MR mDxion-Quant技術評價早期糖尿病腎病大鼠腎臟脂質沉積的實驗研究*

程金梅 潘健 羅煒蕭 周海鷹

(川北醫學院附屬醫院1.放射科;2.全科醫學科,四川 南充 637000)

近年來,隨著人們物質條件的好轉及飲食習慣的改變,2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)發病率逐年上升[1]。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)作為T2DM患者常見的微血管并發癥之一,已成為導致終末期腎病的主要原因[2]。但DN的發病機制較為復雜,目前尚未明了。不少學者[3-4]認為脂代謝紊亂在DN的發生和發展中起著重要作用,增多的TG 和TC 沉積于腎臟并影響腎功能,導致腎小球硬化。因此,準確評估腎臟脂肪含量并判斷其嚴重程度對指導DN治療、延緩DN發展及提高T2DM患者的預后具有重要意義。病理活檢是評估臟器脂肪含量的金標準,但因其有創、受操作者取材影響且不能反映臟器全貌,不能作為臨床診斷和隨訪的最佳選擇。磁共振脂肪定量技術因其無輻射、多參數及可重復性等優點已越來越多地應用于科研及臨床工作中,但目前應用該技術評估DN腎臟脂肪含量的文獻報道較少。因此,本研究擬運用MR mDxion-Quant技術無創性評估早期DN大鼠腎臟脂質沉積,并與病理金標準進行對照,分析其與血脂水平、T2DM病程的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本研究經川北醫學院動物倫理委員會批準(NSMC倫理動物審[2021]99號)。采用6周齡健康清潔級(SPF級)雄性SD大鼠70只(川北醫學院動物實驗中心提供),體重160 g左右。

1.1.2 實驗試劑 鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)購自美國Sigma公司。檸檬酸鈉緩沖液購自中國Solarbio公司。血脂試劑盒購自高新技術產業開發區高瑞生物試劑銷售中心。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及T2DM模型構建 大鼠適應性喂養3 d后,選取血糖、尿微量白蛋白陰性者列入實驗對象(n=70),并隨機分為對照組(n=20)和實驗組(n=50)。實驗組采用高脂飲食配合小劑量STZ建立T2DM模型。即給予高脂飼料喂養6周,禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg,72 h后采尾部血測血糖,以隨機血糖≥16.7 mmol/L為成模標準。排除T2DM模型構建不成功的大鼠18只,將T2DM模型構建成功者32只繼續喂養4～16周,依其自然病程發展成DN模型。對照組采用普通喂養,一次性腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液35 mg/kg。T2DM模型構建成功后,將實驗組(n=32)、對照組(n=20)大鼠隨機分為4個亞組,每組13只(實驗組8只,對照組5只),分別于T2DM模型建立成功后第4、8、12、16周末,隨機選擇1個亞組進行腎臟MRI掃描、實驗室檢查及病理學檢查。在T2DM模型構建成功后繼續喂養的過程中,實驗組大鼠共死亡15只,余下17只納入研究;對照組共死亡5只,余下15只納入研究。最后,根據病理結果將實驗組中病理分級為Ⅰ、Ⅱ級的大鼠納入早期DN組(n=15),將對照組中腎臟未見異常的大鼠納入正常對照組(n=13)。

1.2.2 MRI檢查方法及數據處理 分別于T2DM模型建立成功后第4、8、12、16周末,隨機選擇1個亞組進行腎臟MRI掃描。采用聯影3.0T磁共振掃描儀(uMR790),大鼠線圈。在MRI檢查前,所有大鼠禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉(2%,2.3 ml/kg)進行麻醉。取俯臥位頭先進方式,腹部近腎臟部位緊貼線圈中心,行腎臟冠狀位掃描。T2加權成像(T2WI)采用快速自旋回波序列,成像參數為:TR=4815.5 ms,TE=96 ms,翻轉角90°,層厚2.0 mm,FOV 120×120 mm,矩陣325×384。 mDxion-Quant序列成像參數為:TR=21.1 ms,TE=1.45、3.06、4.67、6.28、7.89、9.5 ms,激勵次數 4,翻轉角4°,層厚1.3 mm,FOV 90×146 mm,矩陣102×208。將所得圖像傳入聯影后處理工作站,自動生成腎臟脂肪分數 (Fat fraction, FF) 圖。由2名觀察者(觀察者分別具有2年、12年腹部MRI診斷經驗)參考T2WI圖像,選取腎門平面FF圖,分別在雙腎實質上份、中份及下份勾畫感興趣區(Region of interest,ROI)[5]。勾畫 ROI 時,避開腎竇脂肪組織及偽影,系統自動生成所畫區域的FF值(見圖1)。每個部位測量3次,取平均值作為腎臟FF值。1個月后,觀察者1以同樣的方法再一次測量腎臟FF值。

圖1 早期DN組大鼠腎臟MRI圖像Figure 1 Coronal T2-weighted image and fat fraction image of the kidneys in early-stage diabetic nephropathy group注:A.冠狀位T2WI(腎門平面);B.冠狀位脂肪分數圖,圓圈所示從上到下依次為左腎上份、中份及下份ROI放置位置(腎門平面,白箭示左腎門),右腎ROI的分布與左腎類似。

1.2.3 實驗室檢查及病理學檢查 MRI掃描結束后,在麻醉狀態下解剖大鼠,取大鼠中心靜脈血檢測血TG、TC、LDL、HDL的含量。取出大鼠腎臟組織進行HE、PAS及油紅O染色(見圖2)。根據腎小球形態學改變進行病理分級,Ⅰ、Ⅱ級即為早期DN[6]。觀察腎組織有無脂肪染色及染色的部位,用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對油紅O染色圖片進行分析,計算腎臟細胞內脂滴累計光密度值/細胞總面積值(Integrated optical density/ total area of all the cells,IOD/TAC)。

圖2 大鼠腎組織油紅O染色(200×)Figure 2 Oil red O staining of renal tissue注:A.正常對照組;B.早期DN組。脂質(黑箭示紅色顆粒)主要沉積于腎小管上皮細胞,數量明顯多于對照組。

2 結果

2.1 基本資料 實驗組(n=17)大鼠腎臟HE及PAS染色結果顯示,腎小球基底膜增厚、系膜增生,病理分級Ⅰ級3只、Ⅱ級14只,為早期DN。排除2只MRI圖像質量不佳者后,共15只大鼠納入早期DN組;對照組(n=15)大鼠腎臟HE及PAS染色均未見異常,排除2只MRI圖像質量不佳者后,共13只大鼠納入正常對照組。

2.2 觀察者內及觀察者間測量腎臟FF值的一致性 2名觀察者對納入研究的28只大鼠左腎及右腎FF值測量(見表1)。一致性分析結果顯示,觀察者內及觀察者間一致性良好(ICC均>0.9),采用觀察者1和觀察者2三次測量數據的平均值進行后續檢驗。

表1 觀察者內及觀察者間一致性分析Table 1 Intra-observer and inter-observer concordance analysis

2.3 早期DN組與正常對照組大鼠血脂水平及腎組織脂肪染色結果 與正常對照組比較,早期DN組大鼠TC、TG、LDL含量升高,HDL含量降低(P均<0.001)。據圖2腎組織脂肪染色顯示,早期DN組大鼠腎組織脂質沉積增多,主要位于腎小管上皮細胞,腎臟細胞內脂滴IOD/TAC大于正常對照組(P<0.001),且與糖尿病病程呈正相關(r=0.97,P<0.001)。見表2。

表2 正常對照組與早期DN組大鼠血脂水平及細胞內脂滴IOD/TAC 比較[M(P25,P75)]Table 2 Comparison of blood lipid parameters and IOD/TAC between control and early-stage DN groups

2.4 早期DN組及正常對照組大鼠腎臟FF值之間的比較 早期DN組及正常對照組大鼠左側腎臟FF值與右側腎臟FF值之間的差異均無統計學意義(P>0.05),故取右腎FF值進行后續檢驗。與正常對照組比較,早期DN組大鼠腎臟FF值升高(Z=-4.26,P<0.001)。見表3。

表3 正常對照組與早期DN組大鼠雙側腎臟FF值Table 3 Comparison of bilateral renal FF values between control and early-stage DN groups

2.5 早期DN組大鼠腎臟FF值與腎組織脂肪染色結果、血脂水平及糖尿病病程之間的相關性 早期DN組大鼠腎臟FF值與腎臟細胞內脂滴IOD/TAC、TC、TG、LDL含量及糖尿病病程均呈正相關(r分別為0.85、0.66、0.71、0.76、0.85)(均P<0.01),與HDL含量呈負相關(r=-0.71)(P<0.01),見表4。

表4 早期DN組大鼠腎臟FF值與各指標之間的相關性Table 4 Correlations between renal FF and the IOD/TAC, blood lipid parameters, and the progression of diabetes in early-stage DN group

3 討論

脂毒性與DN發展密切相關,大量臨床研究和動物實驗[7-10]已證實DN常伴有脂代謝紊亂,包括高脂血癥與脂質異位沉積。但脂代謝紊亂導致DN的發病機制較為復雜,目前尚未完全闡明。有研究[11-12]提示,脂代謝紊亂既可通過破壞腎臟正常脂質代謝直接損傷腎臟,也可通過全身炎癥、氧化應激、血管損傷以及激素和其它信號分子的變化,間接影響腎臟功能。調節脂代謝紊亂對延緩DN的發生、發展具有重要意義。目前降血脂治療已成為DN綜合治療中的重要組成部分,但效果仍存在爭議。學者們越來越關注改善腎臟脂質沉積對于DN發生、發展的意義。調節腎臟脂質沉積有望成為治療DN的潛在靶點[11]。

隨著磁共振技術的不斷發展,氫質子MR波譜(1H-magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)和基于化學位移的水脂分離技術等磁共振脂肪定量技術越來越多地應用于臨床及科研工作中。相較于1H-MRS及病理學穿刺活檢,MR mDxion-Quant技術具有無創、能反映臟器全貌、克服了磁場不均勻性、消除了組織T2*效應[13]等優點,目前已廣泛應用于評價脂肪肝藥物治療的療效、量化分析肝內鐵沉積以及椎體骨髓脂肪含量的研究,并取得了較好的效果[14-17]。但國內外對于腎臟脂肪含量的研究較少,運用該技術無創性定量評估早期DN腎臟脂質沉積,并與腎組織脂肪染色結果進行對照,分析其與血脂水平相關性的研究更少。

本研究運用mDxion-Quant技術活體無創性量化早期DN大鼠腎臟的脂肪含量,并與病理金標準相對照,結果顯示,早期DN組大鼠腎臟FF值與腎組織脂肪染色所得結果-細胞內脂滴IOD/TAC值呈高度正相關,證實了該技術無創性活體定量評估腎臟脂質沉積的準確性,肯定了其在腎臟這種脂肪含量極少的小器官中的應用價值,為揭示DN患者腎臟脂代謝紊亂的發生、發展以及未來相關臨床藥物治療效果的評估提供了無創、便捷、有效、動態的檢測手段。同時,本研究結果提示腎臟脂質沉積與DN的發生發展有著密切的關系,且隨著糖尿病病程延長、血脂升高,持續高血糖、高血脂可促進脂肪酸合成和TG積累,大量游離脂肪酸通過酯化作用轉化為TG,沉積于腎臟組織,導致腎臟脂質含量不斷增加。沉積在腎臟的脂質可能通過促進線粒體損傷和組織炎癥等機制損害各種細胞,包括足細胞、近端腎小管上皮細胞和腎小管間質組織,從而導致腎小球和腎小管病變,引發和/或加重DN[18-19]。

Yokoo等[20]運用Dixon技術測量29例T2DM患者與40例非T2DM患者的腎臟FF,結果顯示T2DM患者的腎臟脂肪含量高于非T2DM患者,這提示T2DM患者發生腎臟脂肪沉積的風險增加,與本研究結果部分相似。但該研究缺乏腎臟病理學檢查這一金標準作為對照,且未進一步研究腎臟脂質沉積與DN的關系;此外,該研究對照組所納入的非糖尿病患者并非健康志愿者,而是腎臟或胰腺惡性腫瘤患者,這些惡性腫瘤對腎臟本身脂肪含量有無影響尚不明確。在此研究之后,Wang等[21]應用Dixon技術測量61例T2DM患者(其中包括40例正常白蛋白尿和21例微量白蛋白尿)和34例非T2DM志愿者腎臟FF,結果顯示微量白蛋白尿組的FF值顯著高于正常白蛋白尿組和對照組,該結果表明Dixon技術所測腎臟FF對T2DM患者的早期腎損害具有提示意義,與本研究結果基本一致,但同樣缺乏金標準對照。

本研究實驗組僅納入早期DN大鼠,增加中晚期DN大鼠能更好地反映DN不同時期腎臟脂質沉積情況。其次,在本研究中,早期DN組納入大鼠腎臟病理分級包括Ⅰ級和Ⅱ級,但Ⅰ級樣本量較小,僅3只,故未分析腎臟FF值與腎臟病理分級之間的相關性;最后,采用人工放置ROI的方法對FF值進行測量,可能存在選擇偏倚和操作誤差,但本研究采用同一區域重復測量三次取平均值的方法盡量減少這種誤差。

4 結論

MR mDxion-Quant技術可無創性定量評估早期DN大鼠腎臟脂質沉積。與對照組比較,早期DN大鼠腎臟脂肪含量增加,且與糖尿病病程、血TC、TG、LDL水平呈正相關,與HDL水平呈負相關。