普通小球藻對水體NH4+-N、NO2?-N去除效果及NO2?-N的同化途徑

沈 雷， 高建操， 聶志娟， 鄭兆偉， 胡佳雯，邵乃麟， 孫 毅， 徐鋼春,,*

(1. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇 無錫 214081；3. 南京農業大學無錫漁業學院，江蘇 無錫 214081)

氨氮(主要為非離子氨)、亞硝酸鹽氮是養殖水體中主要的毒害物質，對水產動物生存環境有至關重要的影響。水體中非離子氨與離子氨能夠相互轉化；水溫或pH越高，水中非離子氨的含量也越高。而水體中NH4+-N和NO2?-N濃度過高會造成養殖動物免疫力下降、發生病害甚至死亡[1-5]。因此，去除養殖水體中NH4+-N和NO2?-N對于保證養殖動物的健康意義重大[6-7]。

對于養殖水體NH4+-N和NO2?-N的升高，生產中常用化學氧化劑緩解?；瘜W方法雖在短期內具有較好的去除效果，但同時會影響水體微生物群落組成，擾亂池塘生態平衡[8-11]。隨著生態理念的推廣和綠色養殖技術的普及，越來越多的養殖戶選擇微生態制劑調控水質及改良底質；在循環水養殖系統(RAS)等工廠化養殖中尤為明顯[12-13]。除微生物外，藻類作為池塘中的初級生產者，對維護養殖池塘生態平衡同樣具有重要的作用。

普通小球藻(Chlorella vulgaris)作為單細胞浮游植物，以其繁殖迅速、生命力強被水產界廣泛使用[14-16]。目前，多項研究關注小球藻對NH4+-N和NO2?-N的去除效果，而忽略了二者之間的關聯[17-20]；而實際養殖水體中NH4+-N、NO2?-N同時存在，兩者之間存在協同和轉化。近年來，多數研究表明小球藻具有凈化養殖水體的功能，但不同種類的小球藻去除NH4+-N、NO2?-N效果不盡相同。劉祥等[21]研究發現普通小球藻在自養模式下無法去除NH4+-N。而許元釗等[22]發現索羅金小球藻(C. sorokiniana)能夠去除NH4+-N，但無法去除NO2?-N。我國常見的小球藻種類有普通小球藻、蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)和橢圓小球藻(C.ellipsoidea)等，其中普通小球藻是水產養殖中廣泛使用的一種。因此，揭示普通小球藻對NH4+-N、NO2?-N去除效果及相關影響因子對于水產健康養殖意義重大。

目前，小球藻對水體中NH4+-N去除途徑研究的比較透徹，主要為小球藻直接同化吸收以及水體中pH變化導致NH4+-N揮發[23-24]；而有關小球藻去除水體中NO2?-N的研究較少。這也導致了養殖池塘亞硝酸鹽濃度偏高時，養殖戶缺乏有效的生態應對措施。本研究以普通小球藻為研究對象，檢測了普通小球藻對水體中NH4+-N、NO2?-N的去除效果和規律，同時探究了普通小球藻同化水體中NO2?-N潛在途徑。本研究結果將有助于進一步加深對小球藻去除NO2?-N效果和途徑的認知，為小球藻在水產養殖中的科學使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

普通小球藻由實驗室制備，接種于新鮮無菌的BG-11培養基，于光照4500 lx、光暗比12 h/12 h、溫度26 ℃下恒溫培養，達到對數生長期的高密度藻液用于實驗。實驗水體由水產飼料在自來水中自然釋放氮營養鹽制得；實驗容器為3 L玻璃燒杯。

1.2 實驗方法

將藻母液置以3500 r/min離心10 min后，棄去上清液，用蒸餾水反復洗滌3次，去除藻液中營養鹽。飼料廢水置以5000 r/min離心5 min后，取上清液用于實驗。實驗溫度為28 ℃，曝氣量為2 L/min，連續曝氣與光照。

不同條件下小球藻對NH4+-N、NO2?-N的去除效果實驗取飼料廢水15 L，充分混勻后分成15份，實驗組添加普通小球藻至初始密度為2.5×105個/mL，光照強度為18000 lx。設置A組∶對照，B組∶普通小球藻，C組∶普通小球藻＋曝氣，D組∶普通小球藻＋光照，E組∶普通小球藻＋光照＋曝氣，每組3個平行，每隔12 h檢測各組水體中NH4+-N、NO2?-N質量濃度及小球藻細胞密度。

不同光照強度下普通小球藻對NH4+-N、NO2?-N的去除效果實驗取飼料廢水15 L，充分混勻后分成15份，添加普通小球藻至初始密度為2.5×105個/mL，設置不同光照強度組∶0 lx(A組)、3000 lx (B組)、6000 lx (C組)、9000 lx(D組)和18000 lx (E組)5個組，每組3個平行，給予曝氣條件，每隔12 h檢測水體中NH4+-N、NO2?-N質量濃度及藻細胞密度。

不同初始密度的普通小球藻對NH4+-N、NO2?-N的去除效果實驗取飼料廢水12 L，充分混勻后分成12份，設置初始藻密度分別為對照(0)、低密度(5.0×104個/mL)、中密度(2.5×105個/mL)、高密度(1.25×106個/mL) 4個組，每組3個平行，給予18000 lx光照與曝氣條件，每隔12 h檢測水體中NH4+-N、NO2?-N質量濃度及藻細胞密度。

曝氣對亞硝酸鈉溶液中NO2?-N濃度的影響實驗準確稱取0.4928 g亞硝酸鈉(分析純)，溶解于超純水，定容至1 L，制成NO2?-N質量濃度為0.100 mg/mL的標準液。分別取1、3 和5 mL標準液，用純水稀釋配置成質量濃度分別為0.1、0.3和0.5 mg/L的NO2?-N溶液，給予18000 lx光照與曝氣條件，每隔6 h檢測水體中NO2?-N含量。

普通小球藻處理下NH4+-N、NO2?-N、NO3?-N質量濃度的變化規律實驗取飼料廢水6 L，經高壓蒸汽滅菌后充分混勻分成6份，3份添加普通小球藻為實驗組，設置初始藻密度為5.0×105個/mL，對照組不添加普通小球藻。給予18000 lx光照與曝氣條件，每隔6 h檢測水體中NH4+-N、NO2?-N、NO3?-N質量濃度及藻細胞密度。并分別在6 h (NH4+-N吸附過程)和24 h(NO2?-N吸附過程)時檢測普通小球藻亞硝酸鹽還原酶(NiR，江蘇酶免實業有限公司)活性。

1.3 水質測定

NH4+-N測定采用納氏試劑分光光度法，NO2?-N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，NO3?-N采用紫外分光光度法[25]，溶解氧(DO)和pH采用水質分析儀測定(Thremo Orion Star A329; Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, 美國)。普通小球藻采用血球計數板計數。去除率r計算公式∶

式中，C0和C1分別為某時刻對照組與處理組濃度(mg/L)。

1.4 數據分析

結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 18.0軟件進行方差分析與回歸分析，其中P＜0.05和＊表示差異顯著，P＜0.01和＊＊表示差異極顯著。采用Microsoft Excel 2019軟件繪圖，其中組內時間上差異顯著性用大寫字母標注，組間差異用小寫字母標注。

2 結果

2.1 不同條件下普通小球藻對NH4+-N、NO2?-N去除效果及藻密度變化

無光照組間NH4+-N含量無顯著差異(P＞0.05)，而有光照組從第12小時開始 NH4+-N含量顯著低于無光照組(P＜0.05)；在第24和48小時，E組NH4+-N去除率顯著高于D組(P＜0.05；表1)；表明光照是普通小球藻去除NH4+-N的必要條件，而曝氣對NH4+-N的去除有一定的促進作用。

表1 不同條件下小球藻去除NH4+-N、NO2?-N效果及藻密度變化Tab. 1 Removal effects of NH4+-N and NO2?-N by C. vulgaris under different conditions and the changes of algal density

無光照組NO2?-N含量有隨時間逐步上升的趨勢，而D、E組NO2?-N含量分別在第36和24小時顯著低于無光照組(P＜0.05；表1)；與D組相比，E組在24～72 h具有更高的NO2?-N去除率。綜上表明，普通小球藻對NO2?-N去除明顯滯后于NH4+-N的去除；合適的光照條件下，普通小球藻能有效去除NO2?-N，同時曝氣可以顯著提高普通小球藻對NO2?-N的去除速率與去除率(P＜0.05)；在缺乏光照的條件下，曝氣會誘導NO2?-N產生。

光照組普通小球藻數目迅速增加且顯著高于無光照組(P＜0.05；表1)；E組藻密度略高于D組；說明光照充足時，普通小球藻能快速利用水體營養物質進行增殖，曝氣對普通小球藻生物量的增加有一定的促進作用。

2.2 不同光照強度下普通小球藻對NH4+-N、NO2?-N去除效果及藻密度變化

自實驗開始，各處理組NH4+-N含量均顯著低于A組(P＜0.05)，B、C、D三組在0～24 h隨光照強度增加，NH4+-N去除速率顯著加快(P＜0.05)，D組與E組無顯著差異(P＞0.05)；36 h后各處理組NH4+-N去除率無顯著差異(P＞0.05；表2)；表明光照強度增加有利于提高NH4+-N去除速率，光照強度為9000 lx時即有較好的NH4+-N去除效果。在第48小時時，E組具有最高的NH4+-N去除率，為96.23%(表2)；經回歸分析，NH4+-N去除率(Y)與時間(X1)、光照(X2)關系∶YNH4＋-N=1.189X1+5.79×10?4X2+24.158，R2=0.664。

表2 不同光照強度下小球藻去除NH4+-N、NO2?-N效果及藻密度變化Tab. 2 Removal effects of NH4+-N and NO2?-N by C. vulgaris under different light intensities and the changes of algal density

B、C、D、E組NO2?-N含量分別從第60、36、24和24小時顯著低于A組(P＜0.05)，且E組NO2?-N去除率在第36小時顯著高于D組(P＜0.05)；表明NO2?-N去除速率隨光照強度增加而加快。在第60小時時，D組具有最高的NO2?-N去除率，為99.19%(表2)；經回歸分析，NO2?-N去除率(Y)與時間(X1)、光照(X2)關系∶YNO2?-N=1.562X1+1.909×10?3X2?26.078，R2=0.762。

A組藻密度未顯著升高，而B、C、D、E組藻密度自實驗開始即快速上升，分別在第60、60、36和24小時達到平臺期(表2)。表明在充足的營養條件下，隨著光照強度增加，微藻繁殖速率加快。

2.3 不同普通小球藻密度去除NH4+-N、NO2?-N效果及藻密度變化

對照組NH4+-N含量逐步下降，低、中、高密度組NH4+-N含量分別在第24、12和12小時顯著低于對照組(P＜0.05)，且高密度組NH4+-N去除率顯著高于中密度組(P＜0.05)；表明NH4+-N去除速率隨藻密度增加而加快。在第24小時中密度組具有最高的NH4+-N去除率，為94.92%(表3)；經回歸分析，NH4+-N去除率(Y)與時間(X1)、藻密度(X3)關系為YNH4＋-N=0.888X1+1.02×10?5X3+32.555，R2=0.408。

表3 不同普通小球藻密度去除NH4+-N、NO2?-N效果及藻密度變化Tab. 3 Removal effects of NH4+-N and NO2?-N by C. vulgaris at different densities and the changes of algal density

低、中、高密度組NO2?-N含量分別在第48、24和24小時顯著低于對照組，中、高密度組之間無顯著差異(P＜0.05)；表明藻密度為2.5×105個/mL即有較好的NO2?-N去除效果。在第60小時，中密度組具有最高的NO2?-N去除率，為99.05%(表3)；經回歸分析，NO2?-N去除率(Y)與時間(X1)、藻密度(X3)關系為YNO2?-N=1.746X1+1.64×10?5X3?17.250，R2=0.613。

三個處理組藻密度均逐漸上升(表3)，低密度與中密度組在第48小時達到平臺期；高密度組在第24小時達到平臺期，36 h后開始下降；中密度組藻密度在第48～72小時顯著高于其他2組(P＜0.05)，其他2組之間無顯著差異(P＞0.05)。綜上，在充足的營養條件下，微藻繁殖速度隨藻密度增加而加快，而營養缺乏時，微藻生物量會迅速下降。

2.4 曝氣對NO2?-N的去除效果及水體溶解氧(DO)變化

圖1-a為曝氣對NO2?-N的去除效果，3種濃度NO2?-N均未呈現出下降趨勢。而12 h后溶解氧含量達到9 mg/L以上(圖1-b)，說明短時曝氣無法去除NO2?-N，即空氣中的氧氣無法直接氧化NO2?-N。3組DO變化趨勢一致，先快速上升，隨后在平臺期上下波動(圖1-b)。

圖1 曝氣對不同初始濃度NO2?-N含量、溶解氧的影響不同大寫字母表示組內不同時間點指標差異顯著(P＜0.05)，下同。Fig. 1 Effects of aeration on NO2?-N content and dissolved oxygen at different initial concentrationsDifferent uppercase letters indicated temporal differences in a given group(P＜0.05), the same below.

2.5 普通小球藻對NH4+-N、NO2?-N、NO3?-N的去除效果及其變化規律

藻組NH4+-N、NO3?-N、NO2?-N含量分別從0、12和18 h后開始下降(圖2-a～c)；最高去除率分別為94.73%、92.24%和98.99%(表4)。表明普通小球藻能有效去除氮無機鹽，去除順序為NH4+-N＞NO3?-N＞NO2?-N。結合0～12 h藻組溶解氧含量迅速升高(圖2-d)，而此時間段NO3?-N、NO2?-N濃度均未發生顯著變化，表明普通小球藻光合作用產生的氧氣無法將NO2?-N氧化成NO3?-N。

圖2 普通小球藻對NH4+-N、NO2?-N與NO3?-N去除效果及水體中DO、pH、藻密度變化“*”表示同一時間點各處理組間差異顯著(P＜0.05)，“**”表示同一時間點各處理組間差異極顯著(P＜0.01)，下同。Fig. 2 Removal effects of C. vulgaris on NH4+-N, NO2?-N and NO3?-N and the changes of DO, pH and algae density in water"*" means significant difference between treatment groups at the same time point (P＜0.05), "**" means extremely significant difference between treatment groups at the same time point (P＜0.01), the same below.

表4 普通小球藻對NH4+-N、NO2?-N與NO3?-N的去除率變化Tab. 4 Removal rates of NH4+-N、NO2?-N與NO3?-N by C. vulgaris %

實驗期間，普通小球藻數目逐步上升(圖2-f)，藻組與對照組DO、pH均顯著上升(P＜0.05)，但藻組上升幅度大于對照組，其中藻組DO含量在12～30 h均顯著高于對照組(P＜0.05；圖2-d)，藻組pH在6～30 h均顯著大于對照組(P＜0.05；圖2-e)。綜上，普通小球藻利用氮鹽繁殖時有利于提高水體DO與pH。

2.6 NH4+-N、NO2?-N下降過程中普通小球藻亞硝酸鹽還原酶活性變化

第6和24小時分別為NH4+-N與NO2?-N下降過程，小球藻細胞內亞硝酸鹽還原酶活性分別為(56.59±3.56) ng/L和(130.62±7.41) ng/L，二者差異顯著(P＜0.05；圖3)。實驗結果表明，普通小球藻細胞內存在亞硝酸鹽還原酶，NO2?-N可能在該酶的作用下被還原成氨氮，由此造成24～30 h氨氮去除率輕微下降(表4)。

圖3 NH4+-N、NO2?-N下降過程中普通小球藻亞硝酸鹽還原酶活性變化Fig. 3 Changes of nitrite reductase activity during NH4+-N and NO2?-N descending process

3 討論

3.1 普通小球藻對水體中無機氮的去除

本研究發現在適宜的光照條件下，普通小球藻能有效去除氮營養鹽，充足的碳源可能是必要保障。光照條件下，曝氣能夠提高藻對NO2?-N的去除速率，可能是CO2作為額外碳源增加了水體碳氮比，削弱了普通小球藻繁殖的碳限制[26-27]。類似地，王瑋蔚等[28]發現，隨著HCO3?濃度的增加，普通小球藻生長逐漸加快。研究表明，普通小球藻在光照下能利用無機碳源進行自養繁殖，同時普通小球藻還能夠直接利用葡萄糖、D-果糖等有機碳源進行異養繁殖[29-30]。Babaei等[31]以葡萄糖為碳源，在黑暗環境中異養培養普通小球藻能有效去除NH4+-N。綜上，在生產上同時提供無機和有機碳源可能加速小球藻去除無機氮的效果，但具體效果還需要進一步的研究。

與Syrett[32]研究結果一致，本研究發現普通小球藻對NH4+-N、NO2?-N、NO3?-N均具有較強的去除能力，且普通小球藻利用氮營養鹽順序為NH4+-N＞NO3?-N＞NO2?-N。在前人的研究中也有不同的報道，楊坤等[33]研究小球藻凈化養殖水體水質時，發現NO3?-N無法去除。劉娥等[34]利用菌藻系統處理水產養殖尾水時，發現單藻條件下無法去除NO2?-N。秦璐等[35]研究小球藻對羅非魚養殖水體水質的影響，結果表明小球藻對NO2?-N與NO3?-N均無顯著去除效果。上述研究與本研究結果不符的原因在于普通小球藻利用氮鹽具有選擇性，當水體中NH4+-N持續存在時，普通小球藻僅優先利用NH4+-N，導致NO2?-N、NO3?-N去除效果不顯著。然而，劉梅等[36]利用蛋白核小球藻凈化凡納濱對蝦養殖廢水，發現蛋白核小球藻優先去除NO2?-N與NO3?-N，這可能是由于NH4+-N濃度超出了藻類的理想吸收范圍導致的；Ohmori等[37]研究表明，氨氮濃度降低到一定濃度時，微藻對氨氮的吸收速率顯著提高。

3.2 光照強度與初始藻密度對NH4+-N、NO2?-N的去除效果

本實驗中對照組NH4+-N含量降低與曝氣導致的NO2?-N含量升高，可能是NH4+-N揮發與被氧化所致[38-40]。在有氧環境下，亞硝酸細菌將NH4+-N氧化成NO2?-N，而硝酸細菌繁殖周期相對較長，不能及時將NO2?-N氧化成NO3?-N，因此導致NH4+-N降低與NO2?-N堆積[41-42]。

與鄭嬌莉等[43]研究結果相似，本實驗結果顯示，光照強度為18000 lx時NH4+-N去除率可達96.23%，接種初始藻密度為2.5×105個/mL 時NH4+-N去除率達94.92%，而對NO2?-N去除率均接近100%；效果優于劉盼等[18]、楊坤等[33]與焦蓉婷等[44]實驗中NH4+-N和NO2?-N的去除效果，表明藻類去除氮鹽效果與藻種類、環境等密切相關。本研究表明，在18000 lx時NH4+-N去除率最高，在9000 lx時NO2?-N去除率最高，初始藻密度在2.5×105個/mL時對NH4+-N、NO2?-N去除率最高，但光照與藻密度交互作用對氮鹽的去除效果尚需進一步研究。

3.3 NO2?-N的同化途徑

本研究顯示，曝氣條件下溶解氧含量達到9 mg/L以上NO2?-N含量未發生顯著變化，同時在普通小球藻快速產氧期(0～12 h)時水體中NO2?-N與NO3?-N含量未發生顯著變化，表明氧氣無法氧化NO2?-N，這可能與NO2?-N自身具有一定強度的氧化性有關[45-46]。在生產中，開增氧機能降低養殖池塘NO2?-N含量，其原因可能是硝化細菌將NO2?-N氧化所致，因為在有氧環境中硝化細菌能夠加速將NO2?-N氧化至NO3?-N[47]。本實驗中NH4+-N下降階段(6 h)亞硝酸鹽還原酶活性較低[(56.59±3.56) ng/L]，而在NO2?-N下降階段(24小時)亞硝酸鹽還原酶活性升高了2.3倍。因此，本實驗中小球藻去除NO2?-N的機理∶藻細胞內亞硝酸鹽還原酶將NO2?-N還原成NH4+-N進而被同化吸收。

3.4 普通小球藻對水體DO、pH影響及藻密度變化

藻類通式為C106H263O110N16P[48]，與其他藻類一樣，普通小球藻的擴增同時需要碳源和氮源，二氧化碳作為小球藻光合作用的碳源被同化吸收，導致水體中溶解CO2含量變少，其電離平衡向生成CO2的方向移動，造成水體中的H+大量消耗，pH升高；同時光合作用釋放出大量的氧氣，增加水體中溶解氧含量，因此，本實驗中普通小球藻組DO與pH顯著高于對照組。本研究中小球藻在吸收無機氮源時，生物量迅速增長，消耗了水體中的營養鹽，限制了后期普通小球藻的增殖[49-51]，表現為藻密度相對穩定。

3.5 普通小球藻在水產養殖產業上的應用

養殖水體添加普通小球藻后，普通小球藻可以迅速同化吸收無機氮離子，合成自身生物量，此時氮的走向為無機氮→小球藻；小球藻被濾食性魚類或輪蟲等浮游動物攝食，氮走向變為小球藻(植物蛋白)→水生動物(動物蛋白)。通過普通小球藻對水體中氮營養鹽的吸收利用，可有效防止氮營養鹽含量過高引起藍藻爆發[52-53]。普通小球藻通過光合作用將水體中溶解的CO2作為碳源同化吸收，保持水體弱堿性環境，降低有害細菌繁殖[54]；同時光合作用釋放氧氣，增加水體溶解氧含量，為養殖動物提供生命保障，也為硝化作用提供必要條件，并有效預防NO3?-N在缺氧環境下被反硝化為NO2?-N，減少對養殖動物的危害[55-57]。光照條件下曝氣可顯著提高普通小球藻對NO2?-N的去除速率與去除率，同時可促進NH4+-N的去除，因此，利用普通小球藻處理富營養化養殖水體時可配合使用增氧機。適當的藻密度增加有利于提高NH4+-N與NO2?-N去除速率，因此，應對養殖池塘NH4+-N、NO2?-N驟然升高，應選擇合理增加藻體密度，而預防養殖池塘NH4+-N、NO2?-N升高，選擇較低藻密度處理即可。利用普通小球藻處理工廠化養殖尾水時，通過合理提高光照強度與藻密度，同時給予適當強度的曝氣條件，可加快水體中氮鹽的去除以改善水質。

4 結論

光照條件下普通小球藻能夠有效去除水體中NH4+-N、NO2?-N與NO3?-N，其利用順序為NH4+-N＞NO3?-N＞NO2?-N。普通小球藻吸收亞硝酸鹽過程中，其細胞內亞硝酸鹽還原酶活性顯著升高。光照增強與藻密度增加對氮鹽的去除具有一定的促進作用，光照條件下曝氣可顯著提高普通小球藻對NO2?-N的去除速率與去除率?；诔靥了w原位生物修復，本研究結果可為綠色健康養殖提供理論支撐。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）