金蓮花多糖提取工藝優化及其抗氧化活性評價

李春曉,宋慶琳,焦旭,馮慧程,陳虞超,郭生虎,張波,薛濤

(1.臨沂大學醫學院,山東 臨沂 276000;2.寧夏農林科學院農業生物技術研究中心,寧夏 銀川 750002)

金蓮花為毛茛科植物金蓮花(TrolliuschinensisBunge)的干燥花及其花蕾,傳統醫學認為金蓮花具有清熱解毒、消腫明目等功效[1],而現代藥理學研究證實金蓮花具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗衰老等多種藥理活性[2]。金蓮花多以金蓮花片、金蓮花顆粒、金蓮花膠囊、金蓮花口服液等中成藥形式在臨床中使用,主要用于治療上呼吸道感染及各種炎癥[2];作為食用,金蓮花多以花茶的形式以供飲用[3]。如今,金蓮花在新疆、黑龍江、寧夏、河北、陜西等地均有栽培。

金蓮花含有黃酮類、有機酸類、生物堿類、香豆素類及多糖類化學成分,其中黃酮類成分研究最為廣泛,而多糖類成分研究相對較少[4]。然而,多糖類成分是中藥化學成分的重要組分之一,具有抗氧化[5]、抗病毒[6]、抗衰老[7]、抗腫瘤[8]、降血糖[9]、降血脂[10]、增強免疫[11]等廣泛的藥理活性,開發利用前景廣闊。因此,本研究采用回流提取法提取金蓮花多糖,在單因素試驗的基礎上,采用正交設計試驗優化了金蓮花多糖的提取工藝,并對金蓮花多糖的體外抗氧化活性進行了全面評估,以期為金蓮花多糖的進一步研究與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器金蓮花購自寧夏銀川永寧縣,經郭生虎教授鑒定為毛茛科植物金蓮花(TrolliuschinensisBunge)的干燥花;葡萄糖對照品購自上海源葉生物科技有限公司;抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+)、過硫酸鉀、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、鄰苯三酚、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸均購自上海麥克林生化科技有限公司;氯化鈉、磷酸氫二鈉、十二水合磷酸二氫鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司。

FA1204N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司);DHG-9620A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);RE-52A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);SHK-Ⅲ型循環水式真空泵(鄭州科泰實驗設備有限公司);GL-21M型高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司);UV-5500紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理取金蓮花樣品置鼓風干燥箱中,50 ℃烘干24 h后粉碎,過60目篩,備用。

1.2.2 金蓮花多糖的提取準確稱取金蓮花粉末10 g置250 mL圓底燒瓶中,加入一定量的蒸餾水,在一定溫度下加熱回流提取一定時間,過濾,旋轉蒸發濃縮至50 mL,冷卻后加入4倍體積的無水乙醇,4 ℃靜置過夜,5 000 r·min-1離心10 min,獲得多糖后于烘箱中80 ℃烘干,即得。

1.2.3 金蓮花多糖的含量測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制精密稱取0.50 g葡萄糖對照品配制成濃度為的1 mg·mL-1的對照品溶液;精密量取葡萄糖對照品溶液0、20、40、60、80、100、120 μL置試管中,并用蒸餾水補足至1.0 mL;向各試管中分別加入5%苯酚溶液0.5 mL,濃硫酸2.5 mL,搖勻,靜置20 min;以水為參比,照《中國藥典》紫外-可見分光光度法(通則0401)[12],在490 nm波長下測定吸光度,以吸光度為縱坐標Y,葡萄糖濃度為橫坐標X(mg·mL-1),獲得標準曲線方程為Y=15.696X-0.026 5,R2=0.996 6,線性范圍0.02～0.12 mg·mL-1。

1.2.3.2 多糖得率計算金蓮花多糖經回流提取濃縮后,按照“1.2.3.1”項下方法進行測定,將獲得的吸光值代入標準曲線方程計算出金蓮花多糖溶液的濃度,并根據以下公式進行計算:

式中:N為金蓮花多糖得率(%);C為金蓮花提取液中多糖濃度(mg·mL-1);V為金蓮花多糖提取液體積(mL);B為稀釋倍數;W為金蓮花樣品質量(g)。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 提取溫度對金蓮花多糖提取率的影響按照“1.2.2”項下方法進行操作,固定料液比為1∶25(m/V),提取時間為2.5 h,分別設置60、70、80、90、100 ℃等不同提取溫度以考察提取溫度對金蓮花多糖提取率的影響。

1.2.4.2 料液比對金蓮花多糖提取率的影響按照“1.2.2”項下方法進行操作,固定提取溫度為80 ℃,提取時間為2.5 h,分別按照1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(m/V)等不同料液比進行提取,以考察料液比對金蓮花多糖提取率的影響。

1.2.4.3 提取時間對金蓮花多糖提取率的影響按照“1.2.2”項下方法進行操作,固定料液比為1∶25(m/V),提取溫度為80 ℃,分別設置1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h等不同提取時間,以考察提取時間對金蓮花多糖提取率的影響。

1.2.5 正交試驗設計在單因素試驗的基礎上,選取料液比、提取溫度、提取時間3個影響因素為自變量,以金蓮花多糖提取率為指標,進行三因素三水平正交試驗設計,L9(33)正交試驗設計如表1所示。

表1 L9(33)正交試驗設計

1.2.6 體外抗氧化活性評價

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力的測定參照劉宇等[13]的方法進行測定。首先,用蒸餾水將金蓮花多糖倍半稀釋成系列濃度(2.0、1.0、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03 mg·mL-1);然后,向10 mL比色管中分別加入2 mL不同濃度的金蓮花多糖樣品,加入2 mL 0.1 mmoL·L-1DPPH乙醇溶液,混勻,室溫避光反應30 min,離心(3 000 r·min-1,10 min)后于517 nm測定吸光值。DPPH自由基清除率按下式計算,其中A0為空白對照吸光值,反應體系中以無水乙醇代替被測樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應體系中以無水乙醇代替DPPH。以相同濃度的抗壞血酸為陽性對照。不同濃度的金蓮花多糖樣品及抗壞血酸陽性對照均重復測定3次。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力的測定參照劉旭東等[14]的方法進行測定。將2.45 mmoL·L-1過硫酸鉀溶液與7 mmoL·L-1的ABTS+溶液,等體積混合后,室溫避光孵育12～16 h,獲得ABTS+儲備液。取適量ABTS+儲備液通過PBS緩沖液(0.01 moL·L-1,pH 7.5)稀釋至在734 nm下的吸光值為0.7左右即得到ABTS+工作液。取不同濃度(0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008 mg·mL-1)的金蓮花多糖溶液0.2 mL,加入3.8 mL的ABTS+工作液,混勻后室溫反應6 min并于734 nm下測定吸光值。ABTS+自由基清除率按下式計算,其中A0為空白對照吸光值,反應體系中以蒸餾水代替被測樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應體系中以蒸餾水代替ABTS+工作液。以相同濃度的抗壞血酸為陽性對照。不同濃度的金蓮花多糖樣品及抗壞血酸陽性對照均重復測定3次。

1.2.6.3 羥基自由基清除能力的測定采用水楊酸法測定金蓮花多糖對羥基自由基的清除能力。先用蒸餾水將金蓮花多糖倍半稀釋成系列濃度(0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008 mg·mL-1)。然后向10 mL離心管中依次加入6 mmoL·L-1硫酸亞鐵1 mL,不同濃度的金蓮花多糖樣品溶液1 mL,6 mmoL·L-1H2O21 mL,混勻,室溫放置10 min,最后加入6 mmoL·L-1乙醇-水楊酸,搖勻,在37 ℃恒溫箱放置20 min,于510 nm處測定吸光值。羥基自由基清除率按下式計算,其中A0為空白對照吸光值,反應體系中以蒸餾水代替被測樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應體系中以蒸餾水代替H2O2。以相同濃度的抗壞血酸為陽性對照。不同濃度的金蓮花多糖樣品及抗壞血酸陽性對照均重復測定3次。

1.2.6.4 超氧陰離子自由基清除能力的測定采用鄰苯三酚法測定金蓮花多糖對超氧陰離子自由基的清除能力。先用蒸餾水將金蓮花多糖倍半稀釋成系列濃度(4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.13、0.06 mg·mL-1)。然后向10 mL離心管中依次加入0.1 moL·L-1Tris-HCl溶液4.5 mL,蒸餾水2.4 mL,不同濃度的金蓮花多糖樣品溶液1 mL,混勻后室溫反應10 min,加入0.1 mL 10 mmoL·L-1HCl終止反應,于325 nm測定吸光值。超氧陰離子自由基清除率按下式計算,其中A0為空白對照吸光值,反應體系中以蒸餾水代替被測樣品;As為樣品吸光值;As0為樣品本底吸光值,反應體系中以蒸餾水代替鄰苯三酚。以相同濃度的抗壞血酸為陽性對照。不同濃度的金蓮花多糖樣品及抗壞血酸陽性對照均重復測定3次。

1.2.6.5 總還原能力的測定先用蒸餾水將金蓮花多糖倍半稀釋成系列濃度(4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.13、0.06 mg·mL-1)。然后向10 mL離心管中依次加入不同濃度的金蓮花多糖樣品溶液0.5 mL,磷酸緩沖液(0.2 moL·L-1,pH 6.6)2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL。充分混勻后將混合物置于水浴鍋中水浴20 min (50 ℃)。再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,混勻后室溫靜置10 min。從上述試管中取出2.5 mL反應液,依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液,反應10 min后,以蒸餾水調零,測定700 nm處吸光值。以相同濃度的抗壞血酸為陽性對照。不同濃度的金蓮花多糖樣品及抗壞血酸陽性對照均重復測定3次。

1.3 數據分析采用Excel進行數據統計與分析;采用Origin Pro 9.0 2016 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 金蓮花多糖提取單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對金蓮花多糖提取率的影響在60～100 ℃范圍內,隨著提取溫度的升高,金蓮花多糖的提取率也逐漸提高,由最低的0.274%提升至最高的0.769%。且在60～70 ℃及70～80 ℃范圍內金蓮花多糖提取率的上升幅度(斜率)明顯小于80～90 ℃時的金蓮花多糖提取率的上升幅度,說明在80 ℃時金蓮花多糖的提取率開始顯著提升。因此,在后續的正交試驗設計中選用80、90和100 ℃作為提取溫度的3個水平。

2.1.2 料液比對金蓮花多糖提取率的影響當料液比在1∶10～1∶30(m/V)范圍內時,金蓮花多糖提取率呈現先增高后降低的趨勢,且當料液比為1∶25時,金蓮花多糖提取率達到0.790%,且顯著(P<0.05)高于1∶20和1∶30料液比時的多糖提取率。因此,在后續的正交試驗設計中選用1∶20、1∶25、1∶30作為料液比的3個水平。

2.1.3 提取時間對金蓮花多糖提取率的影響在1.0～3.0 h范圍內,金蓮花多糖的提取率隨著提取時間的延長呈現出先提高后降低的趨勢,且在提取時間2.0 h的時候達到峰值,此時提取率為1.230%。雖然繼續延長提取時間,但金蓮花多糖的提取率不升反降,但與1.0 h相比,金蓮花多糖的提取率仍有顯著提高(P<0.05)。因此,在綜合考慮提取率與時間成本的情況下,后續的正交試驗設計中選用了1.5、2.0和2.5 h作為提取時間的3個水平。

2.2 金蓮花多糖提取條件正交設計試驗結果根據單因素試驗的結果,選取了料液比、提取溫度和提取時間3個因素及對應的3個水平以設計L9(33)正交試驗,試驗以金蓮花多糖提取率為指標。結果如表2和表3所示,通過極差分析可知,在3個影響因素中,提取溫度的影響最大,料液比的影響次之,提取時間的影響最小。

表2 L9(33)正交試驗分析結果

表3 正交試驗方差分析

通過正交試驗結果分析可知,當以金蓮花多糖提取率為評價指標時所獲得的最佳提取工藝組合為A1B2C2,即提取溫度80 ℃,料液比為1∶25(m/V),提取時間為2.0 h。為進一步驗證最佳提取工藝的提取效果,本研究按照最佳工藝組合再次平行提取了3份金蓮花多糖,結果金蓮花多糖提取率為1.350%±0.125%,說明本研究優化的提取工藝對金蓮花多糖的提取效果穩定可靠。

2.3 金蓮花多糖體外抗氧化活性評價結果

2.3.1 金蓮花多糖對DPPH自由基清除作用在0.03～0.25 mg·mL-1濃度范圍內,金蓮花多糖對DPPH自由基清除率逐漸升高,量效關系明顯。濃度在0.25～2.0 mg·mL-1范圍內金蓮花多糖對DPPH自由基的清除率趨于穩定,在72.43%～76.50%之間。與之相比,抗壞血酸對DPPH自由基的清除效果優于金蓮花多糖,當抗壞血酸濃度在0.06 mg·mL-1以上時其對DPPH自由基的清除率均高于96.10%。金蓮花多糖對DPPH自由基清除作用的50%抑制濃度IC50為0.161 mg·mL-1。饒娜等[15]對金蓮花多糖進行了梯度洗脫并制備了4個不同組分,而4個組分中僅有2個組分對DPPH自由基有清除作用,但清除效果并不高,在0.30 mg·mL-1時2個組分對DPPH自由基的清除率分別為35.5%和23.7%。

DPPH自由基清除實驗測定多糖抗氧化活性時,由于DPPH的溶劑體系為乙醇,且整個反應體系完成后乙醇濃度較高,此時容易產生絮狀沉淀(應為部分多糖醇沉析出),故在測定吸光值前應予以離心處理。但沉淀的產生是否影響結果的真實性仍有待研究,本研究認為DPPH自由基清除實驗是否適用于多糖類成分的體外抗氧化能力測定亦有待商榷。

2.3.2 金蓮花多糖對ABTS+自由基清除作用在0.008～0.50 mg·mL-1濃度范圍內金蓮花多糖對ABTS+自由基清除作用逐漸增強,且在0.50 mg·mL-1時最大清除率達到99.94%,此濃度下其對ABTS+自由基清除效果與抗壞血酸(清除率99.74%)相當。而抗壞血酸在0.008～0.125 mg·mL-1濃度范圍內對ABTS+自由基清除作用逐漸增強,且呈濃度相關性;在0.125 mg·mL-1以上時,其清除效果趨于穩定,對ABTS+自由基的清除率在99.74%～99.87%之間。金蓮花多糖對ABTS+自由基清除作用的IC50為0.079 mg·mL-1。

2.3.3 金蓮花多糖對羥基自由基清除作用在0.008～0.031 mg·mL-1濃度范圍內金蓮花多糖對羥基自由基的清除率隨著濃度的增加提升顯著,而在0.031～0.50 mg·mL-1濃度范圍內金蓮花多糖對羥基自由基的清除率隨著濃度的增加提升趨于平緩,但整體上呈劑量效應關系。在金蓮花多糖濃度為0.50 mg·mL-1時,其對羥基自由基的清除效果最強,清除率達到94.76%?？箟难嵩?.008～0.063 mg·mL-1濃度范圍內,其對羥基自由基的清除效果隨濃度提升增加顯著,在0.063 mg·mL-1之后,清除效果提升減緩,且在0.125 mg·mL-1以后,抗壞血酸對羥基自由基的清除率穩定在99.21%±0.23%左右。金蓮花多糖對羥基自由基清除作用的IC50為0.006 mg·mL-1。饒娜等[15]研究亦發現金蓮花多糖對羥基自由基的清除能力較強,在0.30 mg·mL-1時金蓮花多糖組分對羥基自由基的清除率可達到99.3%,該結果與本研究結果相似。

2.3.4 金蓮花多糖對超氧陰離子清除作用金蓮花多糖對超氧陰離子的清除效果相對較弱,在0.06～4.0 mg·mL-1濃度范圍內,金蓮花多糖對超氧陰離子的清除效果逐漸增強,且在4.0 mg·mL-1時,清除率為47.42%。與之相比,抗壞血酸對超氧陰離子的清除效果較強,在0.06～0.50 mg·mL-1濃度范圍內其對超氧陰離子的清除率逐漸增強,而當濃度在0.50～4.0 mg·mL-1時,抗壞血酸對超氧陰離子的清除率為99.48%±0.09%。金蓮花多糖對超氧陰離子清除作用的IC50為4.216 mg·mL-1。

2.3.5 金蓮花多糖總還原能力測定結果同一濃度下,OD值越大說明總還原能力越強。金蓮花多糖在0.06～4.0 mg·mL-1濃度范圍內,OD值由0.21逐漸提升至2.78,除在1.0～2.0 mg·mL-1濃度范圍內OD值提升較平緩外,在0.06～1.0 mg·mL-1和2.0～4.0 mg·mL-1濃度范圍內OD值與濃度均具有較好的量效關系。在4.0 mg·mL-1時,金蓮花多糖OD值達到2.78,與抗壞血酸相當(OD值為2.82)?？箟难嵩?.06～0.50 mg·mL-1濃度范圍內,OD值隨濃度增加而逐漸增加,呈劑量效應關系;而在0.50～4.0 mg·mL-1范圍內,OD值在2.72～2.82之間,差異無統計學意義。

3 結論

本研究通過正交試驗設計優化了金蓮花多糖的回流提取工藝,其最佳條件為料液比1∶25(m/V)、提取溫度80 ℃、提取時間2 h,在此條件下金蓮花多糖的提取率為1.350%±0.125%。然而,通過方差分析結果發現,本研究所選的3個單因素料液比、提取溫度和提取時間對提取率均無顯著性差異,其可能原因在于:①正交試驗研究中的因素水平是根據單因素試驗結果選擇的,考慮到生產實際中的應用可能性,故未進行各因素水平的延伸;②更多潛在影響金蓮花多糖提取率的因素應予以進一步研究,如提取次數、金蓮花藥材粉碎粒度大小等等。本研究所確立的最佳提取條件,提取率相對較高,可供參考。

通過IC50結果可知,金蓮花多糖對羥基自由基清除作用(0.006 mg·mL-1)>對ABTS+自由基的清除作用>(0.079 mg·mL-1)>對DPPH自由基的清除作用(0.161 mg·mL-1)>對超氧陰離子的清除作用(4.216 mg·mL-1)。由于各抗氧化實驗原理略有不同,各實驗間IC50值有所差異,但IC50均≤4.216 mg·mL-1,說明金蓮花多糖具有較強的抗氧化活性。尤其是對ABTS+自由基和羥基自由基的清除效果在4.0 mg·mL-1濃度時與抗壞血酸相當?？寡趸钚允撬幬锇l揮多種藥效的常見作用機制之一,由于以上幾種體外抗氧化活性實驗的檢測原理不同,其抗氧化能力的強弱也略有不同。但自由基的產生是導致機體氧化損傷的原因之一,且不同疾病的產生可能由不同的自由基誘導(如羥基自由基、超氧陰離子等),因此,本研究對金蓮花多糖的體外抗氧化實驗進行了多方位的檢測,以便為后續相關藥理作用研究提供數據參考。綜上,本研究結果提示金蓮花多糖是潛在的藥理活性成分之一,為金蓮花多糖的大量制備及開發利用提供了數據參考。