地中?；【?17-T6的溶藻活性

史含夢， 洪 帆， 戴應芬， 徐夢雅， 楊 銳

(1. 寧波大學，浙江省海洋生物工程重點實驗室，浙江 寧波，315211；2. 寧波大學海洋學院，浙江 寧波，315211)

溶藻細菌(algae-lysing bacteria)是可以通過直接或間接方式抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統稱[1]。1942年有研究發現，寄生多囊粘菌(Polyangiumparasiticum)能殺死剛毛藻(Cladophoraspp.)，首次報道了細菌溶藻現象[2]。隨后關于細菌溶藻的報道陸續增多?，F已報道的溶藻細菌有黏細菌屬(Myxobacter)、噬纖維菌屬(Cytophaga)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Phingomonas)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、弧菌屬(Vibrio)和芽孢桿菌屬(Bacillus)等[3-4]。

許多海洋致病菌都具有溶藻特性。李杰等[5]在綠斑病紫菜的藻體中發現海洋假交替單胞菌(P.marina)具有較強的胞外酶活性，可殺死藻細胞。黃林彬等[6]發現科貝特氏菌屬(Cobetia)可侵入壇紫菜(Porphyra haitanensis)藻細胞并釋放內毒素而殺死紫菜細胞，引起紅爛病[7]。Wang等[8]發現海洋弧菌DHQ25可分泌胞外蛋白來抑制和殺死赤潮藻。Jeong等[9]研究發現，海洋芽孢桿菌SY-1菌株分泌的多肽類物質(bacillamide)對多環旋溝藻有特異性的殺滅作用。Guo等[10]證實了氣單胞菌菌株GLY-2107可通過分泌熱穩定性的胞外化合物來殺死銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)。Li等[11]報道從患病的海帶藻體上分離出的假交替單胞桿菌SM0524可分泌藻酸鹽裂解酶，使海帶病爛?？梢?，溶藻細菌的作用方式多樣，且機制復雜。

紫菜絲狀體黃斑病是紫菜貝殼絲狀體育苗期間高發的嚴重疾病，能夠導致貝殼出現黃斑，最后白化，造成育苗失敗[12]。地中?；【?V. mediterranei) 117-T6(Vm117-T6)被證實是該病的一種致病菌，可以破壞紫菜絲狀體細胞的內膜系統，導致細胞空胞化[13]。我們發現，Vm117-T6同樣也能感染紫菜葉狀體以及赤潮異彎藻等其他藻類，造成細胞解體，是一株廣譜性的溶藻細菌。本實驗擬觀察Vm117-T6對赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)、顆石藻(Pleurochrysis carterae)、叉鞭金藻(Dirateria inornata)和東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的溶藻作用，探究其溶藻物質的特性，為解析菌株的溶藻機制提供證據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料培養

實驗所用赤潮異灣藻(NMBjah045)、顆石藻、叉鞭金藻和東海原甲藻均由浙江省海洋生物工程重點實驗室藻種庫提供。

將經0.22 μm孔徑濾膜過濾后的海水，每1 L中添加1 mL寧大3號母液[12]作為培養基。將藻種按1.0×103CFU/mL的密度按照1∶5(體積比)的比例，接種至培養液中，于培養箱中培養3～4 d，每日搖瓶2次。于20 °C，光照強度36 μmol photons m?2s?1，光暗周期12 L∶12 D條件下將微藻培養至指數生長期。調整藻液濃度至1.0×106CFU/mL，備用。

1.2 Vm 117-T6的培養

紫菜絲狀體黃斑病病原菌Vm117-T6保存于浙江省海洋生物工程重點實驗室。保藏菌株室溫解凍后接種至NaCl濃度為1%的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB，青島海博生物技術有限公司)液體培養基中，28 °C，110 r/min，活化培養12 h。菌株擴增與培養條件相同。

1.3 Vm 117-T6感染實驗

取活化的Vm117-T6，2775×g離心5 min，去除培養基后，在滅菌的富N/P的營養海水(0.0008%P-H2PO4，0.002% N-NO3)中重新懸浮。調整菌體密度約1.0×107CFU/mL。

將菌體按1∶10(體積比)接種于指數生長中期的赤潮異灣藻、顆石藻、叉鞭金藻和東海原甲藻等藻液中，每組設置3個平行。感染72 h后測定藻體中葉綠素a含量，并計算其溶藻率。取適量藻液，7104×g離心5 min，棄上清液，加入等體積95%乙醇，4 °C靜置24 h，7104×g離心5 min，取上清液于649 nm和665 nm下測定其OD值。Ca=13.95×OD665?6.88×OD649。式中，Ca為葉綠素a的質量濃度。

溶藻率的測定∶I(%)=(1?Ct/C0)×100%。式中，I為溶藻效率；Ct和C0分別為感染時間為t時和0時對照的葉綠素a濃度。

1.4 Vm 117-T6對不同碳源的降解作用

分別以果膠、卡拉膠、纖維素和幾丁質作為唯一碳源制備選擇培養基。將浸有Vm117-T6的濾紙片貼附在特定的選擇培養基上，28 °C培養48 h。培養基用碘液染色5 min后，無菌水清洗染液，測量菌落周圍透明圈的大小，以判斷Vm117-T6降解不同碳源的能力。

1.5 Vm 117-T6胞內物、胞外物和菌體的溶藻效果

胞內物制備參照已有文獻[14]，以1∶100(體積比)的比例將Vm117-T6接種于NaCl濃度為1%的TSB培養基中，28 °C，110 r/min培養48 h后，4 °C，11180×g離心30 min，收集菌體，加入滅菌的富N/P營養海水(0.0008% P-H2PO4，0.002% N-NO3)重懸浮。低溫下，超聲細胞粉碎機破碎20 min，將破碎液11180×g離心5 min，取上清液，4 °C保存備用。

胞外物制備參照已有研究[9]，將200 μLVm117-T6涂布于鋪有無菌玻璃紙，NaCl濃度為1%的大豆酪蛋白瓊脂培養基(TSA，青島海博生物技術有限公司)上，28 °C培養48 h。隨后，加入2 mL富含N、P的無菌營養海水(0.0008% PH2PO4，0.002% N-NO3)，清洗菌苔。4 °C，11180×g離心30 min。上清液經0.22 μm的微孔濾膜過濾，4 °C保存備用。

菌體制備以1∶100(體積比)的比例將Vm117-T6接種至NaCl濃度為1%的TSB培養基中，110 r/min，28 °C培養12 h，備用。

Vm 117-T6胞外物、胞內物、菌體溶藻效果測定將上述處理所得溶藻物質以1∶10(體積比)的比例接入100 mL指數生長中期的赤潮異彎藻藻液中，24 h后測定其葉綠素a含量并計算其溶藻率。葉綠素a含量及其溶藻率的計算方法同“Vm117-T6感染實驗”。

1.6 感染赤潮異彎藻顯微觀察

將制備好的Vm117-T6的胞外物與菌體按照1∶10(體積比)的比例接入100 mL指數生長中期的赤潮異彎藻藻液中，感染條件為20 °C，光照強度36 μmol photons m?2s?1，光周期為12 L∶12 D，培養40、80和120 min時取藻細胞于光學顯微鏡下觀察。

1.7 不同處理下Vm 117-T6胞外提取物對溶藻率的影響

Vm117-T6胞外物乙醇處理取Vm117-T6胞外物溶藻組分100 mL，加入3倍體積無水乙醇，常溫下靜置10 min，1776×g離心20 min，分別收集上清液和沉淀。上清液于65 °C真空旋蒸濃縮至100 mL，重復3次。用少量蒸餾水溶解殘留固體，得到溶解相。將收集的沉淀用蒸餾水溶解后合并，去除殘留乙醇，得到沉淀相。無菌水定容至100 mL。

Vm 117-T6胞外物有機溶劑萃取取Vm117-T6胞外物溶藻組分100 mL，用2倍體積石油醚或乙酸乙酯靜置萃取24 h，分別收集水相和有機相。水相經65 °C真空蒸發掉殘留有機溶劑。有機相于65 °C真空蒸發干燥，用少量蒸餾水溶解殘留固體。無菌水定容至100 mL。

Vm 117-T6胞外物活性炭吸附取Vm117-T6胞外物溶藻組分100 mL，加入適量活性炭粉后，經過1776×g離心，過濾，將處理后的組分用無菌水定容至100 mL。

Vm 117-T6胞外物高溫處理取“Vm117-T6胞內物、胞外物和菌體的溶藻效果”中胞外物溶藻組分100 mL，100 °C水浴20 min，冷卻至室溫，0.22 μm的濾膜過濾，無菌水定容至100 mL。

Vm 117-T6胞外物不同組分溶藻率的測定將上述處理所得溶藻物質以1∶10(體積比)的比例接入100 mL指數生長中期的赤潮異彎藻藻液中，24 h后測定其葉綠素a含量并計算其溶藻率。葉綠素a含量及其溶藻率的計算方法同“Vm117-T6感染實驗”。

1.8 Vm 117-T6不同條件下差異蛋白的分離與分析

對常規條件、最佳生長條件與易感條件下菌株的差異蛋白進行分析。將Vm117-T6于3種條件培∶ A(易感條件下)為30 °C、pH 6.0、鹽度20；B(常規條件)為26 °C、pH 6.0、鹽度20；C(最佳生長條件[12])為30 °C、pH 7.0、鹽度20。培養條件同“Vm117-T6的培養”。參照“Vm117-T6胞內物、胞外物和菌體的溶藻效果”的方法制備不同生長條件下菌體的胞外物與胞內物。

利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離菌株蛋白質，切割目的片段經胰蛋白酶消化后進行液相色譜質譜聯用儀(Liquid Chromatograph Mass Spectromete，LC-MS)分析[15]，蛋白鑒定工作由上海鹿明生物科技有限公司協作完成。制備C18膜填充柱；將揮發干的多肽樣品重新溶解于Nano-HPLC Buffer A中；對多肽樣品進行活化、平衡、固肽、脫鹽，后更換新的EP管，用40 μL Nano-HPLC Buffer B洗脫多肽樣品，并將脫鹽后的多肽樣品揮干。

將多肽樣品重新溶解于Nano-HPLC Buffer A中。采用Nano-HPLC液相系統(EASY-nLC1200，Thermo Inc.，美國)，色譜柱使用Trap column(RPC18, 100 μm×20 mm, Thermo Inc.，美國)和Analysis column(RP-C18, 75 μm×150 mm, Thermo Inc.，美國)進行分離。酶解產物經毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質譜儀(Thermo Scientific，美國)進行全掃描(full scan)分析。

結果按照如下所示參數進行搜庫分析，Software∶ProteomeDiscover 2.4；Database∶地中?；【?uniprot-Vibrio+organism_mediterranei.fasta；MS1 tolerance∶10 ppm；MS2 tolerance∶0.02 Da；Missed cleavage∶2；Static modification∶Carbamidomethyl (C)；Dynamic modification∶Acetyl (Protein N-term)、Deamidated (NQ)、Oxidation (M)。

1.9 統計方法

實驗數據采用Excel 2020和Origin 2020軟件進行作圖分析，并采用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)或雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)，使用Tukey多重比較檢驗來確定各處理間的差異顯著性。數據以平均值±標準差(mean ± SD)表示，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 Vm 117-T6對不同微藻的溶藻作用

Vm117-T6感染72 h后溶藻率顯示，該菌株具有廣譜且較強的溶藻活性，對東海原甲藻的溶藻率高達93.5%、對赤潮異彎藻、顆石藻和叉邊金藻的溶藻率分別達到了88.5%、62.3%和73%(圖1)。

圖1 Vm 117-T6感染不同微藻72 h的溶藻率1.赤潮異彎藻，2.顆石藻，3.叉鞭金藻，4.東海原甲藻Fig. 1 Algae-lysis rate of Vm 117-T6 infection on different microalgae for 72 h1. H. akashiwo，2. P. carterae，3. D. inornata，4. P. donghaiense

2.2 Vm 117-T6對不同微藻葉綠素含量的影響

Vm117-T6感染72 h后，不同微藻的葉綠素a的含量始終顯著低于對照組(P＜0.05，圖2)。不同藻類對Vm117-T6的敏感程度也有所差異。處理72 h后，赤潮異彎藻和東海原甲藻的葉綠素a含量較對照組分別下降7.71和14.34倍；而顆石藻與叉鞭金藻的葉綠素a含量較對照組分別下降1.65和2.67倍。

圖2 Vm 117-T6感染72 h對不同微藻葉綠素a含量的影響(a)赤潮異彎藻，(b)顆石藻，(c)叉鞭金藻，(d)東海原甲藻；對照. 未經感染的微藻，Vm 117-T6. 感染Vm 117-T6的微藻；“*” 表示同一時間點不同處理之間差異顯著(P＜0.05)，“**” 表示同一時間點不同處理之間差異極顯著(P＜0.01)。Fig. 2 Effect of 72 h Vm 117-T6 infection on the chlorophyll a content of different microalgae(a) H. akashiwo, (b) P. carterae, (c) D. inornata, (d) P. donghaiense; control. uninfected microalgae, Vm 117-T6. uninfected microalgae; "*" means the difference between different treatments is significant(P＜0.05), “**” means the difference between different treatments is extremely significant(P＜0.01).

本研究所用微藻均為從東海赤潮中分離獲得的形成赤潮水華的種類。鑒于上述實驗結果，考慮到赤潮異灣藻無細胞壁，便于更好地觀察細胞變化，因此，后續實驗選取赤潮異彎藻為對象，用于評估Vm117-T6的溶藻特性。

2.3 Vm 117-T6對不同碳源的降解能力

果膠、卡拉膠、纖維素和幾丁質均為藻類細胞壁的重要組分，以其作為唯一碳源來培養Vm117-T6，發現菌株僅在卡拉膠固體培養基上形成明顯的透明水解圈(圖3)，而對其他幾種物質無顯著效果。這說明Vm117-T6具有特異性降解卡拉膠的能力，不能分解果膠、纖維素和幾丁質。

圖3 Vm 117-T6在卡拉膠固體培養基上的水解圈Fig. 3 Hydrolysis zone of Vm 117-T6 on carrageenan solid medium

2.4 Vm 117-T6胞外物、胞內物和菌體的溶藻效果

對Vm117-T6的胞內物、胞外物及菌體進行溶藻效果比較。處理24 h后，胞內物、胞外物與菌體的溶藻率分別為38.23% ± 3.76%、41.84% ±2.05%和37.89% ± 3.63%(圖4-a)，三者之間無顯著性差異(P＞0.05)。添加Vm117-T6胞外物的赤潮異灣藻的葉綠素a含量從(52.64 ± 0.98) mg/L降低至(26.14 ± 0.94) mg/L(圖4-b)，差異極顯著(P＜0.01)，而胞內物和菌體亦顯著降低了赤潮異彎藻的葉綠素a的含量(P＜0.05)。結果顯示，Vm117-T6及其胞內物與胞外物均對赤潮異彎藻有顯著抑制作用。

圖4 Vm 117-T6胞內物、胞外物及菌體作用24 h對赤潮異彎藻的溶藻率的影響1.Ck，2.胞內物，3.胞外物，4.菌體。Fig. 4 Alginolytic effect of different microalgae-lysing components of Vm 117-T6 on H. akashiwo for 24 h1. Ck, 2. intracellular enzyme 9 (IS), 3. extracellular substance (ES), 4. bacteria (BAT).

2.5 Vm 117-T6胞外物及菌體對赤潮異彎藻細胞形態的影響

Vm117-T6胞外物對赤潮異彎藻細胞形態的影響結果顯示，感染0 min的赤潮異彎藻細胞呈圓形，細胞結構完整、緊密，游動迅速(圖版-1,5)。胞外物感染40 min后，藻細胞的泳動能力減弱、細胞逐漸膨脹變圓、細胞質中開始出現空腔(圖版-2)。此時，藻細胞邊緣完整；胞外物感染80 min，藻細胞內空腔不斷增大，內含物的顏色逐漸變淡(圖版-3)。胞外物感染120 min，藻細胞破裂，細胞質組分呈顆粒狀分散在培養液中(圖版-4)。

Vm117-T6菌體對赤潮異彎藻細胞形態的影響結果顯示。整體而言，菌體感染導致藻體活性降低更為嚴重，在感染40和80 min，藻細胞的結構較胞外物感染組更為松散，感染120 min時，赤潮異彎藻的細胞內容物分散成不規則的透明顆粒，其中嵌有細菌菌體(圖版-5～8)，表明菌體感染會對赤潮異彎藻造成更嚴重的損傷。

2.6 Vm 117-T6胞外物不同處理對赤潮異灣藻的溶藻效果

對Vm117-T6胞外物進行不同處理，并檢測其產物的溶藻活性。結果顯示，作用24 h后，與未經處理的胞外物溶藻率(41.84% ± 2.05%)相比、石油醚水相、碳吸附和高溫處理樣本的都檢測到較高溶藻率，分別為44.77%±2.39%、41.83%±1.91%和41.90%±1.79%，四者之間無顯著性差異(P＞0.05)(圖5)。乙酸乙酯水相、乙醇溶解相與沉淀相的溶藻率分別為32.64%±1.56%、22.77%±2.56%、35.67%±2.79%，顯著低于未處理的胞外物溶藻活性(P＜0.05)，但此三者之間差異不顯著(P＞0.05)。胞外物的石油醚相或者乙酸乙酯相的溶藻率均為負值，與正常培養的藻類無顯著性差異(P＞0.05)，表示此二者不具溶藻活性。由此可知，Vm117-T6胞外溶藻物的特性∶易溶于水，不溶于石油醚和乙酸乙酯，具較強極性；耐高溫，不易被活性炭吸附，乙醇處理會降低溶藻活性。

圖5 Vm 117-T6 胞外物不同處理產物作用24 h對赤潮異彎藻溶藻率的影響1. Ck，2. 胞外物，3. 乙醇溶解相，4. 乙醇沉淀相，5. 石油醚相，6. 石油醚水相，7. 乙酸乙酯相，8. 乙酸乙酯水相，9. 碳吸附，10.高溫。Fig. 5 Effects of different treatment products of Vm 117-T6 extracellular substance on the algae lysis rate of H. akashiwo in 24 h1. Ck, 2. extracellular substance, 3. ethanol dissolution phase, 4. ethanol precipitation phase, 5. upper layer of petroleum ether, 6. lower layer of petroleum ether, 7. upper layer of ethyl acetate, 8. lower layer of ethyl acetate, 9. carbon adsorption, 10. high temperature.

2.7 Vm 117-T6不同條件下差異蛋白的分析

分析易感條件與常規條件下Vm117-T6胞內物和胞外物的蛋白差異，結果發現分子量為37和40 ku的蛋白質條帶變化最顯著(圖6)。這些蛋白條帶均注釋到地中?；【鶲X，而且其中含有較多分泌蛋白結合蛋白(表1)，如ABC轉運蛋白的結合蛋白，外膜蛋白TolC、OmpA，Ⅱ型及VI型分泌系統的結合蛋白。除RTX toxin蛋白外，胞外蛋白中未發現與已知溶藻物質相關的蛋白質和肽段。

表1 Vm 117-T6溶藻蛋白鑒定結果分析Tab. 1 Identification and protein annotation of lysing proteins in pathogenic Vm 117-T6

圖6 Vm 117-T6胞內物和胞外物蛋白電泳圖譜M. 蛋白質分子量標準；ES (extracellular substance)為Vm 117-T6胞外物，IS (intracellular substance)為Vm 117-T6胞內物；ES-A和ISA的培養條件為30 °C、pH 6.0、鹽度20，ES-B和IS-B的培養條件為26 °C、pH 6.0、鹽度20，ES-C和IS-C的培養條件為30 °C、pH 7.0、鹽度20。Fig. 6 Vm 117-T6 intracellular and extracellular protein electrophoresis patternM. marker 170; ES (extracellular substance), Vm 117-T6 extracellular substance, IS (intracellular substance), Vm 117-T6 intracellular substance; culture conditions of ES-A and IS-A are 30 °C, pH 6.0, salinity 20, culture conditions of ES-B and IS-B are 26 °C, pH 6.0, salinity 20,culture conditions of ES-C and IS-C are 30 °C, pH 7.0, salinity 20.

綜上，我們推測Vm117-T6的溶藻毒力因子中應含有極性內毒素類物質，此外，與毒性因子轉運、分泌以及細胞黏附相關的轉運蛋白等蛋白質在其毒力作用中也發揮了重要功能。這說明多種溶藻機制參與了Vm117-T6的溶藻過程。

3 討論

細菌可以通過直接溶藻、間接溶藻、或是通過營養競爭的方式使藻細胞死亡[16]。直接溶藻，即細菌直接接觸藻體進行攻擊，甚至侵入藻細胞內部，殺死藻細胞[17]。Li等[18]從福建廈門水域分離得到了一株幾丁質單胞菌屬細菌(Chitinimonas prasineLY03)，其可通過鞭毛黏附在假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)的藻細胞上，產生幾丁質酶降解藻細胞壁，最終導致藻細胞死亡。果膠、卡拉膠、纖維素和幾丁質是藻類細胞壁的重要成分。部分溶藻細菌的溶藻活性與果膠酶[19]、β-葡萄糖苷酶、幾丁質酶[20]、纖維素酶[21]等有關。在本研究中，Vm117-T6可降解卡拉膠，但不能降解果膠、纖維素和幾丁質等物質。由于卡拉膠并非本研究的幾種微藻細胞壁的主要成分[22]，因此，推測Vm117-T6對本研究中幾種微藻的溶解作用并非作用于這些藻類的細胞壁。

間接溶藻作用是近年來文獻報道最多的細菌溶藻方式。細菌通過分泌胞外溶藻化合物來攻擊藻類細胞[16]。本研究中Vm117-T6的胞外溶藻化合物表現出較強的水溶性、耐高溫、不易被活性炭吸附且被乙醇部分沉淀的特性。這表明Vm117-T6的胞外溶藻物質中可能含有極性內毒素類物質。目前已報道的溶藻細菌可能分泌靈菌紅素、鼠李糖脂、生物表面活性物質和抗生素等來抑制藻細胞生長或者殺死藻細胞[9,18,23]。Wang等[24]發現鼠李糖脂可降低藻細胞活性，改變藻體形狀，長時間處理會導致藻類產生白色絮狀沉淀[25]。這與本研究中Vm117-T6對赤潮異彎藻的作用相似。Vm117-T6的胞外溶藻物質具體為何，仍需進一步查證。

藻體形態顯示，菌體感染會比胞外物感染造成藻細胞更大的損傷，因此，菌株的毒力除了胞外物質還應該包括其他毒力因子的參與。本研究中，Vm117-T6 在易感條件下差異最大的蛋白質主要為ABC轉運蛋白、外膜蛋白以及少量RTX toxin。這些蛋白或多肽是許多致病菌的毒力因子，也是很多細菌溶藻的重要手段。目前已報道的溶藻蛋白一般為分子量約為10 ku的小分子分泌蛋白[26-28]。Banin等[28]發現一種使珊瑚褪色的施羅氏弧菌(V. shilonii)，能分泌多肽降低共生蟲黃藻細胞內的pH，從而阻礙藻細胞的光合作用。該細菌后被證實為地中?；【耐锂惷鸞29]。鄭寧寧[26]于叢毛單胞科(Comamondaceae)細菌WR11溶藻過程中發現，其外膜蛋白、ABC轉運蛋白、Ⅱ型分泌系統蛋白表達顯著高于突變株M20。海洋殺藻細菌(Hahellasp. KA22)分泌的靈菌紅素可誘導活性氧(ROS)產生，通過特定的ABC轉運蛋白刺激藻細胞，使其光合系統紊亂，達到殺死藻細胞的目的[30]。ABC轉運蛋白作為重要的跨膜轉運蛋白，以主動轉運和單向轉運的方式實現多種分子的跨膜運輸[31]。

圖版 Vm 117-T6胞外物和菌體感染對赤潮異灣藻細胞形態的影響1.胞外物感染0 min，2.胞外物感染40 min，3.胞外物感染80 min，4.胞外物感染120 min，5.菌體感染0 min，6.菌體感染40 min，7.菌體感染80 min，8.菌體感染120 min。Plate Vm 117-T6 extracellular and bacterial infection of H. akashiwo1. extracellular substance infection for 0 min, 2. extracellular substance infection for 40 min, 3. extracellular substance infection for 80 min, 4. extracellular substance infection for 120 min, 5. bacterial infection for 0 min, 6. bacterial infection for 40 min, 7. bacterial infection for 80 min, 8. bacterial infection 120 min.

TolC蛋白在很多革蘭氏陰性菌中參與了毒力因子的分泌[32]，通過調節病原菌的環境刺激耐受能力，增強其定殖活性，從而對病原菌進行致病力調控[33]。RTX toxin是一種重要的毒力因子，在眾多致病革蘭氏陰性菌的細胞活性中起重要作用[34]。吳寒華等[35]在新型海桿菌(Marinobacter)菌株YWL01的基因組中不僅檢測到LuxR同系物、RTX毒素同系物，同時也檢測到了編碼外膜蛋白TolC的基因。在Vm117-T6的胞外蛋白中也檢測到外膜蛋白TolC和RTX toxin等序列。同時，在Vm117-T6胞外物的蛋白組分中存在革蘭氏陰性菌中介導細菌殺傷作用的Ⅵ型分泌系統[36]的結合蛋白以及與參與細菌定殖宿主的過程，與細菌運動性、黏附性、以及毒力相關的外膜蛋白OmpA[37]和鞭毛蛋白Flagellin OS。

綜上，Vm117-T6是一株廣譜的活性較強的溶藻細菌，其毒力作用物中含有水溶性強且熱穩定的內毒素類物質，且轉運蛋白、外膜蛋白以及與細菌定植相關的蛋白可能也在其毒力中發揮重要作用。推測多種溶藻機制參與該菌株的溶藻過程。該菌株的胞外分泌物中含有極性性強且熱穩定的溶藻物質，可能是其感染性強[12-13]、傳播速度快的重要原因。

自2000年以來，我國近海大規模赤潮不斷出現，并呈現出多樣化、小型化和有害化的演變趨勢，對沿海地區社會經濟發展和生態系統健康構成嚴重威脅[38]。有研究發現，在赤潮生消的過程中，細菌、病毒等海洋微生物的豐度會發生較大變化，從側面驗證了赤潮的消亡很大程度上與細菌有著密切的關系[2,39]。溶藻細菌作為水生生態系統中種群結構和功能的重要組分，對維持藻的生物量平衡具有非常重要的作用[16,40]。本研究中，Vm117-T6對赤潮異彎藻、東海原甲藻、叉邊金藻和顆石藻等微藻均具有溶藻活性，也從另一個方面顯示該菌株生態功能的多樣性。是否能夠將該菌株開發成抑制赤潮的安全性功能菌株值得進一步探究。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）