基于高通量測序技術的9種鐵線蓮屬藥材混合粉末分子鑒定

呼和,莫日根,烏雅漢,烏日汗,額爾敦呼,3,白明君,包桂花,4,許亮

(1.內蒙古民族大學,內蒙古 通遼 028000;2.新巴爾虎右旗阿拉坦額莫勒鎮社區衛生服務中心,內蒙古 呼倫貝爾 021300;3.內蒙古自治區國際蒙醫醫院,內蒙古 呼和浩特 010020;4.蒙醫藥研發工程教育部重點實驗室,內蒙古 通遼 028000;5.遼寧中醫藥大學,遼寧 大連 116000)

鐵線蓮屬植物在全世界有300多種,主要分布在熱帶及亞熱帶地區,寒帶地區也有分布。我國約有108種,廣泛分布于全國各地,云南是我國鐵線蓮屬植物的分布中心[1-2]。鐵線蓮屬植物適應性強,具有較強的耐寒性,該屬許多種類花大色艷,花色各種各樣,花型多種,花期長,觀賞價值很高,具有“攀援植物皇后”的美稱[3]。鐵線蓮屬植物是我國傳統中草藥,具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、鎮痛等作用[4],目前國內外對鐵線蓮屬的研究主要在生理抗性、無性繁殖、化學成分和藥理作用等方面[5]。鐵線蓮屬植物在我國29個少數民族地區作為民族藥使用,其藥用部位多以根和全草為主,其次是藤莖,葉較少,另有個別藥材用帶花枝葉、果實、嫩枝或根皮[6]。民族藥傳統功效為祛風止痛、利尿通淋、痛經下乳、抗菌消炎等,少部分可用于消化不良、胃寒、腹脹、黃疸、痞塊、心悸、鼻竇炎等病癥治療;外敷可用于瘡瘍久潰不斂、皮膚炎癥,如羌族用黃花鐵線蓮嫩枝外敷治各種頑癬、神經性皮炎。毛茛科鐵線蓮屬近緣物種化學成分、藥理作用相似,如短尾鐵線蓮、芹葉鐵線蓮、黃花鐵線蓮等[7]。在市場流通過程中,經常有近緣藥材代替正品藥材的現象,嚴重影響了臨床用藥的安全性和準確性,應引起廣泛重視。因此,為了臨床用藥安全性及有效性,準確鑒定鐵線蓮屬近緣藥材任重而道遠。

有關鐵線蓮屬藥材的分子鑒定研究較少,傳統的鑒定方法不能很好地對正品、偽品藥材進行準確系統的鑒定。近年來,分子鑒定技術不斷發展,越來越多的學者利用分子技術對近緣藥材進行鑒定,并具有一定的可行性。因此,分子鑒定的相關研究越來越多,研究成果也較為突出。安蕊等[8]利用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性方法,建立了一種快速、準確鑒別威靈仙藥材基原的方法,為進一步開展威靈仙藥材的準確鑒定提供了新的方法。木其爾[9]應用DNA 條形碼技術,對14種鐵線蓮屬植物進行了分子鑒定,為 DNA 條形碼技術鑒別鐵線蓮屬藥材提供了新的思路。高通量測序技術作為新一代的測序技術,廣泛用于中藥材的鑒定,并且能夠應用于藥材混合粉末樣品的鑒定[10]。

本實驗利用高通量測序技術,對棉團鐵線蓮、女萎鐵線蓮、短尾鐵線蓮、灌木鐵線蓮、單葉鐵線蓮、黃花鐵線蓮、粗齒鐵線蓮、東北鐵線蓮和芹葉鐵線蓮等9種鐵線蓮屬藥材混合粉末樣品的 ITS2 序列進行宏基因組學物種多樣性分析,并構建系統發育樹,旨在鑒定出混合粉末樣品中的鐵線蓮屬藥材,同時探究其系統進化關系。

1 材料

1.1 藥材9種鐵線蓮屬藥材采集時間為2022年7月至2022年9月,其藥用部位均為全草,樣品信息見表 1。

表1 樣本信息

1.2 試劑天根植物提取試劑盒、DNA Taq聚合酶、2 000 bp DNA Marker(Takara公司);溴化乙錠(Fluka公司),1×TAE緩沖液(Solarbio公司);引物(北京六合華大基因科技有限公司);ddH2O和 Q5DNA聚合酶(北京康為世紀生物科技有限公司);反應buffer、GC buffer 和 dNTP(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 儀器微量移液器(Eppendorf公司);Sigma 3K15低溫冷凍離心機(北京五洲東方公司);MultiGene Gradient PCR儀(Labent InternationL Ine);DYY-12 電泳系統(北京市六一儀器廠);QUA NTUM凝膠成像分析儀(北京五洲東方公司)。

2 方法

2.1 樣品總DNA提取取9種藥材各3 g,分別研碎,等比混勻,取3份100 mg混合粉末樣品分別命名為TXL1、TXL2、TXL3。應用植物提取試劑盒提取樣品中總DNA。

2.2 PCR擴增混合樣品宏基因組物種多樣性分析,目標為ITS2序列片段,引物序列為ITS2:5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′,5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。擴增體系為 25 μL:5×反應 buffer 5 μL,5×GC buffer 5 μL,dNTP 2 μL,上游引物和下游引物各1 μL,DNA 模板 2 μL,ddH2O為 8.75 μL,Q5DNA聚合酶0.25 μL。擴增參數:96 ℃預變性3 min,96 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 個循環,72 ℃延長5 min。

2.3 測序文庫制備采用Illumina MiSeq平臺進行雙端測序。采用滑動窗口法篩查 FASTQ 格式的雙端序列質量。利用FLASH軟件[11]對通過質量初篩的序列進行配對連接。將連接后的序列識別分配入對應樣本,獲得有效序列。使用QIIME(使用的QIIME為QIIME22019.4官方網址是https://docs.qiime2.org)和UCLUST(Vsearch版本為v2.13.4_linux_x86_64)軟件。具體的參數為:首先使用cutadapt切除序列的引物片段,設置-O為10,棄去未匹配引物的序列[12];使用Vsearch的fastq_mergepairs模塊拼接序列;使用fastq_filter模塊對拼接序列進行質控;使用 derep_fulllength模塊去除重復序列;使用cluster_size模塊,在98%相似度水平對去重后的序列聚類,使用uchime_denovo模塊去除嵌合體;再使用perl腳本(https://github.com/torognes/vsearch/wiki/VSEARCH-pipeline),過濾質控后序列集中的嵌合體,從而獲得高質量序列;使用cluster_size模塊,在97%相似度水平對高質量序列聚類,并分別輸出代表序列和OTU表。最后,去除OTU表格中的singletons OTUs(即在所有樣本中豐度為1的OTU,默認操作)及其代表序列[13]。利用UNITE[14]和NCBI數據庫進行序列比對,獲取各OTU的分類學信息。

2.4 分類學信息交互展示與進化分析使用Krona軟件(https://github.com/marbl/Krona/wiki)進行群落分類,并對樣本分類水平的組成進行可視化分析。并使用MEGA 7.0 在NCBI下載的序列與OTU代表序列構建鄰接系統分類(NJ)樹,鑒定出物種并探討系統進化關系。

3 結果與分析

3.1 測序結果混合粉末樣品的物種多樣性分析顯示,3組重復實驗TXL1、TXL2、TXL3分別得到113 671、131 403、138 206條序列,所得序列總數為383 280條。剔除有疑問的序列后,剩余高質量的序列總數為257 435條,其中TXL1為72 451條、TXL2為95 553條、TXL3為89 431條,序列長度為363 bp和364 bp的序列條數最多,分別為164 262條和1 077條。

3.2 分類學組成分析根據 OTU 劃分及分類比對3組混合樣品,樣品共得到496個OTU,共包含123 533條序列。樣品總體的OTU劃分和分類地位鑒定結果見表2,可以獲得各樣本在各分類水平的具體組成。分類結果與 GenBank下載的參考序列進行比對,有72個OTU比對到混合粉末樣品中的7個物種,分別為棉團鐵線蓮、女萎鐵線蓮、短尾鐵線蓮、灌木鐵線蓮、單葉鐵線蓮、黃花鐵線蓮、粗齒鐵線蓮,共有46 459條ITS2 序列。但混合粉末樣品中的其他2種藥材,東北鐵線蓮和芹葉鐵線蓮未能比對出來?？赡苁怯捎谄?個物種在儲藏過程中DNA降解,較低的DNA含量不利于物種的鑒定導致。此外,還有可能的原因是堿基錯配、組裝偏差、測序深度不夠等問題。

表2 OTU 劃分和分類統計表

3.3 基于Krona分類學組成信息交互展示和系統發育樹的構建

3.3.1 基于Krona分類學組成信息交互結果采用Krona軟件(https://github.com/marbl/Krona/wiki)進行群落分類學組成的交互展示,可以對樣本分類學組成進行可視化分析,同時也能展示數據的交互關系。粉末樣品中被注釋到的物種均為毛茛科鐵線蓮屬物種,鐵線蓮屬為優勢類群,豐度值達到了 100%,未有其他物種被注釋,結果見圖1。這一結果與混合粉末樣品中的物種實際情況相符。但實際上,基于宏基因組學物種多樣性分析技術,除了本研究側重考慮鐵線蓮屬物種外,微生物物種也可能被鑒定出,但在測序結果中并未觀察到。而在分類學組成分析中,未分類的 OTU 單元數量很多,還有一些 OTU 未被注釋,因此,這些未被分類或注釋的物種可能為微生物物種。通過構建 Krona 的分類學組成信息交互展示圖,能很好地反映樣品中物種的實際分布情況。

圖1 基于Krona分類學組成信息交互展示圖

3.3.2 系統發育樹使用MEGA7.0軟件,從NCBI中選取鑒定出7種物種的ITS2序列,并與OTU代表序列構建NJ樹。鑒定出棉團鐵線蓮、女萎鐵線蓮、短尾鐵線蓮、灌木鐵線蓮、單葉鐵線蓮、黃花鐵線蓮、粗齒鐵線蓮聚為一支,且可信度良好。其中,共含有12個節點,可信值為100%的節點有3個,可信值在80%以上的節點有2個,可信值在75%以上的節點有3個,可信值在70%以上的節點有4個,結果見圖2。系統進化分析鑒定出7種同屬不同物種,同時體現了物種的親緣關系,為鐵線蓮相關物種的系統進化研究提供了理論依據。

DWTXL:短尾鐵線蓮(Clematis brevicaudata DC.);DYTXL:單葉鐵線蓮(Clematis henryi Oliv.);CCTXL:粗齒鐵線蓮(Clematis argentilucida Levl.et Vant);GMTXL:灌木鐵線蓮(Clematis fruticosa Turcz.);HHTXL:黃花鐵線蓮(Clematis intricate Bunge);NWTXL:女萎鐵線蓮(Clematis apiifolia DC.Syst);MTTXL:棉團鐵線蓮(Clematis hexapetala Pall.)

4 討論

近年來,宏基因組學分析技術在藥材的鑒定中被廣泛應用,尤其以分子生藥學為基礎的分子鑒定技術,越來越受到中藥學者的關注。目前,蒙藥均以原粉入藥,利用傳統的鑒定方法不能準確地將他們區分。本研究采用高通量測序技術[15-16],利用 ITS2 序列作為 DNA 條形碼,對鐵線蓮屬9種藥材的混合粉末進行物種鑒定,該方法具有準確性高、重復性好等特點。

本研究首次將該分析方法應用于鐵線蓮屬9種藥材混合粉的鑒定,鑒定出混合樣品中的7種物種,但未能鑒定出混合粉末樣品中的其他2種藥材,并且3個重復組9個樣品試驗結果均未鑒定出東北鐵線蓮和芹葉鐵線蓮?？赡芘c樣品的儲藏、測序、堿基錯配、組裝等有關聯。

在OTU 劃分和分類統計表中,從界到屬的數據不是一直增大,由于有一些分類學水平沒有明確的注釋,所以不參與計數。例如一條序列在數據庫中科水平有明確的注釋,但是在屬水平沒有明確注釋,所以會出現屬水平小于科水平的數量。

測序結果表明,363 bp和364 bp的序列條數最多,分別為164 262條和1 077條。這兩個序列的長度值分布的序列數量遠高于其他序列長度所分布的序列數量。分類學組成分析中,還有一些未被注釋的OTU,樣品中存在一些物種未能被鑒定出來,這些物種可能為樣品中存在的細菌和真菌等微生物物種。在高通量測序過程中雖然被測出,但未能被分類或注釋。這種現象的產生可能與 ITS2 引物的偏好性、 測序深度等有關,也可能是因為這些微生物物種所得的 OTU 數量極低,在后續分析過程中當作背景噪音而清除,因此,未能準確注釋。在 Krona 的分類學組成信息交互展示圖中表示黃花鐵線蓮序列占有效序列總量的22%、單葉鐵線蓮19%,短尾鐵線蓮占28%,女萎鐵線蓮占10%,灌木鐵線蓮占7%,棉團鐵線蓮占13%,粗齒鐵線蓮占1%,還有未能比對出東北鐵線蓮和芹葉鐵線蓮?？赡苁且驗闇y序及分析技術本身存在不足,組裝偏差、堿基錯配、測序深度不夠等,這些因素可能將不同藥材物種的OTU進行了歸并,致使未能準確鑒定。也可能與每個物種含有DNA的質量或提取效率有關,較低的DNA含量和提取效率不利于實驗結果的體現;系統發育樹分析進一步驗證了所比對到的各個物種,從Genbank中選取鑒定出的7種物種的ITS2序列,與OTU代表序列相符合,他們之間的系統進化關系更近。因此,混合樣品物種的鑒定得到了驗證,測序結果更具有說服力。高通量測序技術有利于對中蒙藥材的準確快速鑒定,可滿足不同行業人員對中蒙藥材鑒定的需求,并對臨床用藥安全提供堅實基礎。