EGCG調節TLR4/MyD88/NF-κB信號通路對特應性皮炎大鼠Th1/Th2平衡的影響

林建紅 陳海軍 朱思頤

(邵陽學院附屬第一醫院1.皮膚科;2.兒科;3.檢驗科,湖南 邵陽 422001)

特應性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是一種慢性復發性皮膚病,伴有過敏性炎癥[1]。據報道[2],AD中存在以Th2為主的急性期和以Th1為主的慢性期的雙相T細胞應答。Th1和Th2細胞是兩個功能不同的細胞亞群,它們分泌不同的效應細胞因子。然而,這些因素在AD發病機制中的相對作用仍有待闡明。

雖然類固醇是常用的治療AD的主要藥物,但由于潛在的副作用,如皮膚萎縮、快速反應和停止治療后的癥狀性反彈,不鼓勵長期使用[3-4]。在臨床研究[5]中,中醫藥已被證明是預防和治療炎癥性皮膚病的潛在治療劑來源。一項針對皮膚病的系統研究[6]結果表明,中草藥可以緩解AD,并且不會引起嚴重的不良反應。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是茶葉中含量最多的兒茶素。EGCG具有抗炎、抗氧化等諸多活性,并已被應用于治療炎癥性疾病、皮膚病和感染性疾病[7-8]。Chiu等[9]已證實EGCG是治療AD的潛在治療劑。然而關于EGCG對AD的作用機制的報道相對較少。本研究評估了EGCG對2,4二硝基氯苯(Dinitrochlorobenzene,DNCB)誘導的AD動物模型的影響,EGCG的抗炎和抗過敏特性是在DNCB誘導的AD模型中確定的,該模型旨在彌補AD治療中使用類固醇的缺點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 90只6～7周齡的SPF級SD大鼠(體重160～200 g)獲自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司,生產證書編號SCXK(京)2020-0007。將動物養在本研究動物房[溫度為(23±2) ℃,濕度為50%±10%,12 h明暗循環],提供標準食物和水。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 EGCG(E4143,純度≥95%)、DNCB(237329,純度≥99%)、地塞米松(Dexamethasone,DXM)(D1756,HPLC≥98%)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)激動劑LPS(來自大腸桿菌O55:B5,L2880)、PMA(P1585,HPLC≥99%)、ionomycin (I0634,HPLC≥98%)、Brefeldin A(來自布雷正青霉菌,B5936)均獲自美國Sigma;HE染色試劑盒(G1120)、大鼠白介素-2(IL-2)ELISA KIT(SEKR-0003)、白介素-4(IL-4)ELISA KIT(SEKR-0004)、白介素-13(IL-13)ELISA KIT(SEKR-0046)和干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)ELISA KIT(SEKR-0008)、ECL發光液(PE0020)獲自北京Solarbio;Fixation/permeabilization(555028)獲自美國Biosciences;鼠單克隆FITC-anti-CD4(ab59474)、兔單克隆APC-anti-IFN-γ(ab275700)和鼠單克隆PE-Anti-IL-4(ab95717)、兔多克隆TLR4(ab13556)、兔多克隆髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88,ab2064)、兔多克隆核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB,ab16502)、兔多克隆GAPDH(ab9485)均獲自英國Abcam。DMi8-熒光顯微鏡(德國徠卡)、SpectraMax Mini酶標儀(上海美谷分子)、ImagerQuant 300凝膠成像系統(美國GE)。

1.3 方法

1.3.1 AD模型構建及分組處理 將DNCB溶解在丙酮/橄欖油(3∶1)中,以應用于大鼠。按照研究進行AD大鼠模型構建[10]。造模前先去除部分(約8 cm2)大鼠背部毛發。使用100 μL的7% DNCB涂抹大鼠背側剃毛的皮膚上使動物致敏3 d。一周后將200 μL的0.7% DNCB涂在同一位置進行攻擊,每周一次,持續6周。大鼠背部出現糜爛、紅斑和水腫等現象即為造模成功。同時選擇18只作為對照(Control)組,按照AD模型方法涂抹等量的橄欖油/丙酮溶劑。將AD造模成功的大鼠分為AD模型(AD)組(給予等量的生理鹽水)、AD+EGCG治療(EGCG)組(50 mg/kg)[11]、AD+DXM陽性對照(DXM)組(2.5 mg/kg)[12]、AD+EGCG+TLR4激動劑(TLR4)組(0.5 mg/kg)[13],每組18只,而Control組以相同的方式給予等量的生理鹽水。各組大鼠通過灌胃給予處理,每天一次,連續2周。實驗結束時,根據大鼠背部皮膚的損傷嚴重程度計算臨床評分,評分后進行取血,最后處死大鼠并將18只分別進行組織學分析、流式細胞術檢測、Western blot檢測(各6只)。

1.3.2 大鼠背部皮膚損傷的嚴重程度評分[12]處死前給大鼠拍照,根據大鼠背部皮膚的損傷嚴重程度計算臨床評分。臨床評分基于紅斑、水腫、結痂、脫屑和苔蘚化癥狀的嚴重程度(0,無癥狀;1,輕度;2,中度;3,重度)。根據照片評估每個大鼠的皮膚損傷嚴重程度。

1.3.3 ELISA檢測各組大鼠血清中炎癥因子表達情況 在對每只大鼠損傷評分后將大鼠麻醉,從眼靜脈叢中抽取血液,并以2000 rpm的速度離心血液10 min,以收集用于ELISA測定的血清。分別通過對應的試劑盒檢測血清中IL-2、IL-4、IL-13和IFN-水平。

1.3.4 組織學分析 采血后處死大鼠,然后收集大鼠皮膚(n=6),并將其儲存在-80 ℃用于進一步分析。將收集的大鼠背部組織(n=6)固定在福爾馬林中,通過梯度乙醇脫水后制備成6 μm的切片。干燥后將切片脫蠟、復水后分別經蘇木精和伊紅染色10 min,封片后通過光學顯微鏡(日本尼康)在200倍的放大率來觀察病理學特征。并對病理學的損傷程度進行評分。通過炎性細胞浸潤程度進行評分[12]:無浸潤(0分);0%～25%浸潤(1分);25%～50%浸潤(2分);50%～75%浸潤(3分);75%～100%浸潤(4分)。

1.3.5 流式細胞術檢測[2]從大鼠背部組織(n=6)分離單個核細胞,計數后將細胞在5% CO2培養箱中于37 ℃中培養24 h。使用PMA(100 mg/L)、ionomycin(1 mg/L)和Brefeldin A(10 mg/L)處理細胞4 h,隨后將細胞置于EP管中,與FITC-anti-CD4室溫避光30 min,用細胞染色緩沖液洗滌后與500 μL fixation/permeabilization溶液混合,避光45 min。用1× BD perm/wash buffer洗滌后,將細胞與PE-anti-IL-4和APC-anti-IFN-γ在室溫中避光45 min,再次使用1× BD perm/wash buffer洗滌,通過300 μL flow buffer重懸。最后使用流式細胞儀和FlowJo軟件進行分析。根據FITC-CD4熒光測定Th1(IFN-γ+CD4+)和Th2(IL-4+CD4+)細胞百分比。

1.3.6 Western blot檢測 從大鼠背部組織中提取總蛋白。經電泳轉移到PVDF膜上,封閉液將膜封閉2 h后與一抗TLR4、MyD88、NF-κB、GAPDH在4℃下孵育過夜。然而與二抗孵育2 h。將膜洗滌后,通過ECL對膜進行可視化。使用凝膠成像系統和Quantity One軟件獲得蛋白相對表達。

2 結果

2.1 EGCG減輕AD大鼠的特應性病變的嚴重程度 為了在動物模型中研究EGCG對AD的影響,用DNCB過敏源使SD大鼠的背部皮膚敏感,成功誘導AD的臨床特征,如干燥、糜爛、紅斑和水腫等。EGCG和DXM治療明顯改善了AD大鼠皮膚損傷中的這些表型。通過對各組皮膚損傷程度進行評分顯示,與Control組(0分)比較,AD組(5.67±0.54)大鼠皮膚損傷評分明顯升高(P<0.05);與AD組比較,DXM組(2.64±0.20)和EGCG組(2.80±0.18)大鼠皮膚損傷評分明顯降低(P<0.05);與EGCG組比較,DXM組大鼠皮膚損傷評分變化差異無統計學意義(P>0.05),TLR4組(4.02±0.45)大鼠皮膚損傷評分升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠背部皮膚損傷代表性圖片Figure 1 Representative images of back skin damage in each group of rats注:A.Control組; B.AD組; C.EGCG組; D.DXM組; E.TLR4組。

2.2 EGCG抑制AD大鼠的炎癥反應 與Control組比較,AD組大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平下調,IL-4和IL-13水平上調(均P<0.05);與AD組比較,EGCG組和DXM組大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平上調,IL-4和IL-13水平下調(均P<0.05);與EGCG組比較,DXM組大鼠血清中IL-2、IL-4和IL-13、IFN-γ水平變化差異無統計學意義(P>0.05),TLR4組大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平下調,IL-4和IL-13水平上調(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-13和IFN-γ水平檢測Table 1 Detection of serum levels of IL-2, IL-4, IL-13 and IFN-γ in each group of rats

2.3 EGCG減少AD大鼠皮損組織病理學特征 HE染色結果顯示,AD組大鼠較Control組大鼠表皮、真皮明顯增厚,同時炎癥細胞向皮膚組織的浸潤增多,EGCG和DXM治療顯著較少了AD大鼠的這些病理學特征(見圖2)。與Control組(0分)比較,AD組(2.65±0.19)大鼠皮膚損傷的病理學評分明顯升高(P<0.05);與AD組比較,DXM組(1.18±0.13)和EGCG組(1.27±0.12)大鼠皮膚損傷的病理學評分明顯降低(P<0.05);與EGCG組比較,DXM組大鼠皮膚損傷的病理學評分變化差異無統計學意義(P>0.05),TLR4組(1.98±0.14)大鼠皮膚損傷的病理學評分升高(P<0.05)。

圖2 HE染色評估各組大鼠背部皮膚的病理學變化(200×)Figure 2 HE staining evaluation of pathological changes in the back skin of rats in each group 注:箭頭所示為炎性浸潤部分。A. Control組; B. AD組; C. EGCG組; D. DXM組; E. TLR4組。

2.4 EGCG改善AD大鼠的Th1/Th2平衡 為了確定EGCG可以改善Th1/Th2平衡,流式細胞術用于分析大鼠皮損組織中的Th1細胞和Th2細胞(見圖3)。與Control組比較,AD組大鼠皮損組織中Th1細胞百分比降低,Th2陽性細胞百分比升高(均P<0.05)。與AD組比較,EGCG組和DXM組大鼠皮損組織中Th1細胞百分比升高,Th2陽性細胞百分比降低(均P<0.05)。與EGCG組比較,DXM組大鼠皮損組織中Th1、Th2細胞百分比變化差異均無統計學意義(P>0.05),TLR4組大鼠皮損組織中Th1細胞百分比降低,Th2陽性細胞百分比升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠皮損組織中Th1和Th2陽性細胞百分比Table 2 Percentage of Th1 and Th2 positive cells in skin lesions of rats in each group

圖3 流式細胞儀檢測各組大鼠皮損組織中Th1和Th2細胞表達Figure 3 Flow cytometry detection of Th1 and Th2 cell expression in skin lesions of rats in each group

2.5 EGCG降低AD大鼠皮損組織中的TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白 與Control組比較,AD組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平上調(P<0.05)。與AD組比較,EGCG組和DXM組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平下調(P<0.05)。與EGCG組比較,DXM組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平變化無統計學意義(P>0.05);TLR4組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平上調(P<0.05)。見圖4、表3。

表3 各組大鼠皮損組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達Table 3 Expression of TLR4, MyD88 and NF-κB protein in skin lesions of rats in each group

圖4 Western blot檢測各組大鼠皮損組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達Figure 4 Western blot analysis of TLR4, MyD88, NF-κB protein expression in rat skin lesions

3 討論

AD是最常見的復發性炎癥性皮膚病之一,其特點是Th1/Th2失衡[2]。隨著社會工業化進展,AD的發病率在不斷上升,但其發病機制仍不清楚[14]。其中,皮膚屏障的缺陷和免疫功能的障礙可能是AD發生的兩個主要因素[15]。本研究通過在大鼠背部使用DNCB,在一個半月內誘發了AD樣皮膚損傷,結果顯示,AD模型大鼠皮損組織中表皮、真皮明顯增厚,炎癥細胞向皮膚組織的浸潤增多,表明皮膚損傷增加。此外,Th1/Th2失衡與腫瘤免疫逃逸、微生物感染(細菌和病毒等)有關,也與過敏性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反應有關,并在介導AD發展中發揮重要作用[16]。本研究結果還發現皮損組織中Th1細胞百分比降低,Th2陽性細胞百分比升高。以上數據提示AD模型構建成功且Th1/Th2平衡被破壞,表現為Th2細胞占優勢。

EGCG是綠茶中的一種活性兒茶素,具有抗炎、抗癌、免疫調節等多種生物學功能,能夠對發炎的皮膚提供抗氧化、抗炎和免疫調節作用,以改善AD癥狀[9]。Yang等[17]研究發現,EGCG治療通過減輕組織損傷、炎癥、粘液產生、膠原沉積以及M2巨噬細胞的浸潤,從而對室內塵螨誘導的過敏性哮喘具有保護作用。Bing等[18]研究表明,EGCG在葡聚糖硫酸鈉誘導的大鼠潰瘍性結腸炎中通過抑制Th1細胞因子表達和誘導Th2細胞因子表達,從而具有抗炎和調節免疫功能的作用。與本研究結果不一致,推測其可能的原因是葡聚糖硫酸鈉誘導潰瘍性結腸炎和DNCB誘導的AD的發展過程并非由相同的細胞因子發揮功能所致。因此,EGCG對Th1和Th2細胞因子的調節作用在不同疾病中并不相同。據報道,AD是急性特應性濕疹中以Th2為主的炎癥性疾病,隨后在慢性階段表現為Th1積累[2]。其中,在IFN-γ和IL-2誘導下,CD4+T細胞分化為Th1細胞并介導細胞免疫;在IL-4誘導下,CD4+T細胞分化為Th2細胞,分泌IL-4等細胞因子以激活B細胞,并介導體液免疫和超敏反應[19]。Aierken等[10]證明,背側AD樣皮損急性期Th2細胞因子IL-4和IL-13水平顯著高于正常皮膚組織。本研究也觀察到同樣趨勢,且EGCG可以明顯抑制AD大鼠的臨床表現和病理學特征;增加Th1細胞百分比和IL-2、IFN-(水平,降低Th2細胞百分比和IL-4、IL-13水平。以上數據證實,EGCG可通過維持Th1/Th2平衡減緩AD大鼠皮膚炎癥性損傷,但其具體機制還需探討。

TLR是先天免疫識別受體的重要組成部分,在微生物鑒定中發揮著重要作用。TLR通過識別微生物(脂多糖、脂蛋白和遺傳物質核酸等)激活先天免疫反應進而釋放細胞因子、上調共刺激分子的表達,最終為獲得性免疫反應提供激活信號[20]。TLR4是TLR的重要成分,可通過靶向MyD88激活NF-κB促炎信號通路,促使效應細胞分泌細胞因子,在炎癥反應中發揮重要作用[21]。據報道[22],川芎嗪納米?？赏ㄟ^抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路,調節下游細胞因子的表達,維持Th1/Th2平衡有效防止術后炎癥反應觸發的宮腔粘連形成。此外,EGCG通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路維持Th1/Th2平衡并抑制結腸組織中的免疫炎癥反應[17]。本研究結果表明,EGCG能顯著下調TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平,提示EGCG可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕AD大鼠的炎癥反應,進而維持Th1/Th2平衡減輕皮膚損傷。此外,Aierken等[10]通過抑制NF-κB/TLR4信號通路,部分改善Th1/Th2免疫反應,進而對AD具有抑制作用,與本研究結果一致。為了進一步驗證EGCG與TLR4/MyD88/NF-κB通路之間的關系,引入了TLR4激動劑進行處理,結果表明TLR4激動劑處理后可部分逆轉EGCG對AD大鼠的影響,表明EGCG通過維持Th1/Th2平衡對AD大鼠的保護作用,與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路激活有關。

4 結論與展望

EGCG可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路維持Th1/Th2平衡,進而抑制AD大鼠皮損組織的免疫反應,減輕皮損的嚴重程度。這為臨床開發AD的靶向治療提供了理論基礎。然而,EGCG雖然有很多好處,但由于生物利用度低、不穩定,目前主要用于細胞和動物研究,臨床研究較少。因此,提高EGCG的生物利用度,轉向臨床研究也將是未來研究的重點。