pH/溫度響應型聚合物PMAA-b-PDMAEMA的合成、性能調控及應用

孫月，王斯佳，吳明俠，宋先雨，徐首紅

（1河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450000；2重慶三峽學院環境與化學工程學院，重慶 404020；3華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237）

環境響應型聚合物是一類擁有獨特官能團或結構特征，能夠依據外界環境微小變化誘導自身物理/化學性質發生突變的一類聚合物[1-2]。這些聚合物能對溫度[3-5]、pH[6-8]、氧化還原[9-10]、酶[11-12]、光[13]及離子強度[14-15]等不同環境變化作出響應。由于這一特殊性質，近年來環境響應型聚合物得到廣泛研究，可制造出應用于多種環境的智能材料，所制備的聚合物材料具有生物相容性好、可調控、合成成本低、制備簡單等優點，成為在生物醫藥[16-17]、治療檢測、抗菌涂層[18]等領域研究的熱點。

兩種或多種聚合物基于共價或非共價鍵的相互作用可形成聚合物復合物，通過將帶電基團與之相反的兩種或多種聚合物進行共聚，可制備出結構更易調控、響應性更好的聚合物復合材料。聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）是一種擁有pH和溫度雙重響應性能的聚合物[19-21]，具有可調控的相轉變溫度，聚合物的分子量、溶液pH、濃度等均會對溫敏性產生影響[22-23]，可通過控制條件來調節合適的相變溫度以應用于不同領域。聚甲基丙烯酸（PMAA）是具有pH響應性能的聚合物，擁有可調節的等電點，許多研究者們將PMAA與其他材料相結合，制備出具有特殊性質的功能材料。Wang等[24]通過將PMAA偶聯到多肽上設計出一種具有潛在抗腫瘤性能的多肽-聚合物共軛物（PEPc-PMAA），研究了其與模擬細胞之間的相互作用，該共軛物在pH=5.5時引起膜結構改變，膜內物質大量泄漏。單一刺激響應型聚合物雖具備響應性能，但響應環境的靈敏度低，應用范圍受限。近年研究者們[25-26]通過分子設計將多個刺激響應基團或聚合物鏈段引入嵌段共聚物中，以實現多種響應行為的協同作用。PDMAEMA 和PMAA 鏈段的側基分別含有氨基和羧基基團，將兩個具有單一功能基團的鏈段通過活性聚合法共聚，可制備出擁有多功能基團的雙重或多重智能型聚合物，該類聚合物對環境的微小變化有更高的響應性，更靈敏的結構可調控性，通過結構間親-疏水性的轉換可實現在不同領域的應用。其中，該聚合物通過響應環境的變化擁有與抗菌肽類似的兩親性結構特征，可用于模擬抗菌肽的抗腫瘤作用機制；最重要的是，響應型聚合物擁有可自動識別周圍環境變化的特殊性質，能選擇性地靶向至腫瘤區域，通過腫瘤區域特殊的環境刺激實現對腫瘤細胞膜結構的破壞，從而導致細胞死亡。

本文制備了一系列具有pH/溫度雙重響應性能的共聚物PMAA-b-PDMAEMA，測試了共聚物在不同條件影響下的響應行為（圖1），明確了其嵌段比、分子量及溶液pH對響應行為的調控，并利用共聚物在不同pH條件下的帶電性能及親-疏水性之間的轉換，研究了對模擬腫瘤細胞膜結構的靶向破壞性，PMAA-b-PDMAEMA 展現出良好的功能可調控性，旨在為響應性共聚物的進一步開發應用提供參考。

圖1 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的pH/溫度響應性示意圖

1 實驗

1.1 實驗試劑

甲基丙烯酸叔丁酯（tBMA，>98.0%）、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA，99.9%），TCL 科技集團股份有限公司，通過堿性氧化鋁層析柱去除阻聚劑；溴化亞銅（CuBr，99.0%）、2-溴異丁酸乙酯（EBIB，98%），Sigma-Aldrich 有限公司，經冰乙酸、乙醇洗滌三次后真空干燥；N,N,N',N'',N'''-五甲基二乙烯基三胺（PMDETA，98%），上海麥克林生化科技有限公司；二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC，>98.0%）和二棕櫚酰磷脂酰甘油（DPPG，>98.0%），艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司；羅丹明6G，阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖凝膠G50，上海易恩化學技術有限公司；甲苯、二氯甲烷、1，4-二氧六環、濃鹽酸，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 均聚物PDMAEMA、PtBMA和PMAA的合成

1.2.1 均聚物PDMAEMA的合成

本實驗均采用原子轉移自由基聚合（ATRP）法合成聚合物，將一定比例的單體DMAEMA、溶劑乙酸乙酯、配體PMDETA 和引發劑2-溴異丁酸乙酯依次加入三口燒瓶中，攪拌使之完全溶解。然后將該體系用液氮冷凍-抽真空-通氮氣解凍循環操作3次，之后再次將體系冷凍，在氮氣保護下加入催化劑CuBr，封口停止通氮氣，數分鐘后，再次抽真空通氮氣解凍，保證體系處在無水無氧條件下；最后在70℃條件下反應24h。各物質的投料[DMAEMA]∶[EBIB]∶[PMDETA]∶[CuBr]摩爾比為a∶1∶2∶1，其中，a為DMAEMA 的投料量。待反應結束后，將反應溶液用少量乙酸乙酯稀釋后通過中性氧化鋁層析柱除去該體系中的CuBr/PMDETA 催化體系，旋蒸濃縮后，用10 倍體積的冰正己烷沉降純化樣品3次，室溫下真空干燥至恒重，得到固體樣品PDMAEMA。

1.2.2 均聚物PtBMA的合成

將一定比例的單體tBMA、溶劑甲苯、配體PMDETA 和引發劑2-溴異丁酸乙酯依次加入三口燒瓶中攪拌使之完全溶解。按照1.2.1節中ATRP法進 行 操 作。 各 物 質 的 投 料[tBMA]∶[EBIB]∶[PMDETA]∶[CuBr]的摩爾比為b∶1∶2∶1，其中，b為tBMA的投料量。待反應24h結束后，以二氯甲烷為洗脫液，將反應溶液通過中性氧化鋁層析柱除去體系中的催化體系，經濃縮后用10 倍體積的冰甲醇沉降純化樣品3 次，室溫下真空干燥至恒重，得到無色透明的黏稠狀樣品。

1.2.3 均聚物PMAA的合成

將一定量PtBMA 樣品完全溶解于1,4-二氧六環中，按鹽酸和1,4-二氧六環體積比為1/10的比例加入市售質量分數為36%～38%的濃鹽酸，并置于80℃油浴中回流反應48h。反應結束后，靜置分層，取下層溶液濃縮，于冰正己烷中沉降純化樣品3次，室溫下真空干燥至恒重。將干燥后樣品加水溶解并透析至溶液呈中性，冷凍干燥后密封保存，得到固體樣品PMAA。

1.3 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的合成

1.3.1 PtBMA-Br大分子引發劑的合成

在1.2.2 節中已合成PtBMA 大分子引發劑，此處不在贅述。采用1H 核磁共振波譜（NMR）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）對其結構進行表征。

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1.3.2 共聚物PtBMA-b-PDMAEMA的合成

向三口燒瓶中依次加入大分子引發劑PtBMABr、 溶 劑 乙 酸 乙 酯、 單 體DMAEMA、 配 體PMDETA，攪拌使混合物完全溶解，繼續采用ATRP 法進行合成。各物質的投料[PtBMA-Br]∶[DMAEMA]∶[PMDETA]∶[CuBr]摩爾比為c∶d∶2∶1，其中，c為PtBMA-Br的投料量，d為DMAEMA的投料量。待反應24h結束后，經過柱、濃縮、沉降及干燥后得到反應產物。采用1H NMR和FTIR對其結構進行表征。

1.3.3 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的合成

將一定量PtBMA-b-PDMAEMA 樣品溶于1,4-二氧六環中，按1.2.3 節中的水解方法進行操作，得到終產物PMAA-b-PDMAEMA。采用1H NMR 和FTIR對其結構進行表征。

共聚物PMAA-b-PDMAEMA的合成路線如圖2所示。

圖2 PMAA-b-PDMAEMA的合成路線

1.4 共聚物PMAA-b-PDMAEMA 的pH 響應性測試

稱取適量共聚物PMAA-b-PDMAEMA 配制成1mg/mL 的水溶液，采用0.1mol/L HCl 和0.1mol/L NaOH調節溶液pH。25℃條件下，采用動態光散射（DLS，NanoBrook，90 plus PALS，美國布魯克海文）測定不同pH條件下共聚物水溶液的zeta電位，并利用UV-Vis（SHIMADZU，UV-2600i，日本島津）測定共聚物水溶液在500nm 處透射率隨pH 的變化曲線。

1.5 共聚物PMAA-b-PDMAEMA 的溫度響應性測試

配制濃度為1mg/mL 的PMAA-b-PDMAEMA 水溶液，利用紫外測定共聚物水溶液在不同溫度下的透過率，同時測定pH=8.5、9.5、10.0 條件下，溶液透過率隨溫度的變化曲線。測試溫度范圍為25～70℃，升溫速率1℃/min。

1.6 模擬細胞膜的制備及與共聚物PMAA-b-PDMAEMA的相互作用測試

將定量上述脂質體樣品和共聚物置于截留量3500 的透析袋中，并將透析袋放入相應稀釋倍數的pH 分別為7.4 和5.5 的Tris-HCl 緩沖溶液中，控溫37℃，等時間間隔取定量透析液測其在發射波長范圍內的最大熒光強度，定義為Ft。熒光分子的累積泄漏率計算公式為：Ft/F0×100%。

2 結果與討論

2.1 結構表征

2.1.11H NMR

本文合成了4 種具有不同嵌段比的共聚物PMAA-b-PDMAEMA，利用1H NMR 表征了其結構，以PMAA50-b-PDMAEMA43為例進行描述，結果如圖3所示。圖3(a)為未純化的PtBMA在CDCl3中的1H NMR 譜圖。未純化前含有未反應的單體tBMA、大分子引發劑PtBMA-Br和溶劑峰，化學位移7.18、5.30（峰a1、峰a2）處為未反應完全的單體上碳碳雙鍵的氫質子吸收峰，化學位移2.36處為溶劑甲苯的吸收峰。δ1.03～1.13（峰a、峰c）處為引發劑2-溴異丁酸乙酯末端的甲基氫和共聚物側鏈上的甲基氫，δ1.41（峰d）處為PtBMA中叔丁基的甲基氫[H，—C(CH3)3]，δ1.81（峰b）處為PtBMA主鏈上亞甲基氫吸收峰（H，—C—CH2—），以上結果證明已成功制備大分子引發劑PtBMA-Br。通過核磁中未反應完全的單體上的雙鍵峰a1與PtBMA 中峰d的積分面積之比計算出tBMA的轉化率為85%，進而計算出所合成的大分子引發劑的聚合度和分子量。該系列其他PtBMA的聚合度皆按此方法計算。其中，tBMA的轉化率見式(1)。

圖3 PtBMA、PtBMA-b-PDMAEMA和PMAA-b-PDMAEMA的1H NMR圖

圖3(b)中除了含有上述PtBMA 的吸收峰外，還包含了PDMAEMA 的各個峰。δ2.30（峰h）處為PDMAEMA 上叔胺基的甲基氫[H，—N(CH3)2]；δ2.59（峰g）、δ4.07（峰f）處分別為連接N 的亞甲基氫（H，—O—CH2—CH2—N—）和連接O 的亞甲基氫（H，—O—CH2—CH2—N—）；δ1.82～1.95（峰c）處為主鏈上亞甲基氫。由此確定已成功合成兩嵌段共聚物PtBMA-b-PDMAEM。根據結果中PtBMA 的特征吸收峰與PDMAEMA 的特征吸收峰的積分面積之比計算出PDMAEMA 的聚合度。該系列其他共聚物及其相應參數如表1所示。

表1 不同方法測定的PMAA-b-PDMAEMA的等電點

圖3(c)中PDMAEMA 的3個特征吸收峰（峰c、峰d、峰e）都存在，而在δ1.41處PtBMA上叔丁基的特征峰完全消失，表明PtBMA-b-PDMAEMA 已完全水解為PMAA-b-PDMAEMA。

2.1.2 FTIR

圖4 為均聚物PtBMA 和共聚物PtBMA-b-PDMAEMA 和PMAA-b-PDMAEMA 的紅外譜圖。圖中2978cm-1處為PtBMA和PDMAEMA上甲基質子吸收峰，2823cm-1、2773cm-1處為PDMAEMA 上叔胺基的甲基質子吸收峰，證明已成功合成PtBMA和PtBMA-b-PDMAEMA。3370cm-1處為水解后PMAA 上—OH 的質子吸收峰，且圖中1394cm-1、1367cm-1處PtBMA 的兩個特征吸收峰變成了單峰，證明PtBMA-b-PDMAEMA 已完全水解為PMAA-b-PDMAEMA。

圖4 PtBMA、PtBMA-b-PDMAEMA和PMAA-b-PDMAEMA的紅外譜圖

綜上，核磁和紅外的譜圖結果證明了已成功合成均聚物和嵌段共聚物。

2.2 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的pH響應性

2.2.1 zeta電位法

采用zeta 電位法測定了4 種共聚物的等電點，研究了其pH響應性，結果如圖5所示。首先測定了均聚物PMAA的等電點，對比圖5(a)和(d)可以看出，PMAA的聚合度越大，等電點越低，這是因為較長的PMAA鏈含有更多的羧基基團，在酸性條件下能電離出更多的陰離子。對于共聚物PMAA-b-PDMAEMA，在酸性條件下，由于PDMAEMA 上叔胺基團的質子化，繼而與PMAA上的羧酸根離子發生電中和，PMAA鏈段呈疏水的電中性狀態，此時體系呈現出正電性；隨著溶液pH 的增大，PDMAEMA 鏈段逐漸去質子化，PMAA 鏈段開始電離，負電荷逐漸增多，在達到某一點時，體系所帶的正負電荷中和，zeta電位表現為0mV，此時溶液的pH 即為其等電點；繼續增大溶液pH，由于PMAA段的電離，體系的凈電荷整體由正值變為負值，體系呈現出電負性。對比圖5(a)～(c)和圖5(d)～(f)發現，在PMAA一端修飾PDMAEMA鏈段后，等電點整體會向堿性偏移，且偏移的大小會隨著PDMAEMA 鏈段長度的增加而增加[30]。以上結果表明，本文中合成的4種共聚物均具有良好的pH響應性，且其等電點的大小可根據PDMAEMA嵌段的聚合度及PMAA/PDMAEMA兩者的嵌段比來調節。

圖5 均聚物PMAA和共聚物PMAA-b-PDMAEMA水溶液在不同pH條件下的zeta電位變化

2.2.2 濁度法

采用濁度法進一步驗證了共聚物的pH響應性，結果如圖6 所示。當pH

圖6 不同嵌段比的PMAA-b-PDMAEMA水溶液在不同pH下的透過率曲線

2.3 共聚物PMAA-b-PDMAEMA的溫度響應性

2.3.1 溶液pH對相轉變溫度的影響

共聚物的溫敏性由PDMAEMA 嵌段決定，且PDMAEMA 具有pH/溫度雙重響應性。為了更好地了解共聚物的溫敏性以及影響溫敏性的因素，本文首先考察了PDMAEMA均聚物的溫敏性能，結果如圖7 所示。圖7 中當pH=3.0 時（pHpKa時，PDMAEMA 的透過率在達到臨界溫度后會隨著溫度的不斷升高而快速降低，溶液由澄清變渾濁，說明此時發生相變，這是由于在堿性介質中時，PDMAEMA上的叔胺基團去質子化呈中性狀態，隨著堿性增加，去質子化程度升高，氫鍵作用力減弱，疏水作用增強，出現LCST，展現出良好的溫敏性。圖7中展示了均聚物PDMAEMA的LCST與溶液pH的關系，即隨著溶液pH的增加，LCST逐漸降低，說明溶液的pH對聚合物的溫敏性有較大影響。以上結果證明，PDMAEMA具有良好的溫度可控性。

圖7 不同pH條件下PDMAEMA30的透過率隨溫度的變化曲線及溶液pH與LCST的關系

本文選擇在等電點附近（pH=8.5、9.5）和遠離等電點（pH=10.0）的pH 研究pH 對共聚物溫敏性的影響，基于PDMAEMA在堿性條件下才展現出溫敏性，因此選擇等電點在堿性的PMAA50-b-PDMAEMA43和PMAA30-b-PDMAEMA22兩種共聚物，研究其在不同pH 條件下透過率隨溫度的變化，結果如圖8所示。共聚物的溫敏性與其等電點密切相關，當溶液pH 在等電點附近時，共聚物溶液對溫度表現出較強的敏感性，在較低溫度下即可發生相變。但在等電點附近，兩個共聚物在pH=9.5 時的LCST值均低于pH=8.5時的LCST值（表2），這主要取決于PDMAEMA嵌段。本節中已明確PDMAEMA的LCST 是隨著堿性的增強而逐漸降低，所以pH=9.5 條件下的LCST 值均低于pH=8.5 條件下的LCST值。而在pH=10 條件下，由于溶液pH 遠離共聚物的等電點，其溫敏性變弱，在較高溫度下才顯現出相轉變行為，呈現出較高的LCST 值，此時兩種聚合物的LCST值遠高于pH=9.5和pH=8.5時的LCST，這點與上述提到的PDMAEMA 均聚物的LCST 值隨pH 增大而降低的性質不同。此外，對比均聚物和共聚物溫敏性發現，PDMAEMA在修飾PMAA嵌段后，由于其等電點會向酸性偏移，所以在相同pH條件下，共聚物的LCST 值要低于PDMAEMA 均聚物的LCST值。聚合物通過調節pH可改變其相轉變溫度，說明共聚物同時受pH/溫度雙重調控，該結果體現了PMAA-b-PDMAEMA 良好的溫度和pH 雙重響應特性。

表2 不同pH條件下共聚物的LCST值 單位：℃

圖8 不同pH條件下，共聚物PMAA-b-PDMAEMA的透過率隨溫度的變化

2.3.2 分子量對相轉變溫度的影響

大量研究證明，分子量的改變也可直接影響聚合物的相轉變行為。為了更好地分析共聚物的溫敏性，首先選擇三個具有不同分子量的均聚物PDMAEMA進行研究。圖9為pH=9.0條件下溶液透射率隨溫度的變化曲線。從圖中可看出，聚合物的LCST值會隨著其分子量的增加而降低。這是因為隨著PDMAEMA分子量增大，鏈段上所帶的叔胺基團數目增多，堿性條件下可去質子化形成疏水中性狀態的氨基增多，疏水締合強度增加，同時較長的鏈更易發生纏繞聚集，溫敏性增強，LCST值降低。因此，通過調節分子量可獲得具有特定LCST的聚合物。

圖9 pH=9.0時不同聚合度的PDMAEMA的透射率隨溫度的變化

為了進一步研究共聚物的分子量對溫敏性的調控作用，本文選取了PMAA30-b-PDMAEMA22和PMAA30-b-PDMAEMA6兩個共聚物，測定了其在pH=10.0條件下的透射率隨溫度的變化曲線，結果如圖10 所示。PMAA30-b-PDMAEMA22展現出良好的溫敏性，在39℃時透射率開始下降，在68℃時透射率下降至28.5%；PMAA30-b-PDMAEMA6的透射率在48℃時開始有所下降，隨著溫度的不斷升高，下降曲線較為平緩，68℃時透射率約為70%。此外， PMAA30-b-PDMAEMA22的LCST 值 遠 小 于PMAA30-b-PDMAEMA6，這是因為PDMAEMA 嵌段越長，疏水作用越強，溫敏性增強，LCST 值也越低。由于PMAA30-b-PDMAEMA6中對溫度敏感的PDMAEMA 嵌段較短，可形成的疏水分子鏈較少，所以即使在68℃的高溫下透射率仍然較高，這一點與上述PDMAEMA均聚物的溫敏性隨分子量變化的研究結果一致。

圖10 pH=10.0條件下不同嵌段比的PMAA-b-PDMAEMA透射率隨溫度的變化

2.4 共聚物PMAA-b-PDMAEMA 與模擬細胞膜的相互作用

基于共聚物PMAA-b-PDMAEMA在酸性條件下的正電性及疏水性，結合腫瘤病變部位的偏酸性環境，本文選擇PMAA30-b-PDMAEMA6作為研究對象，探究其作為抗腫瘤劑的功能。利用薄膜分散法制備了包載熒光分子羅丹明6G的DPPC和DPPG脂質體并分別模擬正常細胞膜及腫瘤細胞膜，通過測定共聚物PMAA30-b-PDMAEMA6與兩種模擬細胞膜分別在pH=7.4 和pH=5.0 條件下相互作用時，羅丹明6G的泄漏情況，探究該共聚物響應pH條件下對模擬腫瘤細胞結構的破壞性，進而明確其抗腫瘤潛能。結果如圖11(a)所示，對于呈現電中性的DPPC脂質體而言，無論是在pH=7.4生理條件下還是pH=5.5酸性條件下，共聚物與DPPC的靜電相互作用均較弱，所以羅丹明6G泄漏率幾乎相同且相對較少。對于模擬腫瘤細胞膜結構的DPPG 脂質體，在pH=5.5時，PMAA30-b-PDMAEMA6帶正電且具備一定的疏水性，其通過靜電吸附作用有效地靶向至DPPG脂質體表面，隨后再通過疏水作用插入膜中，破壞脂質體膜結構，造成膜內包裹的羅丹明6G 分子泄漏，1h內即達到了約80%的泄漏率，4h內幾乎達到平衡，最終泄漏率接近100%；而在pH=7.4時，共聚物帶負電，與DPPG產生靜電排斥作用，吸附到脂質體表面的共聚物較少，相互作用弱，最終的泄漏率較pH=5.5時低。

圖11 pH=7.4及pH=5.5條件下PMAA-b-PDMAEMA誘導的脂質體中羅丹明6G的泄漏率(a)及作用機理(b)

基于上述研究結果，將共聚物對模擬細胞膜的作用機理總結如圖11(b)所示，共聚物受周圍環境的刺激，在人體正常生理條件下與模擬正常細胞膜結合能力較弱，細胞膜結構完整；當到達病變的腫瘤區弱酸性環境時，電荷反轉，共聚物通過正電性和疏水性選擇性結合并插入到腫瘤細胞內部，破壞膜結構，引起膜內基質快速大量泄漏。

3 結論

本文利用ATRP 法成功合成了一系列具有pH/溫度雙重響應性的兩嵌段共聚物PMAA-b-PDMAEMA，共聚物的pH響應性可通過改變PMAA與PDMAEMA 的嵌段比來調控。溫敏性受溶液pH和分子量的影響，在等電點附近其溫敏性較強，且共聚物的LCST隨著溶液pH的增加而逐漸增大；此外，共聚物的LCST 值會隨著PDMAEMA 分子量的增加而降低。PMAA30-b-PDMAEMA6與模擬細胞膜的相互作用結果表明，共聚物能通過響應環境的變化靶向至模擬腫瘤細胞并實現對膜結構的破壞作用。綜上，本文所制備的PMAA-b-PDMAEMA 展現出良好的pH/溫度響應性能及功能可調控性，有望實現在生物醫藥上的應用。