mRNA表達水平在肝臟、頭腎和鰓等組織中也顯著上調。上述結果表明，CiTAB2和CiTAK1具有響應擬態弧菌感染并誘導機體免疫應答的潛能，同時也啟發我們進一步探究CiTAB2與CiTAK1是否有相互作用及其互作對抗菌肽表達的影響。

蛋白質之間的相互作用(簡稱蛋白互作)是指2種或2種以上的蛋白質分子通過非共價鍵形成蛋白質復合體的過程[19]。研究蛋白互作的技術或方法較多，其中免疫共沉淀(Co-IP)是利用抗原與抗體特異性結合原理鑒定活細胞內蛋白互作的理想方法[20]。Wang 等[8]使用protein A/G磁珠通過免疫共沉淀方法證實大黃魚(Larimichthys crocea) TAK1與TAB2可以相互作用，并上調NF-κB表達。本實驗以帶有Anti-Myc抗體的免疫磁珠和3組共轉染樣品(pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-N1-Citak1、pCMV-Myc-Citab2與pEGFP-N1、pEGFP-N1-Citak1與pCMV-Myc)的細胞裂解液孵育后分別進行Co-IP，所得的蛋白質復合物再用抗Myc和EGFP標簽抗體進行WB鑒定，結果表明CiTAB2與CiTAK1在HEK293T細胞內存在互作。同時，CiTAB2與CiTAK1在HEK293T與CIK細胞中均共定位在胞質部位，進一步佐證了Co-IP的實驗結果。人胚腎上皮細胞系HEK293T具有生長繁殖速度快、外源基因轉染效率高及蛋白表達水平高等優勢[21]，而外源基因在魚類細胞系CIK、EPC和FHM中的轉染效率均很低、目的蛋白表達量少，導致免疫共沉淀下來的互作蛋白很少，難以檢測出來。因此，本研究中選擇HEK293T作為細胞模型在細胞水平鑒定草魚TAB2與TAK1的互作關系。

蛋白互作參與細胞內大部分生化反應進程，在細胞信號轉導、基因表達調控及細胞遷移等方面發揮著重要作用[22]。為了探討CiTAB2-CiTAK1互作對2種抗菌肽基因Cihepcidin與Ciβ-defensin1表達的影響，研究中將過表達質粒pEGFP-N1-Citak1與pEGFP-N1-Citab2單轉或共轉CIK細胞，檢測轉染后不同時間內源性Cihepcidin與Ciβdefensin1 mRNA表達情況。結果顯示，相對于空載體轉染組與單轉組，共轉組中2種抗菌肽基因mRNA表達水平在各檢測時間點均顯著上調，表明CiTAB2-CiTAK1互作能夠促進抗菌肽Cihepcidin和Ciβ-defensin1的轉錄表達。研究中同時發現單轉pEGFP-N1-Citak1或pEGFP-N1-Citab2后36 h也能顯著上調上述2種抗菌肽基因的mRNA表達水平，其原因可能是過表達的CiTAK1或CiTAB2與內源性CiTAB2或CiTAK1發生了相互作用，進而調控抗菌肽表達。然而CiTAB2-CiTAK1互作調控抗菌肽表達的細胞信號通路機制仍需深入研究。

綜上所述，本研究證實草魚TAB2與TAK1存在細胞內共定位與相互作用關系，且兩者互作能夠促進抗擬態弧菌抗菌肽Cihepcidin和Ciβdefensin1的轉錄表達。研究結果從蛋白互作調控抗菌肽表達的角度為防治魚類弧菌病提供新策略。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）