基于生物信息學篩選分析膿毒癥預后相關核心基因

汪 茜 龔 睿 龍剛宇 黃朝林 張定宇

膿毒癥是宿主對感染反應失調,導致危及生命的器官功能障礙綜合征,與高發生率和高死亡風險相關[1]。據統計,全球每年有近5000萬病例,其中超過25%～30%的患者死亡[2]。盡管目前關于膿毒癥的抗生素治療、液體復蘇及器官支持技術不斷改進,但其治療前景仍不理想[3]。因此,挖掘影響預后的相關基因并探討其指導臨床診療的意義仍是膿毒癥研究的熱點。

生物信息學方法已廣泛用于挖掘人類疾病進展的關鍵基因簇,對揭示疾病潛在的分子機制和臨床診治靶點具有重要意義[4]。膿毒癥的發病機制復雜,涉及炎性反應、免疫失衡、凝血功能障礙等多個方面,既往的單基因研究并不能全面的揭示膿毒癥復雜的病理生理學過程。因此,筆者從基因表達數據庫(Gene Expression Omnibus,GEO)中獲得膿毒癥生存與死亡患者外周血基因表達數據,通過WGCNA分析,預測與膿毒癥預后相關的關鍵基因,并進行基因本體(gene ontology, GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析、轉錄因子富集分析、免疫浸潤分析、生存分析等,旨在探索膿毒癥預后相關的潛在核心基因及分子生物學機制,為尋找潛在的預測標志物與治療靶點提供理論依據。

材料與方法

1．數據來源:通過在GEO數據庫中檢索關鍵詞“sepsis”,篩選符合本研究要求的膿毒癥患者基因表達數據集GSE54514、GSE65682、GSE5772,其注釋平臺分別為GPL6947、GPL13667、GPL4274。數據集GSE54514共有163例患者血液標本,其中納入分析127例,包含96例(75.6%)膿毒癥存活患者,31例(24.4%)死亡患者;數據集GSE65682中有膿毒癥患者血液樣本802例,符合納入標準479例,其中生存組365例(76.2%),死亡組114例(23.8%)。數據集GSE5772共有94個轉錄組數據,健康對照組23例(24.5%),膿毒癥組71例(75.5%),用于驗證疾病中存在顯著差異的核心基因。

2．WGCNA 和篩選關鍵基因:利用WGCNA-R包構建數據集GSE54514和GSE65682的基因共表達網絡,先篩選出方差前5000的基因用于后續分析?；诮茻o標度拓撲的標準,應用函數“sftMYMpowerEstimate”選擇合適的軟閾值,詳細流程為:(1)計算基因之間的Pearson相關系數。(2)通過α=|cor|β構建加權基因鄰接矩陣,其中α表示兩個基因之間的鄰近系數,cor表示兩個基因之間的Pearson相關系數,β為可設定的軟閾值。然后將加權鄰接矩陣轉化為拓撲重疊矩陣(topological overlap matrix,TOM)來估計網絡連接度,運用層次聚類的方法構建TOM的聚類樹結構,獲得不同的基因模塊。結合標本的臨床數據通過計算基因顯著性(gene significance, GS)與模塊成員(module membership, MM)識別與膿毒癥預后相關的模塊和基因。本研究選取數據集GSE54514與GSE65682中與預后相關性最高的兩個模塊的交集基因作為關鍵基因。

圖1 數據集GSE54514、GSE65682的WGCNA網絡構建

3．基因功能富集分析:使用Metascape數據庫對關鍵基因進行GO功能注釋和 KEGG通路富集分析。最小基因重疊數(min overlap)≥3 及P<0.01即視為差異有統計學意義的通路。

4．轉錄因子富集分析:使用R軟件中RcisTarget包構建分析,通過基因基序排名和轉錄因子的基序注釋,來識別富集的轉錄因子(transcription factor, TF)結合基序(binding motifs)和候選的TF,歸一化富集分數(normalized enrichment score, NES)≥3.0的基序被保留并被注釋到相應的 TF進行分析。

5．免疫浸潤分析:使用CIBERSORT算法對不同組患者的RNA測序數據進行分析,評估22種免疫浸潤細胞的相對比例。

6．統計學方法:采用R軟件對數據進行統計分析,使用Kaplan-Meier法構建生存曲線,采用Spearman相關性分析評價基因對免疫浸潤的影響。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1．構建WGCNA與篩選關鍵基因:通過R語言WGCNA包分析數據集GSE54514、GSE65682,基于無尺度網絡的標準,本研究分別選取β=5和β=12作為數據集GSE54514與GSE65682的軟閾值。然后通過動態樹切割算法在GSE54514和GSE65682中分別檢測到9個和12個基因模塊,其中GSE54514中的綠色模塊(cor= 0.61,P<0.01)和GSE65682中的棕色模塊(cor= 0.18,P<0.01)與膿毒癥的預后相關性最高(圖1中A、C)。將兩個模塊與膿毒癥的生存表型相關聯后,使用模塊成員(module members,MM)相對于膿毒癥生存特征的基因顯著性(gene significance,GS)做散點圖,可見GSE54514中的綠色模塊(cor= 0.42,P<0.01)與GSE65682中的棕色模塊(cor= 0.37,P<0.01)內GS和MM之間存在相關性(圖1中B、D),表明兩個模塊中的基因與膿毒癥預后相關。通過維恩圖繪制GSE54514的綠色模塊基因和GSE65682的棕色模塊基因的交集,篩選出20個關鍵基因(圖2)。

圖2 維恩圖

2.基因功能富集分析:對篩選得到的關鍵基因進行富集分析,設置條件為min overlap≥3及P<0.01,結果顯示,基因主要富集于細胞形態調節、單核細胞遷移等通路(圖3)。

圖3 關鍵基因的功能富集分析

3.轉錄因子富集分析:共表達基因受轉錄因子等機制的共同調節。因此對關鍵基因的轉錄因子進行富集分析,包括利用累計恢復曲線進行基序富集分析、motif-TF注釋以及重要基因的選擇。分析結果表明,轉錄因子ZNF148是基因集中的主要調控因子之一(NES=4.49),motif注釋為cisbp_M6552,其中LST1、CHD8等6個基因在此基序中富集。筆者對基因集中前10位的富集基序和相應的轉錄因子進行了展示(表1),使用RcisTarget包繪制了富集基序和相應基因的互作網絡(圖4)。

表1 前10位富集基序和相應的轉錄因子

圖4 關鍵基因與富集基序的互作網絡

4.篩選核心基因:為了進一步篩選核心基因,選取數據集GSE5772對20個關鍵基因進行表達差異分析。結果顯示,與健康對照組比較,基因FGD3、MBP、MSN、RNF130、SETD1B在膿毒癥患者中的表達顯著下調(圖5),這5個基因為與膿毒癥預后相關的潛在核心基因。

圖5 數據集GSE5772中關鍵基因的表達差異分析

根據NES值的大小,前10個基序在表1進行展示;/.該基序無相應的轉錄因子

5.免疫浸潤分析:首先對數據集GSE54514和GSE65682的數據進行合并,然后通過CIBERSORT算法評估膿毒癥生存組和死亡組中22種免疫浸潤細胞的差異。結果顯示,與生存組比較,死亡組中漿細胞、靜止記憶CD4+T細胞、M2巨噬細胞顯著升高;幼稚CD4+T細胞、調節T細胞(Tregs)、靜止樹突狀細胞顯著降低(圖6A,P<0.05)。通過分析核心基因與免疫浸潤細胞的相關性,發現5個核心基因與免疫細胞含量均有較強的相關性(圖6B)。

圖6 免疫浸潤分析

6.生存分析:為評估篩選出的5個核心基因與膿毒癥患者生存率的關系,使用Kaplan-Meier法對數據集GSE65682中基因差異表達的患者進行生存分析。結果顯示,膿毒癥患者中基因FGD3、MSN、RNF130高表達組的生存率高于低表達組(P<0.05),而MBP、SETD1B的表達水平與膿毒癥患者的生存率無關(圖7)。

圖7 5個核心基因的生存曲線

討 論

膿毒癥是一種危及生命的嚴重感染性疾病,是危重病患者中最常見的直接死因[5]。因此,若能早期識別膿毒癥可能的預后結局并采取更為精準的干預治療,將可能顯著降低膿毒癥的病死率。

本研究采用兩個不同的膿毒癥數據集進行WGCNA分析,從而獲得與膿毒癥預后相關性最高的“綠色”和“棕色”模塊。較單一的基因差異表達分析,WGCNA在很大程度上能更靈敏地識別具有生物意義的基因。隨后對兩個模塊的基因取交集進行維恩分析,篩選到20個關鍵基因。經GO和KEGG富集分析發現,這20個關鍵基因主要富集在細胞形態調節、單核細胞遷移等通路。

本研究通過轉錄因子富集分析表明,轉錄因子ZNF148可能是關鍵基因的主要調節因子之一。有研究證實,富集在此基序上的6個基因中LST1、EFHD2和ARID3A可以調節淋巴細胞的增殖、凋亡和分化。其中主要調節因子ZNF148已被證明是細胞凋亡的重要調控因子,并且ZNF148可通過靶向特定基因在T細胞發育過程中具有重要作用[6,7]。Essien等[8]研究發現,ZNF148fl/fl小鼠較野生型小鼠感染風險更高且表現出更低的生存率。目前認為免疫細胞的凋亡是膿毒癥免疫抑制的主要原因,并與繼發感染風險和不良結果相關[9]。但膿毒癥疾病變化過程中的淋巴細胞是否與ZNF148呈相關性還有待于進一步探索。

膿毒癥是由于機體對感染反應失調導致的一種異質性綜合征,個體之間具有不同的免疫狀態和生物過程,其中以炎癥過度激活和免疫抑制為特征的免疫失衡被認為是膿毒癥發展的關鍵環節[10]。研究表明,膿毒癥免疫功能紊亂與免疫細胞在不同階段的反應特征密切相關[11]。本研究通過數據集GSE5772對關鍵基因進行表達差異分析并識別到與膿毒癥預后顯著相關的5個潛在核心基因。免疫浸潤分析表明,這5個核心基因均與免疫細胞含量有較強的相關性,其中生存分析顯示,FGD3、MSN和RNF130可作為膿毒癥患者預后的重要預測指標,而且這些基因高表達的患者預后較好。

FGD3編碼的蛋白主要參與調節肌動蛋白細胞骨架和抑制細胞遷移等作用。根據基因圖譜中的數據,發現FGD3在T細胞、單核細胞等免疫反應細胞中高表達[12]。目前關于FGD3與膿毒癥的相關報道較少,但已發現FGD3可預測乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥的良好預后[13]。Moesin是MSN編碼的一種細胞骨架蛋白,在調節淋巴細胞激活和遷移及非特異性免疫等方面起到重要作用[14]。有研究表明,抑制moesin的表達可抑制脂多糖誘導的免疫細胞浸潤和炎性細胞因子釋放[15]。這與本研究中發現MSN在膿毒癥中明顯下調并與患者生存率顯著相關的結果一致。RNF130編碼的蛋白是一種E3泛素連接酶,屬于PA-TM-RING 家族,主要參與調節細胞凋亡和自身免疫[16]。Qin等[17]研究發現,RNF130在宮頸癌中低表達并可作為疾病預后的潛在生物學標志物,可能與鐵死亡和免疫細胞浸潤相關。然而目前針對其與膿毒癥的國內外研究較為少見。

本研究基于生物信息學分析,篩選出5個與膿毒癥預后相關的潛在核心基因,這5個核心基因與免疫細胞密切相關。其中FGD3、MSN和RNF130具有作為膿毒癥預后指標的潛力,可進一步為臨床診療和藥物開發等醫學轉化方面提供新舉措。