骨碎補UPLC指紋圖譜與人骨肉瘤細胞MG63中堿性磷酸酶活性的譜效關系研究

陳香麗,張慧敏,張紫佳

上海中醫藥大學中藥研究所 中藥標準化教育部重點實驗室,上海 201203

骨碎補是水龍骨科植物槲蕨(Drynariafortunei(Kunze) J.Sm.)的干燥根莖,其性溫、味苦,歸肝腎經。具有療傷止痛、補腎強骨、消風祛斑的功效[1]?，F代藥理和臨床研究表明,骨碎補具有抗骨質疏松、促骨折愈合、腎保護、抗炎、促進牙齒生長等作用[2]?；瘜W成分研究表明骨碎補中的主要活性成分為黃酮類、三萜類、苯丙素類以及酚類等[3]。有大量研究表明,骨碎補在治療骨骼相關疾病中具有顯著療效,且體外試驗表明骨碎補可促進成骨細胞的成骨分化能力[4-7],但對于骨碎補中具體起作用的藥效成分研究還未見報道。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是成骨細胞分化成熟的標志物,通過ALP的活性水平變化可以判斷成骨細胞的分化能力。因此本實驗通過UPLC指紋圖譜與人成骨肉瘤MG63細胞的ALP活性譜效關系進行分析,探討骨碎補作用于成骨細胞的主要成分。

中藥譜效相關評價模式是將化學成分指紋圖譜與其藥效作用相結合,使指紋圖譜中化學成分體現出相應的藥效,同時闡明指紋圖譜特征峰與藥效的相互關系,確定相應的藥效物質基礎,從而對中藥進行質量控制和藥效評價[8,9]。

本研究建立骨碎補生品和燙品UPLC指紋圖譜并用UPLC-Q-TOF MS技術對其化學成分進行鑒別,采用灰色關聯度、雙變量相關性分析和偏最小二乘法構建骨碎補指紋圖譜和ALP活性的譜-效關系,為闡明骨碎補的藥效物質基礎和質量控制提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

Waters 超高效液相色譜儀(美國Waters公司);ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm,1.8 μm);Q-TOF液質聯用儀(安捷倫液相色譜-G650系列四極桿-飛行時間質譜聯用儀)。

1.1.2 試劑與材料

柚皮苷(批號:10236-47-2,純度:大于98%,成都植標化純生物技術有限公司);DMEM培養基(批號:11995081,Gibco);堿性磷酸酶(ALP/AKP)測試盒(微板法)(批號:A0529-2-2,南京建成生物工程研究);PierceTM BCA蛋白定量試劑盒(批號:23227,Thermo Fisher Scientific,USA);色譜級甲醇、甲酸(Fisher公司);分析級75%乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)。實驗所用骨碎補藥材購自亳州中藥材市場,由上海中藥標準化中心吳立宏研究員鑒定為水龍骨科植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze) J.Sm的干燥根莖,標本編號為20201001-7,保存在上海中醫藥大學中藥研究所,骨碎補藥材產地信息詳見表1,其中燙品1～3(DRT 1～3)分別由生品1～3按照《中華人民共和國藥典》(2020年版一部)方法經砂燙制得。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備

取樣品粉末0.25 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入75%乙醇20 mL,稱定重量,45 ℃超聲提取30 min(功率180 W,頻率40 kHz),放冷,再稱定重量,用75%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

1.2.2 色譜分析條件

采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm ×100 mm,1.8 μm)色譜柱,甲醇(A)和0.1%的甲酸水(B)為流動相,在25 ℃柱溫條件下分離,流速 0.3 mL/min,進樣量5 μL。

洗脫梯度:0～8 min,96%→92% B;8～11 min,92%→84% B;11～16 min,84%→82% B;16～19 min,82%→70% B;19～22 min,70%→65% B;22～27 min,65%→55% B;27～35 min,55%→45% B;35～38 min,45%→5% B。0～6.5 min的檢測波長分別為283 nm;6.5～13 min的檢測波長為260 nm;13～18 min的檢測波長為283 nm;18～23 min的檢測波長為260 nm;23～38 min的檢測波長為283 nm。

1.2.3 質譜分析條件

質譜條件:掃描質量范圍(m/z):100～1700;鞘氣溫度:250 ℃;鞘氣流速:11 L/min;噴嘴電壓:500 V;霧化器壓力:45 psi;毛細管電壓:3.5～4.0 kV;毛細管溫度:350 ℃;干燥器流速:5 L/min;干燥器溫度:300 ℃;碰撞能量:20～50 V。

1.2.4 骨碎補提取物ALP活性的測定

將10批骨碎補75%乙醇提取物,分別用DMSO配置成100 mg生藥/mL的母液,0.22 μm微孔濾膜過濾,用于后期MG63細胞ALP活性評價研究。

將MG63細胞以2×105個/孔的密度將細胞接種于6孔板中,每孔的體積為2 mL。待細胞貼壁后給藥,給藥濃度為0.01 mg生藥/mL,給藥48 h后按ALP檢測試劑盒說明書測定ALP活性。

1.3 數據分析

本實驗數據的灰色關聯度分析、雙變量相關性及偏最小二乘回歸分析采用SPSSPRO、SPSS21.0、SIMCA-14.1軟件處理,細胞ALP活性用GraphPad Prism 9.0.0軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 骨碎補指紋圖譜的建立

2.1.1 精密度實驗

取同一份骨碎補供試品溶液按“1.2.2”項下色譜條件連續進樣6次,骨碎補各共有峰相對保留時間相對標準偏差(RSD<0.37%),相對峰面積RSD< 1.11%,表明儀器精密度較好。

2.1.2 重復性實驗

稱取6份同一批號的骨碎補,制備6份平行樣品,依次進樣分析,計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD值。結果顯示,共有峰相對保留時間RSD<0.05%,相對峰面積 RSD<1.67%,表明此方法重復性良好。

2.1.3 穩定性實驗

同一份供試品溶液分別在 0、2、4、8、12、24、48 h按“1.2.2”項下色譜條件進行測定,計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積。結果表明,相對保留時間RSD<0.34%,相對峰面積RSD<1.91%,表明供試品溶液在48 h內穩定性較好。

2.2 骨碎補UPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

按“1.2.1”項下方法制備5批骨碎補生品和5批骨碎補燙品的供試品溶液,再按“1.2.2”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。將色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.1版)》,經多點校正后,采用中位數法生成骨碎補生品和骨碎補燙品的UPLC疊加指紋圖譜。結果顯示,5批骨碎補生品和5批骨碎補燙品共有12個共有峰(見圖1)。5批骨碎補生品和5批骨碎補燙品指紋圖譜的相似度均大于0.9,表明骨碎補生品與燙品相似度高,區分不明顯(見表2)。

圖1 骨碎補生品和燙品疊加指紋圖譜

表2 5批骨碎補生品和5批燙品指紋圖譜相似度

2.3 UPLC-Q-TOF MS鑒別骨碎補中的化學成分

將骨碎補生品和砂燙炮制品按“1.2.4”項下質譜條件采用UPLC-Q-TOF MS技術進行分析,通過MSDIL數據庫、PubChem數據庫和相關文獻比對,鑒定骨碎補指紋圖譜的共有峰,此外還從中鑒定出另外27個化合物。骨碎補炮制前后的總離子流圖見圖2,質譜鑒別結果見表3。

圖2 骨碎補UPLC-Q-TOF MS總離子流圖

表3 生、燙骨碎補化學成分的質譜數據及鑒定結果

2.4 骨碎補提取物指紋圖譜與ALP活性之間的譜效關系分析

2.4.1 骨碎補提取物對MG63 ALP活性的影響

堿性磷酸酶(ALP)是成骨細胞分化成熟的標志物,通過ALP的活性水平變化可以判斷成骨細胞的分化能力。將骨碎補的乙醇提取物以0.01 mg生藥/mL的濃度作用于MG63細胞,并用10 nmol/L雌二醇(estradiol,E2)作為陽性對照,以不做任何處理的MG63細胞作為空白對照組(control,Con),測定細胞的ALP活性水平(按照說明書要求,以每克蛋白在37 ℃與基質作用15 min產生1 mg酚為1個金氏單位,ALP活性的單位記為:金氏單位/gprot)。結果表明同一批次骨碎補經砂燙后其提取物對MG63細胞的ALP活性的提升均比相對應的生品略高,但并無顯著性差異(見圖3)。

圖3 骨碎補對MG63 細胞ALP活性的影響

2.4.2 骨碎補UPLC指紋圖譜共有峰與ALP活性的相關性分析

2.4.2.1 灰色關聯度分析

根據建立的指紋圖譜,將骨碎補炮制前后的指紋圖譜中標定的12個共有峰的單位峰面積與ALP活性進行相關性分析。采用SPSSPRO在線軟件,對10批骨碎補藥材中12個峰的單位峰面積與ALP活性進行灰色關聯度分析。結果顯示,1、2、6、8、11號峰的單位峰面積與ALP活性的灰色關聯系數值在0.8～0.9之間,表示有相對顯著影響,其余峰的單位峰面積與ALP活性的關聯系數均大于0.9,表明關聯度較高[21](見表4)。

表4 骨碎補中12個共有峰與MG63細胞ALP活性的灰色關聯系數及雙變量相關系數

2.4.2.2 雙變量相關性分析

采用SPSS 21.0軟件進行雙變量相關性分析。結果顯示,峰4、峰5與峰12與ALP活性的雙變量相關系數呈正相關,且均大于0.3(見表4)。

2.4.2.3 偏最小二乘回歸分析

利用 SIMCA-14.1軟件,采用偏最小二乘回歸分析法進行譜效相關性分析,計算得到12個共有峰與ALP活性的標準化回歸系數和VIP值(見表5),VIP值越大,貢獻率越高,VIP值>1時,自變量在解釋因變量時具有重要意義[22]。峰1、峰2、峰4、峰5、峰10與峰12的回歸相關系數為正值,說明與ALP活性正相關,其中,峰4、峰5、峰12的VIP值大于1,表明對ALP活性具有重要貢獻,是ALP活性的重要變量,與雙變量相關性分析結果一致。

表5 骨碎補中12個共有峰與MG63細胞ALP活性的標準化回歸系數

綜合分析灰色關聯度、雙變量相關系數、偏最小二乘回歸系數和VIP值,可知峰4、峰5及峰12與ALP活性具有較高關聯度,且呈正相關,對ALP活性的貢獻度最大,是影響ALP活性的重要變量。由質譜分析結果確定峰4為咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;峰5為兒茶素7-葡糖苷;峰12為柚皮苷。

在這三種成分中,僅柚皮苷可購買到對照品,將10 μmol/L柚皮苷作用于MG63細胞,并用10 nmol/L雌二醇(estradiol,E2)作為陽性對照,測定ALP活性,結果表明柚皮苷可顯著促進MG63細胞中ALP活性(見圖4),驗證了相關性分析的準確性。

圖4 柚皮苷對MG63 細胞ALP活性的影響

3 討論與結論

本研究采用UPLC法結合多波長檢測建立了骨碎補生品和燙品的指紋圖譜,不同批次的骨碎補生品和燙品有12個共有峰,且相似度大于0.9,表明二者相似度高,區分不明顯。ALP是成骨細胞分化成熟的標志物,是骨形成的生化指標之一。通過ALP的活性水平變化可以判斷成骨細胞的分化能力。已有研究表明,骨碎補可促進成骨細胞分化[23]。本研究將骨碎補生品和燙品作用于MG63細胞,分析其對ALP活性的影響。結果表明,同一批次的骨碎補經砂燙后,可顯著促進MG63細胞分泌ALP。為探究骨碎補中促進MG63成骨分化的活性成分,將ALP活性與指紋圖譜標定的特征峰進行譜效相關性分析。為更全面分析骨碎補指紋圖譜特征峰與ALP活性的譜效關系,本實驗綜合利用灰色關聯度分析、雙變量相關性分析和最小偏二乘回歸分析三種方法,得出峰4、峰5、與峰12與ALP活性具有較高關聯度,且呈正相關,對ALP活性的貢獻度最大,是影響ALP活性的重要變量。

UPLC-Q-TOF/MS 技術具有選擇性強、靈敏度高、樣品前處理簡單、高精度及高分辨率等特點,可以更全面、更快速的完成對骨碎補化學成分鑒定[24]。本研究利用UPLC-Q-TOF/MS在負離子模式下鑒別出骨碎補中的40個成分。確定對ALP活性具有重要貢獻的成分為峰4咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;峰5兒茶素7-葡糖苷;峰12柚皮苷并對柚皮苷的活性進行了驗證。柚皮苷是一種黃酮類化合物,現代藥理研究作用表明,柚皮苷可用于治療或預防多種疾病,如抗骨質疏松、抗氧化、抗腫瘤、改善心肌損傷等[25-27]?，F有研究也表明,柚皮苷是骨碎補藥材中的重要活性成分[28]。而咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和兒茶素7-葡糖苷的藥理活性目前還未見報道,值得進一步開展研究。本研究結果對骨碎補質量控制及藥效學研究具有一定參考意義。