草魚腸系膜脂肪沉積量的測定與分析

姜 鵬， 樊佳佳， 李勝杰， 杜金星， 雷彩霞

(中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣東 廣州 510380)

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國重要的大宗淡水養殖品種，年供應量超過550萬t[1]，為滿足廣大民眾對優質動物蛋白的營養需求發揮著不可替代的作用。近年來，隨著高產高效集約化養殖模式的推廣，養殖草魚長速加快，上市周期縮短，但也常出現體脂過度沉積現象[2]，導致魚體自身健康狀況及食用品質下降等問題[3-5]。尤其腹腔內的腸系膜脂肪組織，作為草魚貯存能量，蓄積脂肪的主要功能部位[6]，過度沉積不僅造成飼料資源的浪費，也直接加劇肥胖體型，影響鮮活產品的銷售[7-8]。

針對上述產業問題，科研人員嘗試從營養與飼料、遺傳育種等多方面開展調控機理與應用技術研究[2,9-11]。在研發過程中，通常涉及魚體腸系膜脂肪沉積量的測定與比較，用于量化評價調控方案實施效果及優化技術參數。然而，草魚腹腔內脂肪組織緊隨腸管附著延伸，而草食性魚類腸道細長，盤旋回折多，導致該性狀難以直接計量。傳統方法是利用解剖刀等工具將黏連在腸壁周圍的脂肪組織進行人工刮取剖離，再集中稱量分析。該方法雖然簡單直接，但在實際操作時，易發生腸管破裂，使得腸道內容物混雜其中而導致數據出現較大誤差。尤其當處理樣品數量較多或實驗魚規格較小時，該方法存在耗時費力，操作失誤率高，量化數據粗糙等問題。

為此，本實驗擬利用脂溶性染料油紅O可特異性著色脂肪的特性[12]，探索開發一種精確、便捷定量草魚腸系膜脂肪組織含量的新方法，以滿足研究實踐需要；同時對測定數據進行統計分析，以評估度量性狀的基本特征。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

實驗所用草魚取自中國水產科學研究院珠江水產研究所水產生物技術養殖基地。從正常飼養的養殖群體中隨機挑選健康個體，體重范圍約為75.0 ～ 95.0 g，數量200尾。所有實驗魚均出自同一批水花苗種，并在同一個池塘進行培育，以保證飼養環境條件的一致性。本研究獲得了中國水產科學研究院珠江水產研究所實驗動物管理和使用倫理委員會批準，實驗過程中操作人員嚴格遵守倫理規范，并按照中國水產科學研究院珠江水產研究所倫理委員會制定的規章制度執行。

1.2 主要試劑與儀器

油紅O干粉購自Sigma-Aldrich公司；無水乙醇(分析純)購自天津市百世化工有限公司；多聚甲醛固定液(中性)購自武漢塞維爾生物科技有限公司；多功能酶標儀(型號Cytation-5)購自美國伯騰儀器有限公司；電子天平采用梅特勒托利多科技(中國)有限公司產品(精度∶1 mg；0.1 mg)。PIT電子芯片標記購自安徽瑞佰創物聯科技有限公司。油紅O染液的配置是按比例將1.0 g油紅O干粉充分溶解于5.0 kg無水乙醇溶劑中，經300目濾網過濾后，密封備用。

1.3 性狀測量與樣品處理

麻醉后稱量草魚體重(BW)，并利用游標卡尺測量實驗魚體長(BL)、軀干長(TRL)、體高(BH)、尾柄高(CPH)和體寬(BWD)等體尺性狀，然后解剖取出整個內臟團(不含魚鰾、性腺)稱取重量(VW)，摘除膽囊器官；將PIT 電子芯片塞入魚腸道內，記錄樣品編碼等信息，再把已標記的內臟團樣品放入多聚甲醛固定液進行集中保存。待全部樣品(內臟團)采集完畢，統一固定6 h；然后將固定樣取出集中，加入適量無水乙醇試劑進行快速脫水操作，試劑需浸沒全部樣品，時長15 min；倒掉脫水廢液，樣品瀝干2 min后，加入提前配置好的油紅O染液進行染色處理，染液需浸沒全部樣品，時長9 min；倒掉染色廢液，終止染色，樣品瀝干2 min后，加入適量無水乙醇進行快速漂洗，時長30 s；倒掉漂洗廢液，樣品瀝干5 min后，將染色樣品分別放入提前備好的加蓋密封萃取瓶(含80.0 g無水乙醇試劑，其質量計為we)，進行28 h靜置萃??；當萃取完畢，吸取1.6 ml萃取液至離心管，100000 r/min，離心1 min；再從中吸取200 μL上清液至酶標板，在波長510 nm處測定吸光度OD值，每個樣品檢測3次，取平均值。實驗遵守本實驗室的物倫理規范。

1.4 標準曲線的繪制

稱量25.0 mg (精確到0.1 mg，下同)油紅O固體粉末，充分溶解于約100.0 g的無水乙醇試劑中，配成油紅O質量分數為250 μg/g的標準母液。定量吸取標準母液稀釋于無水乙醇溶劑中，配成質量分數0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5 μg/g(以油紅O質量計)的工作液，此標準溶液相當于上述80.0 g萃取液中含有油紅O質量分別為0、40、80、120、160、200、240、280、320、360、400和440 μg。工作液梯度范圍需包含所要檢測樣品萃取液的濃度極值。取200 μL各梯度工作液置于酶標板，在波長510 nm處測定吸光度，以油紅O質量分數為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。重復3次。

1.5 統計分析

在本研究中，草魚個體腸系膜脂肪沉積量是以樣品吸附并萃取出的油紅O質量來表示，計算公式∶wo= ω ×we，式中，ω為利用標準曲線計算出的樣品萃取液油紅O質量分數(μg/g)；we為萃取所用無水乙醇的質量(g)，本研究所有樣品的萃取液用量統一設置為80.0 g；wo為樣品萃取出的油紅O質量(μg)。另外，為了進一步判斷萃取量化結果的可靠性，隨機取少量萃取后內臟團樣品，將尚存的腸系膜組織剝離稱重，檢驗其與傳統刮取法定量數據的關聯程度。

使用SPSS 19.0軟件對觀測數據進行描述性統計、Pearson相關分析、系統聚類以及多元逐步回歸分析。其中，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗判斷數據正態性。采用R型聚類對觀測變量進行分析，聚類方法選擇最遠鄰元素法結合Pearson相關性。多元回歸分析采用雙向逐步回歸方法，設定自變量引入或剔出方程的概率值分別為0.05和0.10。

2 結果

2.1 樣品的染色與萃取效果

草魚內臟團解剖、固定、脫水、染色等操作對腸系膜脂肪組織的結構完整性影響較小，脂肪細胞內脂質物質得到較好保留。如圖版-5所示，內臟團樣品經9 min定時浸染，油紅O染料可對草魚腸系膜脂肪組織特異性、均一化染色，染料滲透性強，勻染性好；脂肪組織得以充分著色，而腸道、肝胰臟等臟器組織則著色輕微。從圖版-6可見，染色樣品經無水乙醇萃取后，吸附在脂肪組織內的油紅O染料被完全抽提。以上實驗結果表明，利用油紅O脂溶性染料的固有特性，可實現草魚腸系膜脂肪組織的定向充分染色；良好的抽提效果則為后續精確定量提供了必要條件。

圖版 草魚腸系膜脂肪組織的油紅O染色與萃取效果1. 草魚解剖；2. 內臟團初始樣品；3. 樣品固定；4. 樣品脫水；5. 樣品油紅O染色；6. 萃取后樣品；a. 腸系膜脂肪組織；b. 腸；c. 肝胰臟。Plate Oil red O staining and extraction of mesenteric adipose tissue of C. idella1. dissected C. idella; 2. original visceral mass; 3. sample fixation; 4. sample dehydration; 5. oil red O staining; 6. Sample after extraction; a. Mesenteric adipose tissue. b. Intestine; c. Hepatopancreas.

2.2 標準曲線的繪制

通過酶標儀測定12個不同濃度油紅O標準液在510 nm波長下吸光度值，繪制標準曲線。結果如圖1所示，油紅O濃度(質量分數)與吸光度值之間呈現近乎直線的線性關系，求得擬合回歸方程∶y= 0.0276x+ 0.0403,R2= 0.9997。當油紅O質量分數在0 ～ 5.5 μg/g范圍內時，可以依據此方程進行樣品定量分析。

圖1 油紅O的標準曲線Fig. 1 Standard curve of oil red O

2.3 腸系膜脂肪沉積量的測定

依據建立的標準曲線方程，將萃取液吸光度值換算為油紅O質量分數(μg/g)；在已知萃取液質量(80.0 g)的前提下，通過簡單的乘法運算即可獲得溶液中油紅O的質量。由整個操作流程可知，萃取的油紅O源于樣品起始階段所吸附的油紅O，而吸附量與樣品腸脂組織總量密切相關，因此，腸系膜脂肪沉積量可由萃取出的油紅O質量來表示。

為了進一步檢驗油紅O萃取法，將20尾個體萃取后樣品的腸脂組織直接刮取稱量，與萃取量化結果進行對比。由圖2散點圖可知，傳統刮取稱重與萃取量化數據具有較高的相關性(r=0.80，P＜ 0.01)，這也一定程度表明本研究染色-萃取測定方法的可靠性。

2.4 度量性狀的描述性統計

對采集的200尾草魚性狀表型值進行描述性統計分析，結果見表1。在度量的8個數量性狀中，體重、內臟質量和腸系膜脂肪沉積量的變異系數(8.93% ～ 24.49%)整體要高于體長等體尺性狀(3.17% ～ 4.25%)。尤其是，在體重變異系數為8.93%的草魚群體中，腸系膜脂沉積量的變異系數達到24.49%，表明該性狀具有豐富變異特征及遺傳改良潛力。另外，所有性狀表型值經過K-S檢測，P值均大于0.05顯著性水平，表明符合正態分布。

表1 草魚8個數量性狀的描述性統計(n=200)Tab. 1 Descriptive statistics of eight quantitative traits in C. idella (n=200)

2.5 相關與聚類分析

Pearson相關分析結果顯示，體重與觀測的各體尺性狀間呈高度正相關(r= 0.73 ～ 0.92，P＜0.01)，其中與體長相關性最高；內臟質量與各體尺性狀呈中等正相關(r= 0.51 ～ 0.70，P＜ 0.01)，其中與體高相關性最高；腸系膜脂肪沉積量則與各體尺性狀呈低度正相關(r= 0.33 ～ 0.42，P＜0.01)(表2)。上述各性狀間的相關關系反映出草魚的形態學特征。此外，在腸系膜脂肪沉積量與其他各性狀間，腸系膜脂肪沉積量與內臟質量的相關系數最大(r= 0.60，P＜ 0.01)。

表2 草魚8個數量性狀的相關分析(n=200)Tab. 2 Correlation analysis of eight quantitative traits in C. idella (n=200)

R型變量聚類更為直觀的展現各觀測性狀間的關系結構 (圖3)。其中，腸系膜脂肪沉積量與內臟質量單獨聚為一支，反映了二者緊密聯系，說明采用新方法獲得的腸系膜脂肪量化數據屬于臟器關聯指標，同實際情況相符。

圖3 草魚8個數量性狀的R型聚類圖Fig. 3 Dendrogram of R-cluster analysis of 8 quantitative traits in C. idella

2.6 逐步回歸分析

以腸系膜脂肪沉積量為因變量，以體重、體長等6個形態指標為自變量，開展多元逐步回歸分析(表3)。結果顯示，只有體高、體寬2個顯著性自變量得以保留，剩余指標變量因無顯著性而被剔除，但建立的二元回歸方程決定系數R2僅有0.20，意味著簡單易測的形態指標只能解釋腸系膜脂肪沉積量變異的20%，表明基于形態指標的回歸模型預測腸系膜脂肪沉積量的效果不佳。

表3 草魚腸系膜脂肪沉積量與各形態指標的逐步回歸分析(n = 200)Tab. 3 Stepwise regression analysis between mesenteric fat weight and various morphological indexes in C. idella (n = 200)

3 討論

3.1 油紅O染料的特性與應用研究

油紅O是一種脂溶性偶氮染料，可高度溶解于脂類物質，并能夠使其特異性著色，因此常被用于細胞內脂滴的定位與指示變化，涉及冰凍組織切片[13]、細胞鑒定[14-15]、大體染色[16-17]等技術內容，用以揭示脂質代謝與機體生理、病理過程的聯系。本研究利用油紅O有色溶液可量化的另一特性[18]，基于朗伯-比爾定律，通過萃取液吸光度檢測，首次將其拓展應用于魚類腸系膜脂肪沉積量的定量分析。

3.2 染色-萃取定量方法的操作要點

與傳統刮取稱量方法相比，本研究開發的草魚腸系膜脂肪定量方法，具有取樣完整，操作便捷，量化精準的特點，尤其適用于批量、小規格實驗魚采樣需求。簡要操作流程∶魚體麻醉解剖、內臟團采集、個體標記、樣品固定、脫水、染色、漂洗、萃取和定量分析。具體實施步驟中，需要說明的∶(1)內臟團中膽囊的摘除，是防止有色膽汁可能對染色過程、萃取液吸光度檢測造成干擾。(2)實施芯片標記操作，不僅用于識別區分個體，也為后續共同染色提供必要條件，以達到樣品處理時間、處理環境的一致性。(3)實施組織固定操作，主要是防止取樣時間較長引發的組織自溶，避免細胞內脂質流失，為大批量采樣提供寬松的時間。(4)染色前實施脫水操作，是先期讓樣品快速大幅脫水，顯著緩解后續無水乙醇操作環境中樣品自行脫水可能引起的干擾。(5)選擇無水乙醇作為染色、萃取過程的溶劑，主要是乙醇與油紅O具有良好的相溶性，而且乙醇相比其他醇類易于獲得，價格低廉、低毒性、刺鼻氣味輕微。(6)實施漂洗步驟，是去除樣品表面殘留的工作液，防止殘液影響定量分析。(7)通過繪制的標準曲線，可將測定的萃取液吸光度值轉換為相應的油紅O濃度(質量分數)，而擬合的標準工作曲線決定系數R2達到0.9997，充分表明樣品檢測過程可靠，量化數據精準。(8)該定量方法可拓展應用于不同規格實驗草魚或其他魚類，而樣品染色時間、萃取乙醇用量等參數以及標準曲線的繪制也應根據實際情況作出相應調整。例如，樣品染色時間，既要保證魚體脂肪組織獲得充分染色，又要防止染色時間過長導致非脂肪組織被動著色問題；萃取乙醇用量則以能夠將染樣里的油紅O萃取完全為準。

在本研究中，草魚個體腸系膜脂肪沉積量是以樣品吸附并萃取出的油紅O質量來表示。由于所有草魚測試樣品是在同一環境條件下處理，染液濃度、染色時間等關鍵參數一致，所以測定結果能夠較為精準的展示出樣品間脂質沉積的差異程度。需要說明的是，雖然染色-萃取量化結果與傳統刮取稱重保持了較好的相關性，但新測定方法屬于相對定量范疇，所獲數據代表個體腸系膜脂肪沉積的相對含量，僅適用于同批次或相同處理條件下樣品的比較分析。

3.3 草魚腸系膜脂肪沉積量的特征

采集同一養殖環境的200尾草魚性狀表型值，統計分析發現，利用染色-萃取方法測量草魚腸系膜脂肪沉積量范圍為92.66 ～ 318.07 μg，變異系數達到24.49%，對比體重等其他表型性狀3.17% ～8.93%的變異系數，顯示出較為豐富的變異特征，為遺傳改良奠定了良好的物質基礎。實際上有文獻顯示，采用傳統刮取定量方法，在體重變異系數10.13%的商品規格草魚群體中，腸系膜脂肪性狀的變異系數也達到21.30%，同樣預示草魚體脂性狀具有較大選育潛力[2]。

進一步的相關與聚類分析表明，腸系膜脂肪沉積量與內臟質量相關性最高，并且聚為一類，符合預期的臟器關聯因子，但與各體尺性狀的相關性較低，而且多元線性回歸分析顯示，簡單易測的表型指標對腸系膜脂肪沉積量的變異解釋程度較低，說明通過間接預測途徑獲取性狀表型值的可信度不高，這也意味著該性狀的精確測量可能無法避免宰殺活體。另一方面，雖然有研究報道腹腔內脂肪組織可以實現無損定量檢測，如核磁共振成像技術對魚類脂肪組織的可視化研究[19]，但該技術依賴昂貴的大型儀器以及較復雜的軟件程序，限制了其應用范圍。

綜上所述，本研究利用脂溶性染料油紅O可特異性著色脂肪的特性，開發出一種精確、便捷定量草魚腸系膜脂肪組織含量的新方法?；诓僮鞑襟E論述及采樣數據分析，顯示出本定量方法的可靠性及適用范圍，也為草魚體脂性狀改良提供了技術參考。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）