基于數據庫挖掘分析PDZK1與乳腺癌氟維司群耐藥的相關性*

王雪凱 張博雅 李星宇 陳桂來 尹立 向卓 王強,

(1.中國海洋大學醫藥學院,山東 青島 266000;2.山東省第二人民醫院腫瘤內科,山東 濟南 250000)

內分泌治療主要通過抑制雌激素的生成或雌激素受體陽性的功能發揮作用,是雌激素受體陽性(Estrogen receptor positive,ER+)乳腺癌患者主要的治療方法之一[1]。其中以氟維司群(Fulvestrant)為代表的選擇性雌激素受體下調劑,具有阻斷和降解雌激素受體α(Estrogen receptor α,ERα)的功效。氟維司群的主要作用機制是通過藥物分子的長側鏈阻止ERα蛋白H12的閉合,導致受體疏水表面暴露,誘導ERα通過泛素-蛋白酶體系統降解[2-3]。常用于ERα突變導致的他莫昔芬或芳香化酶抑制劑耐藥的二線治療。兩項III期臨床試驗[4-5]的數據表明氟維司群對他莫昔芬耐藥的晚期乳腺癌患者與阿那曲唑具有相同功效。其在2017年被歐盟委員會(European Commission)批準用于未接受過內分泌治療的ER+局部晚期或轉移性乳腺癌絕經后婦女的一線療法。但伴隨患者長期的藥物治療,ER配體的非依賴性激活,細胞周期調節蛋白異常表達或miRNA的上調等途徑限制了氟維司群治療獲益[6-9]。因此,探索誘導氟維司群耐藥機理對臨床治療具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 qPCR預混液(上海翌圣生物科技股份有限公司,中國);DMEM高糖培養基(Gibco公司,美國);FBS特級胎牛血清(BI公司,以色列);無酚紅培養基(武漢普諾賽生命科技有限公司,中國);碳吸附胎牛血清(BI公司,以色列);BCA蛋白定量試劑盒(上海雅酶生物醫藥科技有限公司,中國);ECL基礎型化學發光檢測試劑盒(上海雅酶生物醫藥科技有限公司,中國);硝酸纖維素膜(Pall公司,美國);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司,中國);β-actin抗體(Sigma公司,美國);PDZ結構域蛋白1(PDZ domain containing 1,PDZK1)抗體(Santa公司,美國);PDZK1慢病毒質粒(上海漢恒生物科技有限公司,中國);氟維司群(MCE公司,美國);雌二醇(Selleck公司,美國);96孔板(Corning公司,美國)。

1.2 儀器與設備 低溫高速離心機(Eppendorf公司,德國);熒光定量PCR(Eppendorf公司,德國);垂直電泳系統(北京六一生物科技有限公司,中國);轉印電泳儀(北京六一生物科技有限公司,中國);二氧化碳培養箱(Thermo公司,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 文章研究流程 從GEO數據庫中篩選到兩組氟維司群耐藥數據集,獲得與氟維司群耐藥相關的差異基因,通過STRING繪制差異基因的蛋白網絡互作圖(PPI),提取關鍵的差異基因。在TCGA數據庫中分析排名第一的關鍵基因PDZK1的表達意義。最終通過體外細胞實驗驗證PDZK1的表達是否影響氟維司群的治療效果,并在Kaplan-Meier Plotter臨床數據庫中分析PDZK1的表達與臨床預后的相關性。

1.3.2 原始數據的獲取與處理 從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中獲取耐藥數據集(GSE74391與GSE14986),親代細胞均為MCF-7細胞,氟維司群耐藥系至少用藥物長期處理6個月。通過GEO在線工具獲取兩組耐藥數據集的差異基因(|Log2FC|>1, FDR<0.05),韋恩圖獲取差異基因交集(|Log2FC|>2, FDR<0.05)。TCGA乳腺癌的基因表達矩陣與臨床數據來自TCGA數據庫官網(https://portal.gdc.cancer.gov/),根據乳腺癌分子分型,提取數據庫中ER+患者數據集,并根據PDZK1表達中間值分為高低表達組進行分析。

1.3.3 蛋白PPI網絡分析 差異基因導入至STRING網站(http://string-db.org),繪制差異基因的蛋白互作網絡圖(交互置信度≥0.400),并刪去獨立的蛋白節點。將數據導入Cytoscape 軟件進行可視化處理,Cytohubba插件對蛋白網絡進行打分,排名前5名的基因被視作關鍵的節點基因。

1.3.4 功能富集分析 “clusterProfilerR”包用于(Gene ontology, GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Geno-mes, KEGG)功能富集分析(q<0.05)?！癱lusterProfilerR”與“org.Hs.eg.db”包用于基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA),GO功能注釋分別在生物過程(Biological process)、細胞組分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)展示了排名前10的通路名稱,KEGG與GSEA分別展示了排名前30與排名前5的通路名稱。

1.3.5 臨床數據分析 Kaplan-Meier Plotter在線網站獲取乳腺癌基因芯片數據(http://kmplot.com/analysis/index.phpp=background),并將患者范圍設定為經過內分泌治療的ER+群體,分析PDZK1與患者總生存期(Overall survival,OS)、無復發生存期(Recurrence-Free survival,RFS)和遠處無轉移生存期(Distant metastasis-free survival,DMFS)的相關性。

1.3.6 細胞培養與增殖實驗 MCF-7用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養,所有細胞均置于37 ℃、5% CO2濃度的培養箱中培養,通過顯微鏡觀察細胞生長情況(細胞密度和細胞狀態),兩天傳代一次。細胞增殖實驗,細胞置于無酚紅含10%胎牛血清與1 nM雌二醇的DMEM中培養3 d,按照3000個每孔均勻鋪至96孔板。待細胞貼壁,加入無酚紅含10%胎牛血清與1 nM雌二醇的DMEM以及不同濃度的氟維司群,每組設置5個復孔作為平行實驗,每兩天換液一次。第5 d每孔加10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育60 min, 450 nm波長下測量吸光度值。

1.3.7 實時熒光定量PCR 收集細胞樣品,Trizol法提取細胞總RNA,測量mRNA濃度,反轉錄合成cDNA,加入qPCR預混液配制10 μL定量體系,檢測PDZK1的mRNA表達量。引物序列如下:GAPDH上游5-GTCTCCTC-TGACTTCAACAGCG-3,下游5-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3;PDZ-K1上游5-AAGGTGTGGCTATGAGAGCTGG-3,下游5-CAGCAGGAACAT-GACACGGCTT-3。

1.3.8 蛋白質免疫印跡 收集細胞樣品,加入RIPA裂解緩沖液,4 ℃, 12 000 rpm離心10 min,收集上清,BCA法測定蛋白濃度。制備10%, SDS-PAGE凝膠,上樣電泳分離,轉膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,TBST洗膜三次,一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜三次,加入相對應二抗,室溫繼續孵育1 h,TBST洗膜,ECL顯色。

2 結果

2.1 獲取耐藥數據集的關鍵基因 GEO數據庫上篩選氟維司群耐藥數據集GSE74391與GSE14986,利用GEO在線工具分析氟維司群敏感型MCF-7與耐藥型MCF-7的差異基因,火山圖展示差異基因(見圖1A～B)。韋恩圖分析差異基因存在14個上調和23個下調的重合基因(見圖1C)。GO生物學功能數據分析顯示性激素的合成或調控與氟維司群耐藥相關(見圖1D)。在STRING網站中繪制網絡圖,結果展示17個具有相互作用的基因,其中11個是下調顯著的基因(見圖1E)。Cytoscape軟件可視化分析排名前五的關鍵基因結果,分別為PDZK1、GREB1、TFF1、PGR和CDK6(見圖1F),提示這些基因可能與氟維司群耐藥相關。

圖1 篩選乳腺癌氟維司群耐藥相關基因Figure 1 Screening for fulvestrant-resistance related genes注:A、B.差異基因熱圖,藍色代表下調顯著基因,紅色代表上調顯著基因;C.韋恩圖分析兩種數據集顯著差異基因的交集;D.GO功能注釋,每組分別展示了富集前十的通路名稱(q<0.05);E.PPI網絡分析,紅色代表上調基因,藍色代表下調基因,節點連線的粗細代表蛋白相關性的強度,圓圈越大代表差異越顯著;F.MCC評分,顏色越深代表評分越高。

2.2PDZK1與氟維司群耐藥相關性分析 從TCGA數據庫提取ER+乳腺癌患者的數據,分析排名第一的PDZK1表達的臨床意義。熱圖分析PDZK1高低表達組的差異基因(|Log2FC|>1, FDR<0.05)(見圖2A～B)。差異基因GO功能注釋顯示富集的生物過程通路主要為內肽酶活性的調節、肽酶活性的調節以及內肽酶活性的負調節、肽酶活性的負調節等(見圖2C)。KEGG通路分析相關差異基因直接富集在內分泌耐藥通路(見圖2D),表明PDZK1的差異表達直接或間接影響內分泌治療效應。GSEA分析表明與PDZK1低表達相關的差異基因主要富集在藥物代謝細胞色素P450通路,見圖2E。

圖2 PDZK1的高低表達與乳腺癌氟維司群耐藥的相關性分析Figure 2 Analysis of PDZK1 expression and fulvestrant resistance in breast cancer注:A.熱圖(q<0.05);B.差異基因圖,圖片展示了排名前5的差異基因;C.GO功能注釋,每組分別展示了富集前10的通路名稱(q<0.05);D.KEGG通路分析,圖片展示了差異基因富集在排名前22的通路名稱(q<0.05);E.GSEA分析,PDZK1下調基因的KEGG通路分析(q<0.05),圖中展示了排名前5的通路名稱。

2.3PDZK1表達與臨床預后的相關性 TCGA數據庫顯示PDZK1高表達與腫瘤臨床分期呈顯著負相關(見圖3A)。Kaplan-Meier Plotter在線網站分析內分泌治療的ER+乳腺癌群體。結果顯示,PDZK1高表達組的患者OS、RFS和DMFS均優于PDZK1低表達組(P<0.05),見圖3B～D。

圖3 PDZK1表達與ER+乳腺癌患者臨床預后良好顯著相關Figure 3 PDZK1 expression and clinical prognosis of ER+ breast cancer patients注:A.TCGA ER+患者中分析腫瘤分級與PDZK1表達的關系;B～D. Kaplan-Meier在線分析OS、RFS、DMFS與PDZK1表達的相關性。

2.4PDZK1的表達促進氟維司群治療敏感性 利用慢病毒構建了過表達PDZK1的MCF-7細胞(見圖4A～B)。通過細胞增殖實驗檢測氟維司群對PDZK1過表達組細胞增殖的影響。結果顯示, 與對照組相比,PDZK1過表達顯著提升了氟維司群對MCF-7細胞增殖抑制的作用,見圖4C。

圖4 PDZK1的表達促進氟維司群治療敏感性Figure 4 PDZK1 expression promotes therapeutic sensitivity of fulvestrant注:A.PDZK1過表達的mRNA定量檢測;B. PDZK1過表達的蛋白結果;C.檢測氟維司群處理4 d后的細胞活力,對照組加千分之一的DMSO溶液;與OC-PDZK1組比較,①P<0.05。

3 討論

目前,氟維司群是唯一上市的選擇性雌激素受體下調劑,2017 年經美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于未接受過內分泌治療的ER+局部晚期或轉移性絕經后乳腺癌患者,成為內分泌治療的一線選擇。中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范2021版[10]推薦氟維司群作為絕經后復發轉移性乳腺癌的首選藥物。伴隨著氟維司群在臨床上的廣泛應用,部分患者由于先天性或繼發性內分泌抵抗限制了其治療獲益。研究[11-13]表明,ER信號傳導的下調,雌激素非依賴性生長、細胞分裂蛋白激酶6(CDK6)的高表達和雌激素受體的突變等是氟維司群耐藥的重要機制。因此本研究通過對氟維司群耐藥細胞數據集的挖掘,篩選出氟維司群耐藥的關鍵基因,包括PDZK1、GREB1、PGR、TFF1和CDK6,分析出PDZK1在氟維司群耐藥中的重要作用。既往研究[11, 14]證明GREB1和CDK6與內分泌抵抗相關。此外利用在線乳腺癌數據庫,我們發現PDZK1的高表達是內分泌治療患者的有益因素。體外實驗闡明PDZK1高表達有助于提升氟維司群治療的敏感度。

PDZK1也稱為Na(+)/H(+)交換調節因子(NHERF3),是由Kocher等[15]鑒定發現的一種含有四個PDZ相互作用結構域的63 kDa接頭蛋白,主要在肝、腎和小腸的上皮細胞和內皮細胞中表達。PDZ結構域包含大約90個氨基酸和一個3級褶皺,包括六個β鏈(β1-β6)和兩個α螺旋(α1和α2)。PDZ結構域的蛋白在調節蛋白質的運輸、信號的轉導、細胞-細胞的連接、細胞的極性和粘附性等發揮著重要的功能,特別是作為從膜內在蛋白到細胞內信號傳導的介質[16]。此外,PDZ結構域還是極其重要的抑制劑開發靶點,涵蓋神經類疾病,癌癥和病毒感染等方面[17]。PDZK1/NHERF3與離子轉運蛋白和多種GPCR(G蛋白偶聯受體)相互作用[18]。比如,PDZK1增加人前列環素受體(Human prostacyclin receptor,hIPR)在細胞表面的功能表達,增強配體結合和環前列素誘導的環磷酸腺苷(cAMP)生成,誘導內皮遷移和血管生成[19]或與生長抑素受體(Somatostatin receptor,SSTRs)[20]、促腎上腺皮質激素釋放因子受體(1CRFR1)和5-羥色胺2A受體(5-HT2AR)等相互作用[21]。PDZK1同樣參與腫瘤的發生發展,研究[22-23]表明,PDZK1的高表達抑制胃癌或腎細胞癌的增殖。PDZK1還參與乳腺癌的進展,一項臨床試驗[24-25]證明PDZK1的表達與血漿E2的水平存在相關性,E2刺激PDZK1的表達。但PDZK1與ERα表達水平無相關性,可能通過與EGFR和Src的相互作用影響ERα的功能[26]。

結合既往文獻,PDZK1可能從多方面調控內分泌藥物的療效。一方面PDZ結構域相對較小,PDZK1可以與多種藥物轉運蛋白的C端結合,如小鼠乳腺癌耐藥蛋白(Breast cancer resistant protein,BCRP)、寡肽轉運蛋白PEPT1和肉堿/有機陽離子轉運體OCTN2等,調控藥物或離子的膜轉運[27]。另一方面,本研究發現PDZK1表達與內肽酶活性調節相關,提示參與ERα的降解途徑,并且與藥物代謝酶P450通路相關。這些結果提示PDZK1可能通過與藥物轉運蛋白結合影響氟維司群藥物的主動吸收,或調控內肽酶和藥物代謝酶的功能,影響藥物的降解活性。因此,有必要在后續研究中探尋PDZK1影響氟維司群治療的主要途徑。

本研究中使用的微陣列數據集的樣本量相對較小,并缺少氟維司群治療抵抗患者的臨床數據。計劃在未來進一步收集氟維司群治療信息,以便更充分地認識PDZK1在氟維司群耐藥中的機制。

4 結論

本研究結果提示,PDZK1表達有助于提升氟維司群治療的敏感性,對內分泌治療耐藥的機制研究與臨床治療方案選擇具有重要的價值。